Эффективность противотуберкулезных прививок БЦЖ. Вакцина противотуберкулезная

Противотуберкулезная вакцинация | Туберкулез

Противотуберкулезная вакцинация

Одной из главных профилактических задач диспансера является противотуберкулезная вакцинация. Вакцинация производится вакциной БЦЖ.

БЦЖ (бациллы Кальметта — Герена) представляет собой аттенуированный штамм микобактерий туберкулеза. Кальметт и Герен пришли к выводу, что выраженная резистентность к заражению туберкулезом может быть достигнута искусственно только путем прививок вакциной из живых, но апатогенных, с резко ослабленной вирулентностью туберкулезных бацилл. Для ослабления патогенности и вирулентности штамма туберкулезных бацилл бычьего типа Кальметт и Герен выращивали их в течение 13 лет на картофеле с бычьей желчью. Пересевы культуры производили каждые 2 нед (всего 230 пассажей на этой среде). Культура бацилл Кальметта — Герена была затем испытана на животных. Опыты показали, что штамм потерял патогенность и вирулентность для рогатого скота, морских свинок, кроликов и обезьян. Заражение лабораторных животных различными способами и разными дозами этой культуры показало стойкую апатогенность и слабую вирулентность измененного штамма, который был назван БЦЖ. Опыты также показали наличие у штамма БЦЖ выраженных иммуногенных свойств.

В 1921 г. вакцина из культур этого штамма впервые была применена для прививки новорожденному ребенку. Затем были вакцинированы (до 1924 г.) более 300 новорожденных, исключительно от больных туберкулезом матерей. Со второй половины 1924 г. во Франции стали более широко применять вакцинацию новорожденных. В результате многочисленных проверочных работ микробиологов разных стран были подтверждены стойкая наследственная апатогенность и ослабленная вирулентность БЦЖ и безвредность этого штамма для практической вакцинации. Было установлено, что БЦЖ вызывает в организме животных образование специфической гранулемы, которая в дальнейшем рассасывается. Микобактерии штамма БЦЖ удовлетворяют требованиям, предъявляемым к вакцинному туберкулезному штамму: они безвредны, специфичны, аллергогенны и иммуногенны. В организме человека и животного они находятся преимущественно в лимфатической системе, где размножаются и вызывают специфическую тканевую реакцию. Будучи введены человеку или животным, они вызывают аллергическую перестройку организма, формируют иммунитет и создают резистентность по отношению к возбудителю туберкулеза.

Искусственный иммунитет, приобретенный организмом в результате вакцинации БЦЖ, со временем ослабевает, и поэтому имеется необходимость в периодической ревакцинации.

Противотуберкулезная вакцинация в СССР применяется с 1925 г. Вакцина БЦЖ в Советском Союзе после изучения ее свойств и проверки безвредности и иммуногенности в экспериментальных условиях была азедена детям, родившимся от больных туберкулезом родителей, т. е. подвергавшихся опасности заражения туберкулезом в раннем периоде жизни. Наблюдения над вакцинированными детьми показали, что вакцина безвредна и эффективна, т. е. иммуногенна. Заболеваемость и смертность от туберкулеза среди вакцинированных оказались в несколько раз меньше, чем среди невакцини-рованных.

В дальнейшем контингента вакцинируемых постепенно расширялись. С 1947 г. вакцинация БЦЖ стала обязательной в родильных домах ряда городов, а с 1949 г. — во всех городских родильных домах и в родильных отделениях многих сельских больниц. С 1953 г. в СССР вакцинация проводится как обязательное мероприятие во всех городских и сельских родильных домах и родильных отделениях больниц, а также для родившихся дома. Обязательна также ревакцинация не инфицированных туберкулезом детей, подростков, учащихся техникумов и студентов, а также взрослых до 30 лет, находящихся в контакте с больными туберкулезом и работающих в лечебно-профилактических учреждениях.

Созданная Кальметтом и Гереном жидкая вакцина могла сохраняться короткий срок — 2 нед, что являлось препятствием для широкого распространения. В 1953 г. в СССР создана сухая вакцина со сроком годности 9 мес, которую легко хранить и транспортировать.

С 1962 г. в Советском Союзе вакцинация проводится вну-трикожным методом, который является наиболее эффективным в смысле выраженности и длительности иммунитета. Для новорожденных, детей, подростков и взрослых рекомендуется единая доза—0,05 мг вакцины в 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Вакцина выпускается в ампулах, содержащих 1 мг сухой вакцины БЦЖ, что составляет 20 доз по 0,05 мг вакцины. Она имеет вид белого аморфного порошка, в котором сохранено до 4—5% остаточной влаги. В 1 мг сухой вакцины содержится около 8 млн. живых бактерий.

Перед употреблением вакцина разводится в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия, поэтому к каждой ампуле сухой вакцины БЦЖ прилагается ампула с раствором.

Вакцина должна храниться в темноте при температуре не выше 8°С. Срок годности глутаминовой вакцины БЦЖ — 9 мес со дня ее изготовления.

Непригодна к употреблению вакцина с истекшим сроком годности, а также вакцина, содержащая после разведения неразвивающиеся хлопья или посторонние примеси, без этикетки на ампуле или с неправильно заполненной этикеткой, при наличии даже незначительных трещин в стекле ампулы.

Вакцинация внутрикожным методом производится на 5—7-й день жизни всем здоровым детям, родившимся как в учреждениях родовспоможения, так и на дому, и недоношенным с хорошим общим состоянием и массой тела при рождении не менее 2 кг.

Детей, которым по каким-либо причинам не была проведена вакцинация в первые дни жизни, вакцинируют в течение первых 2 мес в детской поликлинике или другом лечебно-профилактическом учреждении без предварительной туберкулинодиагностики.

Если ребенок не привит на протяжении первых 2 мес жизни, то последующая вакцинация БЦЖ производится после предварительной проверки чувствительности к туберкулину. Для этого ставится проба Манту в разведении 1:2000 (5 ТЕ). Результаты реакции Манту учитываются через 72 ч. При отрицательном результате или наличии папулы до 4 мм в диаметре ребенок должен подвергаться внутрикожной вакцинации БЦЖ.

Детей, поступающих из учреждений родовспоможения в условия контакта (семейного, комнатного, квартирного) с больными открытой формой туберкулеза, следует изолировать на время выработки иммунитета, т. е. на срок не менее 6 нед после вакцинации.

Противопоказаниями к проведению вакцинации новорожденных БЦЖ внутрикожным методом являются: клинические симптомы родовой травмы, повышение температуры тела (свыше 37,5°С), диспепсические расстройства и заболевания, влияющие на общее состояние ребенка (пиодермия, пузырчатка, кожные абсцессы, флегмоны, ринофарингит, отит, грипп, воспаление легких, резко выраженная желтуха, тяжелые аллергические реакции). При выздоровлении дети должны быть вакцинированы не раньше чем через 2 мес.

При разведении сухой вакцины БЦЖ и проведении вну-трикожной вакцинации необходимо строгое соблюдение правил асептики и антисептики.

Для получения дозы 0,05 мг сухую вакцину БЦЖ нужно развести в 2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Прививочная доза 0,05 мг вакцины БЦЖ содержится в 0,1 мл разведенной вакцины. Разведенная вакцина имеет вид слегка опалесцирующей жидкости. Она должна применяться тотчас же после разведения и лишь при строгом соблюдении стерильности и защите от света может быть использована в течение первых 2—3 ч. Неиспользованная в указанный срок вакцина уничтожается.

Вакцину БЦЖ вводят внутрикожно в области наружной поверхности верхней трети левого плеча после предварительной обработки кожи 70% спиртом.

Внутрикожное введение вакцины БЦЖ производится следующим образом. Предварительно перемешав с помощью шприца разведенную вакцину БЦЖ, набирают стерильным туберкулиновым или однограммовым шприцем 1 мл раствора вакцины, после чего выпускают каплю его через иглу. Тонкую иглу с коротким косым срезом вкалывают строго внутрикожно, как это делается при производстве реакции Манту. При этом срез иглы должен быть обращен кверху. После того как отверстие иглы скроется в коже, производят пальцем давление на поршень шприца и вводят внутрикожно точно 0,1 мл раствора вакцины БЦЖ. Введение большего количества не допускается. При правильной технике введения в коже образуется папула беловатого цвета, диаметр которой равен примерно 5—6 мм. Образующаяся после введения вакцины папула обычно рассасывается через 10—15 мин. После введения вакцины запрещается обработка места укола дезинфицирующими веществами, а также наложение повязки. Каждого новорожденного вакцинируют индивидуальной стерильной иглой.

Введение вакцины должно производиться строго внутрикожно.

На месте введения вакцины через 2—3 нед после вакцинации развивается инфильтрат 5—8 мм в диаметре с небольшим узелком в центре, а иногда с образованием корочки. Обратное развитие инфильтратов происходит в течение 3—5 мес, а у части детей — ив более длительные сроки, после чего на этом месте остается едва заметный рубчик.

Наблюдение за вакцинированными детьми проводится участковыми врачами-педиатрами. При этом периодически, начиная с месячного возраста, проверяют местную прививочную реакцию с соответствующей регистрацией в истории развития ребенка характера и размера в миллиметрах местной реакции (инфильтрат, папула, пустула с образованием корочки, с отделяемым или без него, рубчик, пигментация и т.д.) и ее динамика, а также состояния регионарных (подмышечных) лимфатических узлов.

Врачи родильного дома (отделения) должны предупредить мать, что у ребенка появится местная прививочная реакция и что при этом ребенка необходимо показать участковому педиатру.

Контроль за динамикой развития прививочных реакций преследует цель своевременного выявления осложненных реакций и применения профилактических мероприятий. Осложнениями считаются длительно незаживающие изъязвления кожи более 10 мм в диаметре, холодные абсцессы, а также воспалительные изменения регионарных лимфатических узлов с увеличением их до размеров лесного ореха и более.

При пониженной общей реактивности в месте инокуляции вакцины может появляться долго не заживающая язва с неровными, подрытыми краями синюшно-красного цвета. В этих случаях рекомендуются применение присыпок из специфических препаратов (изониазид, ПАСК, стрептомицин), общеукрепляющая терапия.

Послевакцинальная аллергия отмечается в течение длительного срока. Через 2 года она определяется примерно у 85% вакцинированных внутрикожно детей и только у 25— 30% вакцинированных энтеральным методом. Следовательно, иммунитет сохраняется более длительно, и сроки ревакцинации могут быть увеличены до 5—7 лет. По ряду условий, возможно, будет необходимо применять и другие методы вакцинации и ревакцинации (энтеральный и накожный).

Вакцинация новорожденных путем энтерального введения вакцины БЦЖ может проводиться на 3-й, 5-й, 7-й день (или 4-й, 6-й, 8-й), когда у ребенка уже устанавливается акт сосания. Однократная доза вакцины содержит 10 мг живых микобактерий БЦЖ. При разведении сухой вакцины и при вакцинации необходимо строго соблюдать правила асептики. Разводят сухую вакцину свежекипяченой водой из расчета 2 мл воды на одну дозу вакцины. Вакцину следует применять немедленно по разведении. Разведенную водой и дополнительно разбавленную 3—5 мл стерильного грудного молока вакцину дают ребенку только с ложечки (а не каким-либо другим способом) маленькими порциями за полчаса до кормления. Противопоказания к вакцинации энтеральным методом те же, что и при внутрикожном методе.

Иммунитет после вакцинации наступает через 6—8 нед. На этот срок необходима изоляция вакцинированных детей, имеющих контакт с больными открытыми формами туберкулеза.

Длительность иммунитета, вызванного вакциной БЦЖ при энтеральном ее введении, 3—4 года, но через 2—3 года напряженность иммунитета несколько ослабевает и необходимо проводить ревакцинацию.

Ревакцинация. Проводят клинически здоровым лицам, у которых туберкулиновая проба Манту с 2 ТЕ очищенного туберкулина дала отрицательный результат.

Лица, перенесшие туберкулез или заведомо инфицированные туберкулезом, не подлежат ревакцинации и не должны обследоваться с целью отбора для ревакцинации против туберкулеза.

Противопоказаниями к ревакцинации внутрикожным методом являются: кожные заболевания, острые и хронические инфекционные заболевания, включая период реконвалесценции (не менее 2 мес после исчезновения всех клинических симптомов), аллергические заболевания (ревматизм в острой и подострой фазах, бронхиальная астма, пищевые и другие идиосинкразии).

Противопоказаниями к внутрикожному методу вакцинации у детей раннего возраста являются также диспепсические расстройства, гипертрофия II и III степени, спазмофилия, экссудативный диатез с наличием кожных проявлений, эпилепсия.

Другие профилактические прививки можно производить не менее чем за 2 мес до внутрикожной вакцинации БЦЖ и через 2—3 мес после ее проведения, кроме прививок против полиомиелита и против бешенства (в случае укуса бешеной собакой), которые могут по специальным распоряжениям органов здравоохранения проводиться в любые сроки.

Вакцинация против оспы по эпидемиологическим показаниям может быть произведена на другой руке одновременно с ревакцинацией БЦЖ или через короткий срок после нее.

При ревакцинации внутрикожным методом местные реакции уже могут появиться на 1-й неделе после прививки или несколько позже (через 3—4 нед). Местная прививочная реакция обычно проявляется в виде небольшого инфильтрата (4—10 мм в диаметре) с маленьким узелком в центре. В ряде случаев отмечается пустуляция с образованием корочек по типу оспенных. Иногда в центре инфильтрата появляется небольшой некроз с незначительным серозно-гнойным отделяемым.

Такие местные реакции, считающиеся нормальными, подвергаются обратному развитию в течение 3—4 мес.

Противотуберкулезная ревакцинация внутрикожным методом осуществляется под руководством противотуберкулезного диспансера в общих лечебно-профилактических учреждениях: детских поликлиниках; поликлинических отделениях детских больниц, поликлинических отделениях общих больниц, поликлиниках и амбулаториях.

Ревакцинация внутрикожным методом детей, подростков и взрослых производится специально подготовленными медицинскими сестрами. Сроки ревакцинации: лицам, вакцинированным при рождении внутрикожным методом, ревакцинация (при отрицательной пробе Манту) производится в возрасте 7 лет, вторая ревакцинация — в 12 лет, третья — в 17 лет, последующие — через 5—7 лет до 30-летнего возраста. Лица, вакцинированные при рождении энтеральным методом, подвергаются ревакцинации в возрасте 2, 7, 10—11, 13—14 и 16—17 лет (при отрицательной пробе Манту).

Контроль за выполнением плана противотуберкулезных прививок осуществляется санитарно-эпидемиологическими станциями, у которых должен быть общий план противотуберкулезных прививок по району, городу, области.

tuberkulez.org

Вакцина туберкулезная для щадящей первичной иммунизации (БЦЖ-М) - инструкция по применению, дозы, побочные действия, противопоказания

Вакцину БЦЖ-М применяют внутрикожно в дозе 0,025 мг в 0,1 мл прилагаемого растворителя (раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций).

Вакциной БЦЖ-М прививают:

1. В родильных домах всех здоровых новорожденных на 3-7 день жизни накануне или в день выписки из роддома на территориях с показателем заболеваемости туберкулезом не выше 80 на 100 000 населения;

2. В родильных домах недоношенных новорожденных с массой тела 2000 и более граммов, при восстановлении первоначальной массы тела, накануне или в день выписки из роддома.

3. В отделениях выхаживания недоношенных новорожденных лечебных стационаров (2-ой этап выхаживания) - детей с массой тела 2300 г и более перед выпиской из стационара.

4. В детских поликлиниках детей, не получивших противотуберкулезную прививку в роддоме по медицинским противопоказаниям и подлежащих вакцинации в связи со снятием противопоказаний.

Детей, которым не была проведена вакцинация в первые дни жизни, вакцинируют в течение первых двух месяцев в детской поликлинике или другом лечебно-профилактическом учреждении без предварительной туберкулинодиагностики.

Детям в возрасте 2 мес и старше перед вакцинацией ставят пробу Манту с 2 ТЕ очищенного туберкулина в стандартном разведении и вакцинируют только туберкулинотрицательных. Реакция считается отрицательной при полном отсутствии инфильтрата (гиперемии) или наличии уколочной реакции (1,0 мм). Интервал между постановкой пробы Манту и вакцинацией должен быть не менее 3 дней и не более 2 недель.

Прививки должен проводить специально обученный и имеющий сертификат медицинский персонал родильных домов (отделений), отделений выхаживания недоношенных, детских поликлиник или фельдшерско-акушерских пунктов. Вакцинацию новорожденных проводят в утренние часы в специально отведенной комнате после осмотра детей педиатром. В поликлиниках отбор детей на вакцинацию предварительно проводит врач (фельдшер) с обязательной термометрией в день прививки, учетом медицинских противопоказаний и данных анамнеза. При необходимости проводят консультацию с врачами-специалистами, исследование крови и мочи. Во избежание контаминации живыми микобактериями БЦЖ недопустимо совмещение в один день прививки против туберкулеза с другими парентеральными манипуляциями.

Факт выполнения вакцинации регистрируют в установленных учетных формах с указанием даты прививки, названия вакцины, предприятия- производителя, номера серии и срока годности препарата.

Для вакцинации применяют одноразовые стерильные туберкулиновые шприцы вместимостью 1 мл с тонкими короткими иглами с коротким срезом. Для внесения в ампулу с вакциной растворителя используют одноразовый стерильный шприц вместимостью 2 мл с длинной иглой. Запрещается применять шприцы и иглы с истекшим сроком годности и инсулиновые шприцы, у которых отсутствует градуировка в мл. Запрещается проводить прививку безыгольным инъектором. После каждой инъекции шприц с иглой и ватные тампоны замачивают в дезинфицирующем растворе (5% растворе хлорамина или 3% растворе перекиси водорода), а затем централизованно уничтожают. Запрещается применение для других целей инструментов, предназначенных для проведения прививок против туберкулеза. Вакцину хранят в холодильнике (под замком) в комнате для прививок. Лица, не имеющие отношения к вакцинации БЦЖ, в прививочную комнату не допускаются. В день вакцинации БЦЖ в прививочном кабинете поликлиники запрещается проводить другие профилактические прививки.

Ампулы с вакциной перед вскрытием тщательно просматривают.

Препарат не подлежит применению при:

- отсутствии маркировки на ампуле или неправильном ее заполнении;

- истекшем сроке годности;

- наличии трещин и насечек на. ампуле;

- изменении физических свойств препарата (изменение цвета и т.д.).

Вакцину растворяют непосредственно перед употреблением стерильным раствором натрия хлорида 0,9% для инъекций, приложенным к вакцине. Растворитель должен быть прозрачным, бесцветным и не иметь посторонних включений.

Шейку и головку ампулы обтирают спиртом. Вакцина запаяна под вакуумом, поэтому сначала надпиливают и осторожно, с помощью пинцета, отламывают место запайки. Затем надпиливают и отламывают шейку ампулы, завернув надпиленный конец в стерильную марлевую салфетку.

Для получения дозы 0,025 мг БЦЖ-М в 0,1 мл в ампулу с вакциной переносят стерильным шприцем 2 мл раствора натрия хлорида 0,9 % для инъекций. Вакцина должна раствориться в течение 1 мин. Допускается наличие хлопьев, которые должны разбиваться при 3-4-кратном перемешивании с помощью шприца (не допускается попадание воздуха в шприц). Растворенная вакцина должна иметь вид грубодисперсной суспензии белого с сероватым оттенком цвета. При наличии в разведенном препарате крупных хлопьев, которые не разбиваются при 3-4-кратном перемешивании с помощью шприца, или осадка эту ампулу с вакциной уничтожают, не используя.

Разведенную вакцину необходимо предохранять от действия солнечного и дневного света (например, цилиндром из черной бумаги). Разведенная вакцина пригодна к применению не более 1 часа после разведения при хранении в асептических условиях, при температуре от 2 до 8 °С. Обязательно ведение протокола с указанием времени разведения препарата и уничтожения ампулы с вакциной. Неиспользованную разведенную вакцину уничтожают кипячением в течение 30 мин, автоклавированием при 126 °С 30 мин или погружением вскрытых ампул в дезинфицирующий раствор (5 % раствор хлорамина или 3% раствор перекиси водорода) на 60 мин.

Для одной прививки туберкулиновым шприцем набирают 0,2 мл (2 дозы) разведенной вакцины, затем выпускают через иглу в стерильный ватный тампон примерно 0,1 мл вакцины для того, чтобы вытеснить воздух и подвести поршень шприца под нужную градуировку - 0,1 мл. Перед каждым набором вакцину следует аккуратно перемешивать 2-3 раза с помощью шприца. Одним шприцем вакцина может быть введена только одному ребенку.

Вакцину БЦЖ-М вводят строго внутрикожно на границе верхней и средней трети наружной поверхности левого плеча после предварительной обработки кожи 70° спиртом. Иглу вводят срезом вверх в поверхностный слой натянутой кожи. Сначала вводят незначительное количество вакцины, чтобы убедиться, что игла вошла точно внутрикожно, а затем всю дозу препарата (всего 0,1 мл). При правильной технике введения должна образоваться папула беловатого цвета диаметром 7-9 мм, исчезающая обычно через 15-20 мин.

РЕАКЦИЯ НА ВВЕДЕНИЕ

В норме у вакцинированных на месте внутрикожного введения вакцины БЦЖ-М через 4-6 недель последовательно развивается местная специфическая реакция в виде инфильтрата, папулы, пустулы, язвы размером 5-10 мм в диаметре. Реакция подвергается обратному развитию в течение 2-3 мес, иногда и в более длительные сроки. Место реакции следует предохранять от механического раздражения, особенно во время водных процедур.

У 90-95% вакцинированных на месте прививки формируется поверхностный рубчик до 10 мм.

Меры предосторожности

Введение препарата под кожу недопустимо, так как при этом образуется холодный абсцесс.

Запрещается наложение повязки и обработка йодом и другими дезинфицирующими растворами места введения вакцины во время развития местной прививочной реакции: инфильтрата, папулы, пустулы, язвы, о чем следует обязательно предупредить родителей ребенка.

Более полная информация о проведении вакцинопрофилактики туберкулеза представлена в Приказе Минздрава России № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" от 21 марта 2003 г.

www.lsgeotar.ru

Вакцина туберкулезная (БЦЖ) - инструкция по применению, дозы, побочные действия, противопоказания

Вакцину БЦЖ применяют внутрикожно в дозе 0,05 мг в 0,1 мл прилагаемого растворителя (раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций).

Вакцинацию осуществляют здоровым новорожденным детям на 3-7 день жизни (как правило, в день выписки из родильного дома) на территориях с показателем заболеваемости туберкулезом свыше 80 на 100 000 населения. При более низком показателе заболеваемости туберкулезом, вакцинацию населения проводят препаратом БЦЖ-М.

Дети, не привитые в период новорожденности, получают после выздоровления вакцину БШК-М. Детям в возрасте 2 мес и старше предварительно проводят пробу Манту с 2 ТЕ очищенного туберкулина в стандартном разведении и вакцинируют только туберкулинотрицательных.

Ревакцинации подлежат дети в возрасте 7 и 14 лет, имеющие отрицательную реакцию на пробу Манту с 2 ТЕ ППД-Л. Реакция Манту считается отрицательной при полном отсутствии инфильтрата, гиперемии или при наличии укол очной реакции (1 мм). Инфицированные микобактериями туберкулеза дети, имеющие отрицательную реакцию на пробу Манту, ревакцинации не подлежат. Интервал между постановкой пробы Манту и ревакцинацией должен быть не менее 3 дней и не более 2 недель.

Прививки должен проводить специально обученный и имеющий сертификат медицинский персонал родильных домов (отделений), отделений выхаживания недоношенных, детских поликлиник или фельдшерско-акушерских пунктов. Вакцинацию новорожденных проводят в утренние часы в специально отведенной комнате после осмотра детей педиатром. В поликлиниках отбор детей на вакцинацию предварительно проводит врач (фельдшер) с обязательной термометрией в день прививки, учетом медицинских противопоказаний и данных анамнеза. При необходимости проводят консультацию с врачами-специалистами, исследование крови и мочи. При проведении ревакцинации в школе должны соблюдаться все вышеперечисленные требования. Во избежание контаминации живыми микобактериями БЦЖ недопустимо совмещение в один день прививки против туберкулеза с другими парентеральными манипуляциями.

Факт выполнения вакцинации (ревакцинации) регистрируют в установленных учетных формах с указанием даты прививки, названия вакцины, предприятия-производителя, номера серии, и срока годности препарата.

Для вакцинации (ревакцинации) применяют одноразовые стерильные туберкулиновые шприцы вместимостью 1 мл с тонкими короткими иглами с коротким срезом. Для внесения в ампулу с вакциной растворителя используют одноразовый стерильный шприц вместимостью 2 мл с длинной иглой. Запрещается применять шприцы и иглы с истекшим сроком годности и инсулиновые шприцы, у которых отсутствует градуировка в мл. Запрещается проводить прививку безыгольным инъектором. После каждой инъекции шприц с иглой и ватные тампоны замачивают в дезинфицирующем растворе (5% растворе хлорамина или 3% растворе перекиси водорода), а затем централизованно уничтожают. Запрещается применение для других целей инструментов, предназначенных для проведения прививок против туберкулеза. Вакцину хранят в холодильнике (под замком) в кабинете для прививок. Лица, не имеющие отношения к вакцинации БЦЖ, в помещение, где проводятся прививки (родильный дом) и в прививочный кабинет (поликлиника), в день прививок не допускаются. В день вакцинации (ревакцинации) БЦЖ в прививочном кабинете (комнате) запрещается проводить другие профилактические прививки.

Ампулы с вакциной перед вскрытием тщательно просматривают.

Препарат не подлежит применению при:

- отсутствии маркировки на ампуле или неправильном ее заполнении;

- истекшем сроке годности;

- наличии трещин и насечек на ампуле;

- изменении физических свойств препарата (изменение цвета, сморщенная таблетка и т.д.).

Вакцину растворяют непосредственно перед употреблением стерильным раствором натрия хлорида 0,9% для инъекций, приложенным к вакцине. Растворитель должен быть прозрачным, бесцветным и не иметь посторонних включений.

Вакцина герметизирована под вакуумом: Шейку и головку ампулы обтирают спиртом. Сначала надпиливают и осторожно, с помощью пинцета, отламывают место запайки. Затем надпиливают и отламывают шейку ампулы, завернув надпиленный конец в стерильную марлевую салфетку.

Вакцина герметизирована под инертным газом: Шейку и головку ампулы обтирают спиртом. Отламывают шейку ампулы по кольцу или точке надлома, завернув головку в стерильную марлевую салфетку.

Для получения дозы 0,05 мг БЦЖ в 0,1 мл в ампулу, содержащую 20 доз вакцины, переносят стерильным шприцем 2 мл раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций, а в ампулу, содержащую 10 доз вакцины - 1 мл раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций. Вакцина должна раствориться в течение 1 мин. Допускается наличие хлопьев, которые должны разбиваться при 3-4-кратном перемешивании с помощью шприца (не допускается попадание воздуха в шприц). Растворенная вакцина должна иметь вид грубодисперсной суспензии белого с сероватым оттенком цвета. При наличии в разведенном препарате крупных хлопьев, которые не разбиваются при 3-4-кратном перемешивании с помощью шприца, или осадка эту ампулу с вакциной уничтожают, не используя.

Разведенную вакцину необходимо предохранять от действия солнечного и дневного света (например, цилиндром из черной бумаги). Разведенная вакцина пригодна к применению не более 1 часа после разведения при хранении в асептических условиях, при температуре от 2 до 8 °С. Обязательно ведение протокола с указанием времени разведения препарата и уничтожения ампулы с вакциной. Неиспользованную вакцину уничтожают кипячением в течение 30 мин, автоклавированием при 126 °С 30 мин или погружением вскрытых ампул в дезинфицирующий раствор (5 % раствор хлорамина или 3% раствор перекиси водорода) на 60 мин.

Для каждой прививки в туберкулиновый шприц набирают 0,2 мл (2 дозы) разведенной вакцины, затем выпускают через иглу в стерильный ватный тампон примерно 0,1 мл вакцины для того, чтобы вытеснить воздух и подвести поршень шприца под нужную градуировку - 0,1 мл. Перед каждым набором вакцину следует аккуратно перемешивать 2-3 раза с помощью шприца. Одним шприцем вакцина может быть введена только одному ребенку.

Вакцину БЦЖ вводят строго внутрикожно на границе верхней и средней трети наружной поверхности левого плеча после предварительной обработки кожи 70° спиртом. Иглу вводят срезом вверх в поверхностный слой натянутой кожи. Сначала вводят незначительное количество вакцины, чтобы убедиться, что игла вошла точно внутрикожно, а затем всю дозу препарата (всего 0,1 мл). При правильной технике введения должна образоваться папула беловатого цвета диаметром 7-9 мм, исчезающая обычно в течение 15-20 мин.

РЕАКЦИЯ НА ВВЕДЕНИЕ

В норме у вакцинированных на месте внутрикожного введения вакцины БЦЖ через 4-6 недель последовательно развивается местная специфическая реакция в виде инфильтрата, папулы, пустулы, язвы размером 5-10 мм в диаметре. Реакция подвергается обратному развитию в течение 2-3 мес, иногда и в более длительные сроки. У ревакцинированных местная реакция развивается через 1-2 недели. Место реакции следует предохранять от механического раздражения, особенно во время водных процедур.

У 90-95% вакцинированных на месте прививки формируется поверхностный рубчик размером до 10 мм.

www.lsgeotar.ru

Прививка от туберкулеза взрослым, ревакцинация, защиает ли БЦЖ

Когда делается первая прививка от туберкулеза? В окружающей среде находится значительное количество микобактерий туберкулеза. Они не всегда могут привести к развитию заболевания, ведь для его начала необходим толчок (неблагоприятные условия проживания, недостаточное питание).

Для повышения устойчивости организма к туберкулезу применяют вакцинацию, но при ее осуществлении очень часто возникает вопрос, почему именно вакцину от туберкулеза называют БЦЖ, ведь такое название не связано с тем, как называется болезнь или бацилла, которая является возбудителем заболевания. Альберт Кальметт Тажани и Мари Камиль Герен являются ее первооткрывателями, перевод их имен на латынь дают в результате название БЦЖ.

Необходимость проведения процедуры

А сейчас выясним, для чего проводится вакцинация против туберкулеза. Прививка необходима для того чтобы защитить человека от инфицирования. Конечно, она не может предоставить полной защиты, но позволяет при столкновении с болезнью облегчить ее течение. Поскольку у детей до достижения пятилетнего возраста иммунная система недостаточно сформирована и по-особому реагирует на заболевание. В результате этого можно наблюдать возникновения менингита или генерализованной формы туберкулеза, имеющей тяжелые симптомы и очень часто приводящей к летальному исходу. Чтобы облегчить данные симптомы у ребенка проводится обязательная иммунизация в первые дни после рождения.

У родителей часто возникает мысль, а нужно ли проводить вакцинацию.

Применение иммунизации в ранние сроки необходимо потому, что в стране распространенность туберкулеза находится на высоком уровне. В последующем времени вакцинация дает возможность маленькому организму бороться с микобактериями, попадающими в организм и нейтрализовать их. Нужно понимать, что заболеть можно не только при контакте с больным лицом или проживании в асоциальных условиях. Вследствие высокого уровня распространенности инфицирование может произойти от носителя (не страдающего открытой формой туберкулеза) ведь именно эти люди считаются скрытым очагом инфекции. Ведь главным путем распространения заболевания является передача МБТ именно носителем.

Противотуберкулезная вакцина защищает организм на протяжении 15-20 лет от заражения туберкулезом, после истечения данного термина эта способность практически исчезает и не подлежит восстановлению путем введения следующей дозы. К сожалению, прививка от туберкулеза предотвращает смертельно опасное заболевание, но не дает возможности значительно уменьшить количество больных и скорость, с которой передается инфекция.

Кому проводится вакцинация

На сегодняшний день по данным ВОЗ прививки необходимо проводить:

1. Детям, не достигшим годовалого возраста, проживающим или которые будут проживать в неблагополучных условиях с высоким уровнем распространенности заболевания.
2. Детям до семи лет, находящихся в областях с незначительным распространением туберкулеза, но проживающих в неблагоприятных жилищных условиях.
3. Всем лицам, имеющим близкий контакт с больным человеком на туберкулез, который не реагирует на разнообразное проводимое лечение.

Значительное количество новоиспеченных родителей думают, что ребенок после рождения имеет узкий круг контактов и поэтому не может встретиться с микобактериями.

Но, к сожалению, это не так, ведь большая часть населения России считается носителями микобактерий, и могут инфицировать людей, которые их окружают.

СЕНСАЦИЯ ! Перейди по ссылке:

Проведение прививок происходит двумя вакцинами:

Вакцина БЦЖ применяется здоровым и доношенным новорожденным. В случае если ребенок рождается недоношенным или с низкой массой тела, тогда вакцинация осуществляется препаратом БЦЖ-М, который вмещает в себя меньшее количество микроорганизмов (почти наполовину) по сравнению с БЦЖ. Вводят БЦЖ-М также детям, страдающим анемией. Обусловлено это тем, что ослабленный организм ребенка не имеет сил в полной мере бороться с количеством введенных антигенов.

Усовершенствованный процесс иммунизации

Когда ребенок перед выпиской домой не был вакцинирован, постановку прививки нужно провести сразу, когда только появилась на то возможность, и будут отсутствовать любые противопоказания.

Согласно утвержденному плану прививок, осуществляется и ревакцинация вакциной БЦЖ детям в 7 и 14 лет.

Но только в случае отсутствия положительной пробы Манту. Проведение прививки осуществляется по той же схеме, подкожно в плечо. После проведения, как и у новорожденных через определенный промежуток времени происходит формирование рубца, после этого ребенок считается ревакцинированным.

Прививка от туберкулеза взрослым лицам проводится в случае отрицательной пробы Манту до 30 лет. Но условием осуществления является отсутствие инфицирования и перенесенного заболевания. Согласно плану проведения прививок, она должна осуществляться в 23 и 29 лет. Перед постановкой прививки необходимо осуществить пробу Манту, ввести 2 ТЕ и понаблюдать за реакцией через трое суток. Именно в это время (в случае отрицательной пробы) можно проводить иммунизацию, но не позднее чем через четырнадцать дней после постановки.

Кроме всех указанных особенностей проведения, взрослые должны подлежать тщательному осмотру и выяснению противопоказаний.

Противопоказаниями для них могут быть:

• положительная или сомнительная проба Манту или ее вираж;
• перенесенный туберкулез;
• наличие аллергических реакций;
• нарушение работы ЦНС;
• инсульт;
• энцефалит;
• порок сердца;
• заболевания сердечно-сосудистой системы;
• расстройства функционирования эндокринных органов;
• злокачественные новообразования;
• осложнения после первого БЦЖ.

Механизм проведения инъекции

Общепризнанным  местом введения считают плечо, а именно участок, расположенный на границе верхней и средней трети. Введение препарата должно осуществляться только подкожно, запрещено вводить внутрикожно или внутримышечно. В ситуации, когда осуществить постановку в плечо по определенным причинам невозможно, вакцинацию проводят в бедро.

СЕНСАЦИЯ ! Перейди по ссылке:

Сразу после постановки прививки формируется плоская белая папула, которая по размерам достигает 0,5-1 см в диаметре. Она присутствует на коже 20-30 минут, а потом происходит ее самостоятельное рассасывание. Именно такие показатели свидетельствуют о том, что манипуляция проведена правильно с соблюдением всех правил.

После введения, через 1-1,5 месяцев в месте укола происходит реакция (образование папулы, гнойничка и в процессе заживления образование рубца). Продолжительность симптомов составляет интервал времени от 3 недель до 3 месяцев. Все это время запрещается расчесывать, тереть, обрабатывать растворами, накладывать мази на место укола. В случае, когда после прививки не происходит никаких изменений, а именно процесса образования рубца это является прямым доказательством того, что проведенная вакцинация неэффективна, и необходимо осуществлять ее еще один раз.

Не нужно пугаться, если участок где проводилась прививка, стал гиперемированным. Ведь покраснение считается нормальной реакцией организма. Ограниченная гиперемия может присутствовать в течение всего времени, когда происходит нагноение, ее присутствие в любой другой период времени свидетельствует об определенных нарушениях, и требует обращения к врачу. Обратите внимание, что если есть покраснение, оно должно располагаться только в месте инъекции и не переходить на прилегающие участки кожи.

Взятие пробы с целью проверки на туберкулез

Прививка, которая проводится с целью проверки наличия туберкулезного поражения, носит название проба Манту. Ее нельзя считать прививкой, так как при ее постановке в организм не осуществляется введения иммунобиологического препарата, который способен развивать устойчивость к определенному виду инфекции. Она больше похожа на аллергологическую пробу, призванием которой является оценка состояния защитных сил организма по туберкулезу. Так как детям до достижения четырнадцатилетнего возраста проведение флюорографического обследования для диагностики данного заболевания запрещено, им осуществляется постановка именно этой пробы.

Во время ее проведения внутрикожно вводится средство, им есть туберкулин (суспензия, содержащая фрагменты оболочки МБТ). В нашем случае туберкулин выступает аллергеном, перед которым поставлена задача, спровоцировать ответ иммунитета.

Регистрация результата проведенной пробы Манту осуществляется по истечении трех дней с момента постановки. После введения на коже предплечья образуется «пуговица», при процессе реакции превращающаяся в папулу, которая выглядит как укус комара.

У детей, имеющих прививку до пятилетнего возраста, реакция положительная и имеет размеры, которые колеблются от 5 до 17 мм (со временем они уменьшаются).

Если же возникает ситуация, когда реакция на проводимую пробу отсутствует, то необходимо заявить, что вакцина от туберкулеза не осуществила своей задачи. В таком случае надобно провести вакцинацию повторно.

Патологическим состоянием реакции Манту (до 5 лет) считается:

• чрезмерная величина папулы, размеры которой достигают более 6 мм;
• присутствие дополнительных пузырьков вокруг папулы;
• появление красной протяженной окраски кожи от места инъекции до локтя;
• увеличение лимфоузлов.

При присутствии хотя бы одного из перечисленных выше симптомов, возникает ситуация, которая свидетельствует об инфицировании детского организма. Такая реакция носит название вираж пробы Манту. В таком случае необходимо обратиться к фтизиатру. В случае подтверждения инфицирования назначается курс лечения с профилактической целью, поскольку в таких случаях заболевание может развиться на протяжении 12 месяцев у 15% случаев. Данное лечение направляется на предотвращение развития заболевания, ведь лечить его надо гораздо дольше.

В итоге можно заявить, что прививка от туберкулеза необходима и должна осуществляться всем подлежащим категориям населения.

tuberkulez03.ru

Эффективность противотуберкулезных прививок БЦЖ | Туберкулез

Эффективность противотуберкулезной вакцинации БЦЖ была доказана многими отечественными и зарубежными авторами, которые основывались на сравнительном изучении заболеваемости туберкулезом и смертности от него, а также на результатах изучения клинического течения туберкулеза у привитых и непривитых Поэтому, по данным ВОЗ (1980), вакцинация БЦЖ широко проводится в 118 странах мира, причем в 64 странах противотуберкулезная иммунизация БЦЖ является обязательной и применяется согласно принятому в них законодательству. В остальных странах она применяется согласно рекомендации официальных органов здравоохранения. В настоящее время в большинстве развитых стран продолжает осуществляться массовая вакцинация БЦЖ, несмотря на значительное улучшение эпидемиологической обстановки по туберкулезу.

В нашей стране проводится обязательная вакцинация БЦЖ новорожденных, ревакцинация детей школьного возраста, подростков и взрослых до 30 лет.

Первые работы по вопросу эффективности вакцинации БЦЖ новорожденных были опубликована Calmette в 1928 г. Выдвинутое им положение о значительном снижении (в 4—9 раз) смертности и заболеваемости туберкулезом у привитых новорожденных нашло подтверждение в дальнейших работах.

Вакцинация БЦЖ имеет значение не только в периоде новорожденности, но и в старшем возрасте, особенно у детей, находящихся в препубертатном и пубертатном периодах, у которых первичная спонтанная туберкулезная инфекция протекает часто довольно тяжело и роль ее особенно возрастает в связи со значительным снижением в последние годы инфицированности населения туберкулезом.

Наблюдения как советских, так и зарубежных авторов указывают на значительное снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза среди вакцинированных детей старших возрастов, подростков и взрослых по сравнению с невакцинированными.

Профилактика туберкулеза — вакцина БЦЖ

Исследования, проведенные за последние 30 лет в различных странах мира, свидетельствует о том, что диапазон показателей эффективности вакцинации, определяемый в процентах снижения заболеваемости в группе привитых по сравнению с непривитыми, очень велик: от 80% среди североамериканских индейцев Аляски.

Поэтому прозвучало диссонансом сообщение ВОЗ в 1980 г. о неэффективности вакцинации БЦЖ, основанной на результатах 7,5-летнего контролируемого исследования, проведенного в Мадрасе. Однако этот вывод был основан на неправильной интерпретации полученных данных, неудачно спланированном исследовании. Результаты эффективности оценивались по частоте развития бациллярных форм туберкулеза, не учитывалась заболеваемость и смертность от него детей младшего возраста (моложе 10 лет). В то же время известно, что наибольшая эффективность вакцинации, которая предупреждает развитие небациллярных форм первичного туберкулеза, отмечается у детей.

Материалы по вакцинации БЦЖ, представленные ВОЗ [Ten Dam, 1984], — попытка объяснить различную степень защитного эффекта, полученную в разных странах в 9 всемирно известных контролируемых опытах, проведенных с целью изучения эффективности противотуберкулезных прививок по уменьшению показателей заболеваемости.

Ретроспективный анализ этих исследований позволил среди причин различной эффективности противотуберкулезной вакцинации БЦЖ назвать такие, как недостаточная протективная способность используемых вакцин и штаммов БЦЖ; недостаточная результативность туберкулинового теста при отборе к вакцинации, когда прививается часть инфицированных туберкулезом лиц; отрицательное влияние распространенности инфицированное™ населения атипичными микобактериями. Касаясь прививочного препарата, автор справедливо считает, что для его иммуногенности решающее значение имеет достаточное число жизнеспособных единиц. Это положение иллюстрируется примером 53% защиты среди американских индейцев, когда использовалась слабая по показателю жизнеспособности вакцина БЦЖ, и 80% защиты, полученной в Англии, когда использовалась сильная вакцина. Указывается на необходимость дальнейших научных исследований, касающихся эффективности вакцинации с учетом достижений иммунологии и иммуногенети-ки. Поэтому в условиях тропического климата Африки запланировано три исследования по оценке эффективности вакцинации БЦЖ.

Однако большинство развитых стран отказались от предложения ВОЗ о проведении контролируемого опыта по изучению эффективности вакцинации БЦЖ, боясь оставить большие контингента детей без вакцинации БЦЖ и тем самым подвергнуть их опасности заболевания туберкулезом и считая ее профилактическое действие давно доказанным.

Поэтому в отчете ВОЗ за 1980 г. подчеркивается важность проведения вакцинации БЦЖ в период новорожденности, когда организм ребенка свободен от заражения вирулентным микобактериями туберкулеза, а вакцинация способна обеспечить защиту от заболевания туберкулезом и прежде всего тяжелых его форм, в том числе от туберкулезного менингита.

Многочисленные клинические наблюдения свидетельствуют о благоприятном влиянии вакцинации и ревакцинации БЦЖ на течение первичной туберкулезной инфекции у привитых, так как, согласно экспериментальным исследованиям, проведенным на биологической тест-системе, заключающейся в использовании для заражения очень низкой дозы вирулентного штамма микобактерий (2—4 клетки), вакцинация БЦЖ блокирует гематогенную диссеминацию микобактерий туберкулеза, а также значительно уменьшает их число в легких, что сокращает сроки течения инфекции.

Несомненно, противотуберкулезная вакцинация резко уменьшает развитие таких тяжелых форм заболевания, как туберкулезный менингит, милиарный туберкулез, казеозная пневмония. Первичные формы туберкулеза у вакцинированных при рождении детей по сравнению с невакцинированными протекают более доброкачественно, без осложнений и приводят к сравнительно быстрому благоприятному исходу. У привитых при рождении детей отмечалось главным образом развитие бронхоаденита, в то время как у невакцинированных — развитие первичного комплекса часто в сочетании с внелегочными формами туберкулеза (туберкулез костей, лимфатических узлов и т. д.).

Вакцинация БЦЖ влияет на снижение инфицированности туберкулезом населения. Среди привитых она в 1,5—2 раза ниже.

Массовая вакцинация, проводимая наряду с другими противотуберкулезными мероприятиями, оказывает благоприятное влияние на темпы снижения заболеваемости даже в благоприятных эпидемиологических условиях, что является важным фактором в общей проблеме борьбы с туберкулезом. Сравнивали темпы снижения заболеваемости активными формами туберкулеза за 1948—1961 гг. в определенных возрастных группах в скандинавских странах (Швеция, Дания, Норвегия), где проводится массовая противотуберкулезная вакцинация, с аналогичными показателями двух штатов США (штат Нью-Йорк, включая город Нью-Йорк, и штат Огайо), где массовая вакцинация не проводится.

Приведенные исследования особенно ценны в настоящее время, когда вакцинация против туберкулеза получила массовый характер во многих странах и трудно определить удельный вес этого мероприятия среди других факторов, оказывающих влияние на повсеместное падение заболеваемости и смертности от туберкулеза, которое наблюдается в последнее время в экономически развитых странах мира.

В литературе нет единого мнения о сроках проведения первичной вакцинации БЦЖ новорожденных. В большинстве стран мира она осуществляется на 5—7-й день жизни при использовании внутрикожного метода вакцинации.

Как известно, первым методом иммунизации против туберкулеза новорожденных был энтеральный. Этот метод предусматривал вакцинацию на 5—7-й день жизни ребенка, т. е. в сроки, когда у новорожденного хорошо налаживаются сосательный и глотательный рефлексы.

С 1962 г. в нашей стране применяется внутрикожный метод введения вакцины, при котором у детей, привитых в период но-ворожденности, значительно чаще и раньше наступает иммунологическая перестройка организма, чем у детей, вакцинированных энтеральным методом.

Результаты наблюдения за 362 детьми свидетельствуют об отсутствии принципиальной разницы в реакции организма здоровых детей, привитых на 5—7-й или на 4-й день жизни. Вакцинация в указанные сроки с одинаковой частотой сопровождается появлением кожных знаков у всех детей и быстропрехо-дящей реакцией регионарных лимфатических узлов, развитием поствакцинальной аллергии в 1-й год жизни. Установлена возможность вакцинации БЦЖ новорожденных на 4-й день жизни без ущерба для здоровья ребенка при отсутствии медицинских противопоказаний.

Согласно данным зарубежной литературы вакцинация новорожденных даже в первые часы жизни безвредна и вызывает иммунологическую перестройку организма. Описаны результаты внутрикожной вакцинации БЦЖ у 900 новорожденных в первые часы после рождения. По срокам проведения иммунизации новорожденные были разделены на 3 группы: первую группу составили дети, вакцинированные в первые 12 ч жизни, вторую— между 12 и 24 ч, третью — между 24 и 72 ч. По наблюдениям за общим состоянием и местными реакциями сделан вывод, что вакцинация в указанные сроки безопасна и вызывает положительную туберкулиновую аллергию по пробе Манту со 100 ТЕ у 92% вакцинированных уже к 45-му дню и сохраняется до 135-го дня наблюдения.

На Кубе вакцинация новорожденных проводится в первые 6 ч, в Тунисе — в первые 12 ч жизни.

В России, так же как и в других странах, где широкое проведение массой вакцинации новорожденных, детей старшего возраста, подростков и взрослых получило право гражданства, в современных условиях нельзя изучить эффективность вакцинации по заболеваемости из-за невозможности создания равноценных контрольных групп. Только М. П. Алтыновой (1971) удалось создать такую контрольную группу. Согласно данным автора 54 465 детей и подростков были ревакцинированы внутрикожным методом, а 14 076 не были ревакцинированы. Автор показал, что заболеваемость детей и подростков, не ревакцинированных внутрикожньщ методом, на 58% выше заболеваемости ревакцинированных. Как показали наблюдения М. П. Алтыновой, наиболее выражена эффективность ревакцинации у детей до 14-летнего возраста; заболеваемость туберкулезом детей этой возрастной группы снижается на 65,3%.

В то же время в условиях спада туберкулезной эндемии по мере снижения эпидемиологических показателей в нашей стране будут уменьшаться масштабы противотуберкулезных прививок прежде всего за счет сокращения числа ревакцинации БЦЖ.

В настоящее время на ряде территорий нашей страны, где практически ликвидирована заболеваемость туберкулезом детей и среди них почти не выявляются локальные формы туберкулеза вместо 3 ревакцинаций в возрасте 7, 11—12 лет (5-й класс), 16—17 лет (10-й класс) проводится только две (в возрасте 7 лет — 1-й класс, 14—15 лет — 8-й класс).

С 1972 г. ВОЗ рекомендует для стран со сравнительно небольшим распространением туберкулеза проведение вакцинации детей в наиболее раннем возрасте. При низкой инфицированности детского населения (не выше 1—2%) время первичной вакцинации может быть отложено до момента окончания школы. В этом случае ревакцинации не требуется. Однако в настоящее время ВОЗ рекомендует противотуберкулезную вакцинацию проводить до ликвидации туберкулеза как проблемы здравоохранения.

tuberkulez.org

противотуберкулезная вакцина - патент РФ 2443773

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вакцинных микроорганизмов, и может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают микроорганизм комплекса Mycobacterium tuberculosis, который содержит инактивацию или делецию гена phoP и инактивацию или делецию гена fadD26. Полученный микроорганизм используют для профилактики туберкулеза у людей или животных. Изобретение позволяет получить вакцинный микроорганизм, обладающий свойствами высокой аттенуации и иммунопротекции против туберкулезной инфекции. 7 н.п. ф-лы, 27 ил., 9 пр.

Изобретение относится к выделенному микроорганизму рода Mycobacterium, отличающемуся тем, что в нем инактивирован ген Rv0757, что дает фенотип PhoP-, и инактивирован второй ген, что предотвращает продукцию DIM (фенотип DIM-). Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанного микроорганизма для получения вакцины для иммунизации или профилактики туберкулеза.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время использование вакцин для профилактики туберкулеза, которые применяются у людей почти столетие, вызывают большие сомнения. БЦЖ, полученная из М.bovis, в настоящее время является единственной и наиболее широко используемой применяемой противотуберкулезной вакциной в мире. Разработка и повсеместное применение вакцины БЦЖ с начала 20-х годов ХХ века является значительным достижением, как предполагалось, способным ликвидировать туберкулез во всем мире. Однако эти первоначальные надежды не оправдались, и по результатам большого числа эффективных испытаний стало понятно, что вакцина БЦЖ, в своем настоящем виде, имеет ограниченное использование для контроля распространения заболевания, в частности респираторных форм у взрослого населения развивающихся стран, где заболевание является эндемичным [4]. Благодаря глубоким познаниям в области вирулентности M. tuberculosis и моделей иммунного ответа, которые приводят к возникновению защитного иммунитета, можно разработать более эффективные, чем БЦЖ, вакцины. Наблюдение, что при вакцинации БЦЖ можно получить повышенные уровни защиты, наводит на мысль, что жизнеспособность и длительная эффективность являются фундаментальными свойствами, необходимыми для эффективности противотуберкулезной вакцины. В настоящем изобретении в качестве опытной однократно дозированной живой вакцины авторы использовали штамм M. tuberculosis с инактивированным геном Rv0757 (phoP) и второй, независимой от phoP, мутацией, которая предотвращает синтез DIM, и показали, что кроме того, эта вакцина является более аттенуированной, чем БЦЖ у иммунокомпромитированных мышей SCID, она дает уровни защиты, сравнимые с уровнями БЦЖ у мышей, а у морских свинок даже большую защиту, чем БЦЖ.

Ген phoP наряду с phoR образует часть двухкомпонентной системы, которая демонстрирует высокую степень гомологии с другими двухкомпонентными системами, которые контролируют транскрипцию основных генов вирулентности внутриклеточных патогенов. Также он контролирует экспрессию многих других генов, которые не являются непосредственно вовлеченными в формирование вирулентности [19]. Устранение генов вирулентности само по себе, по-видимому, не является единственным способом аттенуации M. tuberculosis. Было показано, что ауксотрофный по пантотенату мутант M. tuberculosis, не способный синтезировать пантотеновую кислоту de novo, персистировал у мышей SCID, не вызывая заболевания [17]. Отдельные ауксотрофы по лейцину также являются значительно аттенуированными и не способными к репликации in vivo у мышей SCID [28]. Поэтому в настоящее время полагают, что вакцинные штаммы, основанные на M. tuberculosis, могут успешно быть аттенуированы, при этом сохраняя гены, которые подавляются в M. bovis BCG.

Ранее исследование более эффективных, чем БЦЖ, вакцин основывалось на том убеждении, что потеря вирулентности БЦЖ является тем самым фактором, который приводил к недостатку более мощной защитной эффективности [32]. Поэтому был сделан вывод, что новые аттенуированные мутанты M. tuberculosis со сниженной вирулентностью могли быть более эффективными в качестве вакцин. Тем не менее, недавнее исследование показало, что естественное инфицирование M. tuberculosis и вакцинация БЦЖ не отличаются по способности вызывать защитный иммунитет в отношении туберкулеза [34]. При этом возникает вопрос о возможности улучшения БЦЖ путем рациональной аттенуации M. tuberculosis. В этой связи особенно неожиданным и важным наблюдением является тот факт, что мутантный штамм M. tuberculosis по настоящему изобретению, сочетающий в себе 2 независимых мутации, 1 - относящейся к синтезу белка PhoP и 2 - относящейся к синтезу DIM, является более аттенуированным, чем БЦЖ на модели мышей SCID, даже при использовании в дозе, в 10 раз превышающей дозу БЦЖ, и вызывает более мощную защиту, чем БЦЖ на модели морских свинок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект изобретения относится к выделенному микроорганизму, относящемуся к роду Mycobacterium, отличающемуся тем, что содержит инактивацию гена Rv0757 (phoP) и второго гена, которая предотвращает продукцию DIM (фтиоцеролдимикоцерозатов). В настоящем документе этот выделенный микроорганизм будет обозначен как микроорганизм по настоящему изобретению.

Второй аспект настоящего изобретения относится к выделенному микроорганизму, относящемуся к роду Mycobacterium, отличающемуся тем, что содержит инактивированный ген Rv0757 (phoP) и вторую независимую от phoP мутацию, которая предотвращает продукцию DIM. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения указанная вторая мутация находится в гене Rv2930 (fadD26) и представляет собой делецию гена fadD26, который является определяющим в синтезе DIM.

Третий аспект настоящего изобретения относится к использованию выделенного микроорганизма по настоящему изобретению для получения вакцины для профилактики туберкулеза у животных и, еще более предпочтительно, для профилактики туберкулеза у людей, а также к другим вариантам использования, которые в настоящее время имеют противотуберкулезные вакцины, для лечения заболеваний у людей, таких как рак мочевого пузыря.

В контексте настоящего изобретения «штамм M. tuberculosis SO2» может использоваться для обозначения выделенного микроорганизма штамма M. tuberculosis, который инактивировали посредством гена Rv0757, полученного из клинического штамма M. tuberculosis МТ103 путем инсерции устойчивого к канамицину маркера в сайт Bcll гена Rv0757 M. tuberculosis, используя гомологичную рекомбинацию в соответствии со способом, описанным Pelicic et al. (1997) (Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10955-10960), и который дополнительно содержит инактивацию второго гена, что предотвращает продукцию DIM (фтиоцеролдимикоцерозатов). Таким образом, указанный штамм по изобретению содержит две независимых мутации в живых аттенуированных вакцинах, полученных из M. tuberculosis, причем независимая мутация phoP не влияет на свойства вакцины, полученной инактивацией указанного гена. В примере 9 описано создание выделенного микроорганизма рода Mycobacterium с независимой двойной мутацией, которая образует тот же фенотип, что и описанный для штамма M. tuberculosis SO2.

Также в контексте настоящего изобретения вакцина относится к лекарственным препаратам, введение которых стимулирует защитные силы организма в борьбе против заболевания.

Также в контексте настоящего изобретения БЦЖ будет использоваться для обозначения существующей вакцины, которую использовали для борьбы с туберкулезом с 1921. БЦЖ вакцина представляет собой живую аттенуированную вакцину, полученную из штамма M. bovis, который утратил свою вирулентность после субкультивирования в лабораторных условиях и который, как известно, имеет более ста делетированных генов (5).

В контексте настоящего изобретения Н37Rv используется для обозначения патогенного штамма M. tuberculosis, который был секвенирован, Cole et al., и обозначил эти гены как Rv (Ссылка Cole et al. 1998 Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544).

В контексте настоящего изобретения также МТ103 будет использоваться для обозначения клинического изолята M. tuberculosis (ссылка 15 Camacho et al.).

Кроме того, в контексте настоящего изобретения штамм DIM- будет использоваться для обозначения штамма комплекса M. tuberculosis, который не способен синтезировать фтиоцеролдимикоцерозаты, которые являются важными липидами, связанными с патогенностью M. tuberculosis. На Фиг.11 показано использование штамма 1А29, который состоит из штамма МТ103 с геном Rv2930 (fadD26), инактивированным с помощью транспозона 1096, описанного в ссылке 15 (Camacho et al. 1999 Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol 34: 257-267).

В контексте настоящего изобретения штамм SO2+ pSO5 будет использоваться для обозначения штамма M. tuberculosis SO2, в котором мутацию в Rv0757 дополняют геном Rv0757 путем трансформации репликативной плазмиды с микобактериальным геном phoP, и он не способен к дополнительному синтезу DIM, его фенотипом является phoP+DIM-.

В контексте настоящего изобретения M. tuberculosis phoP- будет использоваться для обозначения штамма M. tuberculosis, который инактивирован посредством гена Rv0757 путем делеции между сайтами EcoRV-BspEI, его фенотипом является phoP-DIM+.

В контексте настоящего изобретения Rv2930 (fad26) будет использоваться для обозначения гена, который находится в начале оперона, отвечающего за синтез фтиоцеролдимикоцерозатов (ссылка 15 Camacho et al. 1999), и удаление этого гена в M. tuberculosis приводит к устойчивому фенотипу DIM-.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 - вестерн-блот. Используя поликлональные антитела, направленные против PhoP и ESAT-6, получали вестерн-блот внеклеточного белка штамма МТ103, штамма SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ Pasteur. Штамм МТ103 имеет фенотип ESAT6+ и рhoP+, штамм SO2 имеет фенотип PhoP- и ESAT6+, и штамм вакцины БЦЖ является PhoP+ и ESAT6-.

Фиг.2 - аттенуация штамма SO2 по настоящему изобретению у мышей SCID. а) График степени выживаемости мышей SCID (n=10), инфицированных аэрозолями, содержащими следующие штаммы: SO2, SO2, дополненный pSO5 (SO2 + pSO5) и МТ103 в количестве 20 КОЕ. Средний срок жизни составил более 245 дней (SO2), 62,1±5,88 (SO2 + pSO5) и 36,7±0,67 (МТ103). Мыши, инфицированные аэрозолем со штаммом SO2, выжили в течение 245 дней эксперимента, тогда как мыши, инфицированные МТ103 и штаммом SO2, дополненным рhoP, умерли до 62 дня. b) - Графики степени выживаемости мышей SCID (n=7), зараженных внутривенным введением штамма SO2 в количестве 5,4х106 КОЕ и БЦЖ Pasteur в количестве 2х105 КОЕ. Это показывает, что уровень аттенуации штамма SO2 превышает уровень аттенуации БЦЖ, противотуберкулезной вакцины, на сегодняшний день использующейся для вакцинации людей.

Фиг.3 - клеточные иммунные реакции у мышей, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ. Мышей Balb/c вакцинировали подкожной инъекцией БЦЖ (Phipps) в количестве 8х103 КОЕ или штаммом SO2 по настоящему изобретению в количестве 2,5х10 3 КОЕ. Результаты представлены в виде процента общего количества популяций CD4+/CD8+ в селезенке за промежутки времени после вакцинации и в виде процента клеток, которые экспрессируют IFN- от общей популяции CD4+/CD8+ после стимуляции полным антигеном M. tuberculosis. * обозначает статистически значимые различия между группами в данные точки времени (р<0,005). Результаты по клеточному иммунитету показывают, что у животных, вакцинированных штаммом SO2, по сравнению с мышами, вакцинированными БЦЖ, в дни 14, 30, 45 и 60 количество CD4+ лимфоцитов намного больше, и в дни 45 и 60 является значительной продукция специфического IFN- , направленного против антигенов M. tuberculosis. Количество CD8+ лимфоцитов у животных, вакцинированных штаммом SO2, больше в дни 45 и 60, а продукция специфического IFN- , направленного против антигенов M. tuberculosis, значительна в день 14 по сравнению с мышами, вакцинированными БЦЖ.

Фиг.4 - протективная эффективность штамма SO2 по настоящему изобретению в сравнении с БЦЖ у вакцинированных мышей Balb/c. Величины КОЕ, полученные при анализе легких (а) и селезенок (b) мышей Balb/c, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ, внутривенно зараженных M. tuberculosis h47Rv. Снижение значений КОЕ в легком и селезенке мышей, вакцинированных SO2, аналогично полученному у мышей, вакцинированных БЦЖ, что указывает на значительную защиту по сравнению с не вакцинированными мышами.

Фиг.5 - протективная эффективность у морских свинок, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ, в отношении низких доз M. tuberculosis h47Rv. Средние значения log10 КОЕ/мл в легких (а) и селезенке (b) вакцинированных морских свинок и контрольных морских свинок, которым ввели физиологический раствор, зараженных низкими дозами M. tuberculosis h47Rv. Данные представляют средние значения КОЕ всех животных (n=6), забитых через 6 недель. Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение. Снижение значений КОЕ в легких и селезенке морских свинок, зараженных M. tuberculosis в низких дозах и вакцинированных SO2, аналогично полученному на морских свинках, вакцинированных БЦЖ, и является значительным по сравнению с не вакцинированными морскими свинками.

Фиг.6 - протективная эффективность у морских свинок, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ, в отношении заражения высокими дозами M. tuberculosis h47Rv. а) В связи с тем, что эксперименты, связанные с протекцией, у мышей и морских свинок, зараженных низкими дозами, показали наличие явной протекции у мышей, вакцинированных SO2 и БЦЖ, но без различий между БЦЖ и SO2, была использована модель морских свинок с заражением высокими дозами. График степени выживаемости морских свинок после аэрозольного инфицирования M. tuberculosis h47Rv. b) Степень выраженности заболевания легких и распространения инфекции, оцененные с помощью суммарной консолидации легочной ткани. Значения каждого отдельного животного, забитого в конечной точке, определенной человеком, помечают знаком «х». Пунктирная линия указывает среднее значение в процентах для данной группы (# в SO2 соответствует двум животным). с) Низкое разрешение (х30) изображений характерных гистологических срезов долей легкого, полученных от морских свинок каждой из обработанных групп. Черта представляет 1 мм. d) Среднее значение КОЕ подсчитывают в селезенке и легких вакцинированных и не вакцинированных морских свинок. Этот эксперимент показывает, что на модели морских свинок при высоких дозах заражения M. tuberculosis морские свинки, вакцинированные SO2, выживали значительно дольше, чем при вакцинации БЦЖ, и у них также образовывалось меньше поражений легких и было меньшее число КОЕ в селезенке и легких по сравнению с применяемой в настоящее время вакциной БЦЖ.

Фиг.7. Аттенуация внутривенного инфицирования штаммом SO2 по настоящему изобретению у мышей Balb/C не восстанавливается дополнением phoP. Исследование на мышах Balb/C внутривенного инфицирования штаммом SO2(phoP-DIM-) в количестве 105 КОЕ сравнили с инфицированием штаммом МТ103 дикого типа и штаммом, дополненным phoP (SO2 + pSO5). Уменьшение числа колоний (КОЕ) наблюдали и в селезенке (7а - селезенка) и в легком (7b - легкое), оценку производили через 3 и 6 недель. Уровни КОЕ штамма дикого типа не восстанавливались в дополненном штамме. Эти эксперименты у иммунокомпетентных мышей указывают на то, что неожиданная аттенуация могла быть вызвана второй дополнительной мутацией, которая не восстанавливается путем дополнения phoP.

Фиг.8. Штамм SO2 по настоящему изобретению не продуцирует DIM, и синтез DIM является независимым от мутации phoP. Анализ липидов различных штаммов M. tuberculosis посредством тонкослойной хроматографии. а) У штамма МТ103 может быть обнаружена продукция DIM, тогда как DIM не продуцируется штаммом SO2 и дополненным геном phoP штаммом (SO2 pSO5). Это показывает, что отсутствие продукции DIM у штамма SO2 не зависит от phoP. На Фиг.8b показан штамм МТ103 и штамм МТ103, инактивированный только в отношении гена phoP (МТ103 phoP::hyg), и оба они способны синтезировать DIM, что подтверждает, что продукция DIM не зависит от мутации phoP.

Фиг.9 - конструкция плазмид для инактивации гена fadD26.

Фиг.10 - конструкция плазмид для инактивации гена phoP.

Фиг.11 - изучение аттенуации у мышей: график степени выживаемости мышей Balb/C, интратрахеально зараженных с целью изучения аттенуации различных штаммов M. tuberculosis. Н37Rv и МТ103 соответствуют штаммам M. tuberculosis без мутаций, и все мыши, зараженные этими штаммами, умерли до 10-й недели. Со штаммом M. tuberculosis DIM- (1А29) 50% мышей выжили через 20 недель. Все животные, зараженные штаммом SO2 (мутант phoP- и DIM-), выжили в течение 20 недель эксперимента.

Фиг.12 - график степени выживаемости и веса морских свинок для изучения токсичности штамма SO2 (50-кратная доза вакцины). Чтобы показать, что штамм SO2 не токсичен, шесть морских свинок заражали 50-кратной дозой вакцины. После 6-месячного эксперимента степень выживаемости оказалась 100%. Увеличение массы тела наблюдали у всех животных в течение 6 месяцев, что показывает нетоксичность штамма SO2 (Y=масса в граммах каждую неделю после инфицирования. Х=время в неделях).

Фиг.13 - степень выживаемости вакцинированных морских свинок после заражения M. tuberculosis. Исследование протекции у морских свинок, степень выживаемости через 300 дней: график степени выживаемости не вакцинированных морских свинок (физиологический раствор), вакцинированных имеющейся в настоящее время вакциной БЦЖ, штаммом M. tuberculosis phoP- или штаммом SO2 (мутант phoP- и DIM-). Для изучения степени выживаемости после подкожной вакцинации животных заражали вирулентным штаммом M. tuberculosis (h47Rv) в высокой дозе. Через 60 дней 6 морских свинок, которые не были вакцинированы, умерли, тогда как группы, вакцинированные SO2, phoP- и БЦЖ, выжили. Через 300 дней после заражения 3 морские свинки, вакцинированные БЦЖ и phoP-, умерли, в то время как в группе, вакцинированной SO2, умерла только одна свинка, что указывает на то, что уровень защиты мутанта phoP аналогичен уровню защиты имеющейся в настоящее время вакцины БЦЖ, в то же время вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP- и DIM-, на модели морских свинок защищает лучше.

Фиг.14 - изучение протекции у морских свинок, степень выживаемости через 400 дней: продолжение эксперимента, представленного на Фиг.13. 6 не вакцинированных морских свинок умерли через 60 дней. Через 400 дней после заражения выжили 3 морские свинки из группы, вакцинированной штаммом SO2 (Фиг.14а), тогда как выжила только 1 морская свинка, вакцинированная БЦЖ (Фиг.14а и Фиг.14b) и phoP- (Фиг.14b), что вновь указывает на то, что защита мутанта phoP аналогична защите БЦЖ, в то время как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP- и DIM-, через 400 дней эксперимента защищает лучше.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному микроорганизму, относящемуся к роду Mycobacterium, отличающемуся тем, что содержит инактивацию гена Rv0757, что дает фенотип PhoP-, и инактивацию второго гена, что предотвращает продукцию DIM (фенотип DIM-). Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанного микроорганизма для получения вакцины для профилактики туберкулеза и непосредственно саму вакцину.

В описании настоящего изобретения показано, что выделенные штаммы phoP- DIM- рода Mycobacterium обладают характеристиками, которые делают их особенно эффективными для использования в качестве вакцин благодаря уровню аттенуации, которого они достигают, а также уровню защиты, который они создают.

Для демонстрации аттенуации иммунодепрессированных мышей SCID заражали штаммом SO2 (phoP- DIM-) из аэрозоля. Указанные мыши выживают (Фиг.2а) гораздо дольше, чем мыши, зараженные штаммом дикого типа. Кроме того, эта аттенуация сохраняется при дополнении phoP в штамме SO2 + pSO5 (phoP+ DIM-) (Фиг.8а).

Более того, при проведении исследований, связанных с аттенуацией, на иммунокомпетентных мышах Balb/C путем внутривенного введения (Фиг.7), показана очевидная аттенуация штамма SO2 по сравнению со штаммом МТ103 дикого типа, но, как ни удивительно, эта аттенуация не дополняется phoP, поскольку штамм SO2 + pSO5 (phoP+ DIM-) является столь же вирулентным для иммунокомпетентной мыши, как и штамм дикого типа. Исследования выживаемости на мышах Balb/C, при которых сравнивали штамм SO2 (DIM-, phoP) со штаммом только DIM-, демонстрируют, как ни удивительно, более высокую степень выживаемости для SO2 (Фиг.11).

Сравнительные исследования выживаемости SO2 и БЦЖ на мышах SCID, зараженных внутривенно, показывают, что уровень аттенуации штамма SO2 выше, чем БЦЖ, вакцины, которая в настоящее время используется у людей для борьбы с туберкулезом (Фиг.2b). Исследования токсичности на морских свинках с 50-кратной дозировкой вакцины, использованной для контроля качества партий вакцины БЦЖ, показывают, что в течение 6 месяцев исследования морские свинки прибавили в весе и у них ни макроскопически, ни микроскопически не наблюдались гистологические поражения, согласующиеся с туберкулезом, таким образом, подтверждая аттенуацию и нетоксичность штамма SO2 (Фиг.12). Эта неожиданная аттенуация и потеря токсичности обусловлена фенотипом PhoP- DIM-, и, кроме того, эти мутации сохраняют чувствительность к противотуберкулезным препаратам, что позволило бы провести стандартное лечение.

В настоящем описании показано, что в экспериментах с вакцинацией, осуществленных на мышах Balb/C, уровни защиты, создаваемые штаммом M. tuberculosis SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ, были аналогичны как в легких, так и в селезенке вплоть до четырех недель после заражения. При сравнении относительных пропорций CD4+ и CD8+ клеток, полученных из селезенок вакцинированных мышей, у мышей, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению, был обнаружен более высокий процент как CD4+, так и CD8+ клеток по сравнению с мышами, вакцинированными БЦЖ. Более того, при стимуляции этих клеток антигеном, полученным из культурального фильтрата, у мышей, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению, на 45 и 60 дни после вакцинации определяли достоверно более высокий процент CD4+/IFN- +. Несмотря на то что этот процент не является значимым в каждой точке времени, аналогичную тенденцию определяли и для CD8+/IFN- + у мышей, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению. Эти данные указывают на то, что вакцинация штаммом SO2 по настоящему изобретению приводит к более эффективной активации Т-клеток по сравнению с вакцинацией БЦЖ, которую определяли по синтезу IFN- . При условии, что защитный иммунитет к M. tuberculosis в целом зависит от клеточного иммунного ответа типа ТН1 , отличающегося секрецией IFN- специфическими Т-клетками в ответ на антиген, можно сделать вывод, что относительно высокие уровни Т-клеточной активации, индуцированные штаммом SO2 по настоящему изобретению, обеспечивают ему способность создавать сильный защитный ответ.

Кроме того, используя различные системы и модели для проведения эксперимента и большое число условий, авторы смогли показать сравнительную возможность использования мышиной модели для изучения различий в защите, создаваемой БЦЖ по сравнению с SO2. На мышиной модели было показано, что защиту создают две вакцины, SO2 (phoP- DIM-) и БЦЖ.

Для сравнения вакцин в более значимом и на каждом из этапов более трудоемком эксперименте с морскими свинками была предпринята определенная стратегия. Этот систематический подход для сравнения вакцин может представлять собой ценную исходную точку для определения лучших вероятных вакцин, для которых должны быть проведены дальнейшие опыты. Как правило, полагают, что морские свинки более чувствительны к заражению туберкулезом и поэтому могут быть более значимой моделью этого заболевания [30]. Преимущество морской свинки по сравнению с мышами заключается в том, что патология заболевания аналогична патологии, обнаруживаемой при туберкулезе у людей, и поэтому она является подходящей моделью для тестирования эффективности вакцины. В недавнем исследовании вакцины, вводимой путем аэрозоля, содержащей двойной ауксотрофный мутант M. tuberculosis, по пантотенату и лейцину, через пять недель после аэрозольной аппликации M. tuberculosis в легких и селезенке вакцинированных морских свинок были обнаружены уровни защиты, эквивалентные уровням, вызывающим M. bovis BCG, с ограниченным распространением инфекции в селезенку, индуцированным обеими вакцинами [34]. В другом исследовании, в котором использовали рекомбинантную БЦЖ, экспрессировавшую ESAT-6, более высокие, чем у M. bovis BCG, уровни защиты были обнаружены лишь в селезенке [6], указывая, что улучшенная защита связана с ее способностью предотвращать распространение инфекции из легкого.

Для осуществления указанного инфицирования морским свинкам в низкой дозе инокулировали M. tuberculosis h47Rv, и уровни защиты, создаваемые вакцинацией штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ, оказались аналогичными как в легких, так и в селезенке в течение 4 недель после заражения. Обе вакцины создавали крайне эффективную защиту, снизив значения КОЕ в легких и селезенке приблизительно на 2 log по сравнению с контрольными группами, которым вводили физиологический раствор. Тем не менее, между двумя вакцинированными группами не оказалось статистически значимого различия. Авторы предположили, что за такой короткий период времени после инфицирования было бы трудно доказать большую эффективность новой вакцины по сравнению с БЦЖ. Это обусловлено тем фактом, что на данный момент КОЕ (колониеобразующие единицы) органов животных, вакцинированных БЦЖ, настолько малы, что тест не обладает дифференцирующей способностью продемонстрировать значительное дополнительное снижение КОЕ. В других исследованиях выживаемости на морских свинках было показано, что несмотря на то что вакцинация БЦЖ обеспечивает создание статистически значимой защиты по сравнению с не вакцинированными контролями (или вакцинированными неэффективными вакцинами), эта защита является всего лишь частичной даже в отношении заражения низкими дозами M. tuberculosis. В исследованиях с применением низких доз, проведенных в течение от 60 до 80 недель после инфицирования, некоторые контроли с БЦЖ не создали защиту ни одной морской свинке [35], в то время как другие создали защиту низкому проценту (между 20 и 30%) животных [36] [37]. Аппликация в высокой дозе, с другой стороны, может привести к более тяжелому заболеванию, чем обычно используемое для оценки протективной эффективности вакцин против ТВ.

Для настоящего изобретения авторы использовали аэрозольное инфицирование с относительно высокой дозой M. tuberculosis h47Rv, а период исследования был продлен до 180 дней. Авторы сделали это для создания более жесткой степени заражения, которая может продемонстрировать возможную защитную эффективность штамма SO2 по настоящему изобретению, и в то же время для содействия в установлении степени различия с БЦЖ. В пересчете на выживаемость животные группы, вакцинированной БЦЖ, оказались значительно более защищенными по сравнению с не вакцинированными контролями, и у них наблюдалась наибольшая степень защиты, аналогичная обнаруженной в других исследованиях, несмотря на относительно высокую дозу инфицирования, использованную в нашем исследовании. Более того, авторы также обнаружили статистически значимое повышение протективной эффективности штамма SO2 (phoP- DIM-) по настоящему изобретению в сравнении с БЦЖ, определенное с помощью нескольких показателей, включая увеличение срока жизни и степень консолидации поражений легких. Эта менее тяжелая форма заболевания могла непосредственно отвечать за более высокую степень выживаемости животных, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению.

Результаты, описанные в настоящем изобретении, показывают, что в соответствии со многими критериями оценки штамм SO2, а значит, и микроорганизм, относящийся к роду Mycobacterium (в частности, относящийся к комплексу M. Tuberculosis), с фенотипом phoP- DIM- является более эффективной вакциной, чем БЦЖ. Вакцина более аттенуированная, чем БЦЖ у мышей SCID, она создает мышам протективный иммунитет, который, по меньшей мере, не хуже иммунитета, создаваемого БЦЖ, и она обеспечивает более сильные клеточные иммунные реакции. Кроме того, в экспериментах по исследованию защиты, проводившихся на морских свинках, инфицированных высокими дозами h47Rv, штамм с фенотипом DIM- phoP- приводит к 100% выживаемости морских свинок в условиях, в которых БЦЖ достигает только 33% выживаемости. Полагают, что эта защита связана со снижением тяжести заболевания и бактериальной нагрузки.

Для определения того, обусловлен ли уровень защиты штамма SO2 (phoP- DIM-) мутацией phoP или же мог быть вызван дополнительной мутацией в DIM, на морских свинках проводили другой эксперимент вакцинации с инфицированием в высоких дозах. Группы из 6 животных вакцинировали БЦЖ, SO2 (РhoP- DIM-) и M. tuberculosis phoP- DIM+, и 6 животных, использованных в качестве контроля, не были вакцинированы. Эксперимент длился 400 дней.

В этом еще одном эксперименте не вакцинированные морские свинки умирали в течение 70 дней. Через 300 дней после инфицирования умерли 3 морские свинки, вакцинированные БЦЖ и phoP- DIM+, по сравнению всего лишь с одной в группе, вакцинированной штаммом SO2, что указывает на то, что защита, создаваемая мутантом phoP- DIM+, аналогична защите используемой в настоящее время вакцины БЦЖ, в то время как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP- и DIM-, на модели морской свинки обеспечивает лучшую защиту (Фиг.13). Через 400 дней в группе, вакцинированной SO2, выжили 3 морские свинки (Фиг.14а), тогда как выжила только 1 морская свинка, вакцинированная БЦЖ (Фиг.14а и Фиг.14b) и phoP- DIM+ (Фиг.14b), указывая на то, что через 400 дней проведения эксперимента защита мутанта phoP- DIM+ является аналогичной защите БЦЖ, тогда как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP- и DIM-, защищает эффективнее, неожиданный эффект более высокой протекции, чем БЦЖ, объясняется не одной только мутацией phoP-, но двойной мутацией phoP- DIM- штамма SO2.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к выделенному микроорганизму, относящемуся к роду Mycobacterium, отличающемуся тем, что содержит инактивацию или делецию:

а) гена phoP- или одного или нескольких генов, которые регулируют ген phoP-, или которые регулируются геном phoP-, и

b) второго гена, который предотвращает продукцию DIM.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенный микроорганизм по изобретению отличается тем, что ген phoP- инактивирован путем инактивации или делеции гена Rv0757.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенный микроорганизм по изобретению отличается тем, что продукцию DIM инактивируют путем делеции или инактивации гена Rv2930 (fadD26).

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенный микроорганизм по изобретению отличается тем, что он содержит делецию или инактивацию генов Rv2930 и Rv0757.

В другом варианте осуществления изобретения выделенный микроорганизм по изобретению отличается тем, что вид рода Mycobacterium относится к комплексу Mycobacterium tuberculosis.

Второй аспект изобретения относится к способу получения выделенного микроорганизма по изобретению, который включает:

а) инактивацию или делецию гена phoP или одного или нескольких генов, которые регулируют ген phoP, предпочтительно, инактивацию или делецию гена Rv0757, и

b) инактивацию или делецию второго гена, который предотвращает продукцию DIM, предпочтительно делецию или инактивацию гена Rv2930 (fadD26).

Третий аспект изобретения относится к вакцине (в данном документе - вакцина по изобретению) для иммунизации индивидуума против проявления симптомов, вызванных туберкулезом, при этом указанная вакцина содержит по меньшей мере один выделенный микроорганизм по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина также содержит фармакологически приемлемые эксципиенты.

Четвертый аспект изобретения относится к способу получения лекарственного средства, предпочтительно, вакцины, который включает введение выделенного микроорганизма по изобретению в подходящую среду для использования на людях или животных в терапевтически эффективной дозе и, необязательно, добавление эксципиентов, которые являются фармакологически приемлемыми для получения вакцин.

Указанное лекарственное средство подходит для лечения рака мочевого пузыря, для лечения или профилактики туберкулеза или в качестве вектора или адъюванта. Предпочтительно для иммунизации индивидуума против проявления симптомов, вызываемых туберкулезом.

Пятый аспект изобретения относится к применению выделенного микроорганизма по изобретению для получения вакцины по изобретению для профилактики и/или лечения туберкулеза у людей или животных.

На протяжении всего описания и формулы изобретения слово «содержит» и его варианты не подразумевают исключения других технических характеристик, добавок, компонентов или этапов. Для специалиста в данной области другие цели, преимущества и характеристики изобретения будут частично вытекать из описания и частично при осуществлении практики изобретения. В качестве не ограничивающего наглядного примера настоящего изобретения предлагаются следующие примеры и фигуры.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Материалы и способы

1.1. Выделение белка и иммуноблоттинг. К белку PhoP были получены поликлональные антитела, которые получали четырьмя дозами PhoP (0,5 мг) в 0, 4, 8, 12 и 16 недели, соответственно. Антитела против PhoP определяли, используя тест ELISA (ZEU-Immunotec Zaragoza, Spain). Моноклональные антитела против ESAT-6 были любезно предоставлены S. Cole [24]. Бесклеточные белковые экстракты микобактерий получали из ранних культур в log-фазе, которые выращивали на жидкой среде Middlebrook 7H9-ADC, далее действуя обычными способами [25]. Белковые экстракты M. tuberculosis фильтровали через фильтр Millex-GP с размером пор 0,22 мкм (Millipore, Bedford, MA). Собирали фильтрат культуры M. tuberculosis h47Rv, культивированной в течение 5-6 недель, и отфильтрованные белки культуры преципитировали 45% (масса/объем) раствором сульфата аммония. В соответствии со стандартными способами проводили анализ вестерн-блот. В качестве вторичных антител использовали козьи антитела против антител кролика, меченные пероксидазой хрена (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

1.2. Заражение мышей SCID M. tuberculosis. Работу с мышами SCID проводили под наблюдением Комитета по охране животных в Университетском Госпитале Germans Trias i Pujol в соответствии с законами EU по защите лабораторных животных. Cвободные от специфических патогенов (spf) мыши SCID CB-17/Icr Ico были получены от Charles River (Bagneux Cedex, France). Для аэрозольного инфицирования мышей помещали в камеру для экспозиции инфекции, передаваемой воздушно-капельным путем (Glas-col Inc., Terre Haute, IN, USA). Небулайзер заполняли 7 мл суспензии M. tuberculosis, чтобы ввести в легкие около 20 жизнеспособных бацилл. Для каждой экспериментальной группы использовали по десять мышей. Для внутривенного инфицирования через латеральную хвостовую вену группы по 7 мышей инфицировали 200 мкл PBS, содержащего дозы, эквивалентные 2×105, 2×104 и 2×103 жизнеспособной БЦЖ и 5,4×106 , 5,4×105, и 5,4×104 жизнеспособного штамма M. tuberculosis phoP. Используя тест Mantel-Haenszel, между обработанными мышами определяли значимость различий в сроке жизни. Подсчеты жизнеспособных клеток осуществляли по серийным разведениям гомогената, помещенного на агар Middlebrook 7h21+OADC и оцененного через 3 недели роста. Для проведения гистологического анализа ткани фиксировали в забуференном формолсолевом растворе и заливали в парафин. Делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали по Цилю-Нильсену.

1.3. Определение активации клеточного иммунитета у мышей Balb/c после подкожной вакцинации штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ. Группы из четырех мышей Balb/c забивали на 7, 14, 21, 28, 45 и 60 дни после подкожной вакцинации БЦЖ (Phipps) в количестве 8×103 КОЕ или штаммом SO2 по настоящему изобретению в количестве 2,5×10 3. Селезенки удаляли и помещали в 2 мл среды RPMI и 10% эмбриональной сывороткой теленка (GIBCO, Invitrogen Corporation), содержащей 0,5 мг/мл коллагеназы II типа (Worthington, NJ, USA) и 2 Ед/мл ДНКазы (GIBCO), и инкубировали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем пропускали их через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм (Falcon, Becton Dickinson 70 µm Nylon 35-2350), давили плунжером шприца и промывали средой. Клетки центрифугировали, супернатант удаляли, а красные клетки извлекали лизирующим буфером [26]. После центрифугирования и отмывки средой RPMI клетки ресуспендировали в буфере FACS (1-кратный PBS, значение рН 7,2, 1% БСА) и подсчитывали их количество. Поверхность клеток метили, инкубируя 106 клеток со 100 мкл моноклональных антител против CD4-FITC или против CD8-FITC, разведенных в соотношении 1:20 в PBS, содержащем 1% БСА и 0,1% азид натрия, в течение 20 мин при 4°С и анализировали, используя цитометр FACScan.

Штамм M. tuberculosis h47Rv культивировали на среде Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories), дополненной OADC (Difco Laboratories). После культивирования в течение 1 месяца бактериальную массу отделяли и собирали культуральный фильтрат. Антигены указанного фильтрата преципитировали 45% раствором (масса/объем) сульфата аммония, отмывали и вновь растворяли в PBS. Для стимуляции клеток клетки селезенки в количестве 1×106 ресуспендировали в 100 мкл среды RPMI на лунку и инкубировали с антигенами культурального фильтрата M. tuberculosis, взятыми в количестве 10 мкг, суспендированными в 100 мкл PBS, в течение 72 часов при 37°C в атмосфере 5% СО2. Клетки и культуральную среду центрифугировали, супернатант удаляли и после подсчета и проверки жизнеспособности 2,5×10 5 клеток на пробирку метили на поверхности CD4+ или CD8+ клеток, как описано выше. После отмывки клетки ресуспендировали и инкубировали в течение 20 мин при 4°C в 0,1% сапонине, растворенном в PBS. Внеклеточный IFN- определяли инкубированием клеток в течение 20 мин при 4°C в темноте со 100 мкл моноклональных антител против IFN- , взятых в разведении 1/20, меченных фикоэритрином (РЕ). Клетки фиксировали 100 мкл 4% раствора параформальдегида в PBS. Через 20 минут анализировали образцы, используя цитометр FACScan. Контролями изотипов являлись Ab-FITC (разведение 1:20) +Ab-PE (разведение 1:20).

1.4. Протективная эффективность штамма SO2 по настоящему изобретению у мышей Balb/c. Всех животных содержали в контролируемых условиях в лаборатории содержания животных высокого уровня биологической защиты Р3 в Институте Пастера в Париже в соответствии с постановлениями EU по защите лабораторных животных. Группы мышей Balb/c (7 на группу) подкожно вакцинировали в основание хвоста штаммом SO2 по настоящему изобретению или БЦЖ (Pasteur), взятыми в количестве 107 КОЕ. Через восемь недель после вакцинации всем мышам внутривенно вводили M. tuberculosis h47Rv в количестве 2,5×105 КОЕ. Через четыре недели после инъекции мышей забивали. Подсчеты жизнеспособных клеток осуществляли по серийным разведениям гомогената, культивированного на жидкой среде Middlebrook 7h21 + агар OADC, и через 3 недели оценивали рост M. tuberculosis h47Rv, исключая штамм SO2 по настоящему изобретению на основании резистентного к канамицину фенотипа последнего штамма.

1.5. Протективная эффективность штамма SO2 по настоящему изобретению у морских свинок. Экспериментальную работу с морскими свинками проводили в соответствии с законами UK по экспериментам на животных, и ее утвердил местный этический комитет организации по защите здоровья, Porton Down, UK. Самок морских свинок Dunkin-Hartley получали от лицензированных коммерческих поставщиков (UK Home Office) (David Hall, Burton-on-Trent, UK, или Harlan Ltd UK, Bicester, UK) и их разводили в полной изоляции. Результаты, представленные на Фиг.6, показывают, что штамм SO2 создает большую защиту, чем БЦЖ. Результаты, представленные на Фиг.13 и 14, показывают, что эта неожиданная защита мутанта SO2 обусловлена его двойным фенотипом DIM-/PhoP-.

1.6. Применение в низкой дозе. Группы из 6 морских свинок вакцинировали подкожно в загривок следующими препаратами в объеме 250 мкл: 5×104 КОЕ БЦЖ Pasteur; 5×104 КОЕ штамма SO2 по настоящему изобретению; или физиологическим раствором. Животных оставляли в покое в течение 12 недель перед заражением аэрозолем, используя аппарат Henderson, как описано выше [27]. Используя небулайзер Collison, получали аэрозоли из мелкодисперсных частиц M. tuberculosis h47Rv со средним диаметром 2 мкм (диапазон значений диаметра: 0,5-7 мкм) и наводили непосредственно на нос животного. Аэрозоль получали из водной суспензии, содержащей 2×106 КОЕ/мл, для достижения фиксированной ингалируемой дозы, которую рассчитывали около 10-50 КОЕ/легкое.

Через четыре недели после введения оценивали степень протекции. Животных забивали путем перитонеальной передозировки пентобарбитала натрия. Из селезенки и легких асептически удаляли ткань (левую и среднюю краниальные доли, правую среднюю долю и правые каудальные доли) и помещали в стерильные контейнеры. Материал хранили при -20°C и затем подготавливали для подсчета количества бактерий. Ткань гомогенизировали в 10 мл (для легкого) или 5 мл (для селезенки) стерильной деионизованной воды, используя систему измельчения с вращающейся лопастью (Ystral). Подсчеты жизнеспособных клеток осуществляли серийными разведениями гомогената, культивированного в среде Middlebrook 7h21 + агар OADC, и через 3 недели оценивали рост M. tuberculosis. Данные для анализа переводили в log 10 и с помощью t-критерия Стьюдента число жизнеспособных M. tuberculosis для каждой вакцинированной группы сравнивали с контрольной группой, получившей физиологический раствор.

1.7. Тест на определение защиты у морских свинок после инфицирования высокой дозой M. tuberculosis. За 10 недель до аэрозольной аппликации M. tuberculosis группы из 6 морских свинок вакцинировали подкожно штаммом SO2 по настоящему изобретению или БЦЖ (Danish 1331) в количестве 5×104 КОЕ. Аэрозольную аппликацию осуществляли, как описано в предыдущем параграфе, используя суспензию 5×107 КОЕ/мл, чтобы доставить в легкие около 500 КОЕ. После аппликации животных содержали в условиях уровня защиты 3 (ACDP), изменения веса регулярно контролировали и их забивали гуманным способом через 180 дней после аппликации или в конечной точке, определенной человеком (потеря 20% максимального веса тела). Сбор и обработку образцов после вскрытия осуществляли, как описано выше, за исключением того, что консолидацию легочной ткани измеряли, используя анализ изображения срезов ткани легкого, фиксированных в формалине, окрашенных гематоксилином и эозином (Н+Е). Выживаемость животных сравнивали, используя показатели выживаемости Каплана-Мейера, и для определения статистически значимых различий использовали анализ распределения Log Rank. Данные величин КОЕ и консолидации поражения анализировали с помощью ANOVA, используя парные сравнения Фишера для сопоставления средних величин групп.

Пример 2. Характеристика M. tuberculosis phoP

Доказательство вовлеченности гена phoP в общую регуляцию генетических циклов микобактерий было получено путем наблюдения за изменениями размера бациллы и вытекающих отсюда свойств растущих клеток, содержащих инактивированный ген phoP. Учитывая основные свойства секретируемых антигенов как детерминант защиты против туберкулеза, авторы надеются определить, распространяются ли плейотропные эффекты мутации гена phoP на синтез основного иммунодоминантного антигена: ESAT-6. Используя антигены, направленные против белка PhoP и ESAT-6, проводили вестерн-блот штамма SO2, БЦЖ и МТ103. Результаты ясно показали, что белок PhoP постоянно экспрессировался в штаммах M. tuberculosis МТ103 и БЦЖ, в то время как он полностью отсутствовал в штамме SO2 по настоящему изобретению. Напротив, уровни экспрессии ESAT-6 в супернатанте культур штамма SO2 были аналогичны уровням, определенным для родительского штамма МТ103 и, как и предполагалось, в БЦЖ белка ESAT-6 определено не было.

Пример 3. Выживаемость мышей, инфицированных штаммами по настоящему изобретению и БЦЖ

Выживаемость иммунокомпромиссных мышей SCID оценивали после аэрозольного инфицирования (около 20 КОЕ) штаммом МТ103, SO2 и SO2, дополненным геном phoP (SO2 + pSO5) [23]. Все мыши, инфицированные штаммом SO2, выжили в течение более 245 дней. Наоборот, все мыши SCID, инфицированные МТ103 или дополненным M. tuberculosis SO2-рSO5, умерли через 62 дня после инфицирования, что указывает на восстановление вирулентности дополненного штамма (Фиг.2а).

У мышей SCID после внутривенного введения также сравнивали аттенуацию штамма SO2 с БЦЖ. Группы мышей SCID заражали через латеральную хвостовую вену несколькими дозами (2×105, 2×10 4 и 2×103 КОЕ) БЦЖ Pasteur или штамма SO2 (5,4×106, 5,4×105 и 5,4×10 4 КОЕ). Гистологическое окрашивание инфицированных альвеолярных макрофагов подгруппы мышей, забитых через три недели после заражения, показало меньшее число спирто-кислотоустойчивых бацилл в легких мышей, зараженных штаммом M. tuberculosis SO2, по сравнению с БЦЖ. Все мыши, зараженные более высокими дозами БЦЖ (2×10 5 КОЕ), умерли через 92 дня после заражения (среднее время жизни: 89±3,5 дней) (Фиг.2b). Наоборот, все мыши, инфицированные максимальной дозой штамма SO2 (5,4×106 КОЕ), остались живы после 120 дней (Фиг.2b). Во время смерти бактериальные нагрузки легких мышей, инфицированных БЦЖ в количестве 2×10 5 КОЕ, оказались по меньшей мере в 100 раз выше в сравнении с нагрузками мышей, инфицированных штаммом SO2 в количестве 5,4×10 6 КОЕ.

Пример 4. Количественные CD4+ и CD8+ ответные реакции вакцинированных мышей Balb/c

Для сравнения активации клеточного иммунитета, индуцированной вакцинацией штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ, на 7, 14, 30, 45 и 60 дни после вакцинации из селезенки групп, состоящих, по меньшей мере, из четырех мышей Balb/c, подкожно вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению и БЦЖ Phipps, собирали суспензии клеток и цитофлуорометрически определяли соотношения клеток CD4+ и CD8+ (Фиг.3). Вакцинация штаммом SO2 по сравнению с вакцинацией БЦЖ через 14 дней после вакцинации индуцировала значимо большее число клеток CD4+, а через 45 дней и значимо большее число клеток CD8+. Эти спленоциты стимулировали полными антигенами, полученными из культурального фильтрата M. tuberculosis. Через 3 дня популяции лимфоцитов анализировали с помощью проточной цитометрии и объединяли специфические антитела для определения CD4+/CD8+ клеток и внутриклеточного синтеза IFN- . Вакцинация штаммом SO2 по сравнению с БЦЖ через 45 дней после вакцинации индуцировала значимо большее количественное соотношение клеток, продуцирующих CD4+/IFN- + (Фиг.3). После определенного срока постоянно было выше количественное соотношение клеток, которые продуцировали CD8+/IFN- +, в группе, получившей SO2 (значимое различие на 14 день).

Пример 5. Протективный иммунитет, создаваемый штаммом SO2 по настоящему изобретению у мышей Balb/c

Имея доказательства, что штамм SO2 по настоящему изобретению был аттенуирован у мышей SCID, авторам было интересно определить, создало ли бы наблюдаемое снижение вирулентности некоторый вид защитных свойств у мутантного штамма. Подкожно вакцинировали мышей Balb/c штаммом SO2 по настоящему изобретению или БЦЖ (Pasteur). Через восемь недель после вакцинации всем мышам внутривенно ввели M. tuberculosis h47Rv в количестве 2,5×105 КОЕ. Через 4 недели после инъекции мышей забивали. Уровни защиты определяли, оценивая количество жизнеспособных M. tuberculosis h47Rv, полученных из легких и селезенки обеих групп мышей (Фиг.4). По сравнению с контролями, обработанными физиологическим раствором, обе вакцины привели к созданию схожих и все-таки значительных уровней протекции (р<0,05). Ингибирование роста M. tuberculosis h47Rv было отмечено и в легких, и в селезенке, снижение составило около 1,5 log 10 и 1,3 log10 КОЕ, соответственно.

Пример 6. Протективный иммунитет, создаваемый штаммом SO2 по настоящему изобретению у морских свинок

Результаты, полученные в экспериментах с вакцинацией мышей, указывают на то, что аттенуация штамма SO2 по настоящему изобретению создала его вакцине свойства, аналогичные свойствам БЦЖ Pasteur. Тем не менее, обычно считается, что морские свинки являются более подходящей моделью для туберкулеза человека, со многими аналогиями с точки зрения прогрессирования и патологии заболевания. Поэтому эта модель животных представляет собой более подходящую систему для оценки эффективности вакцины. Для изучения протективной эффективности штамма SO2 по настоящему изобретению авторы провели эксперименты, которые включали аэрозольную аппликацию для вакцинирования животных в низких дозах (10-50 КОЕ) и высоких дозах (500 КОЕ). Группы из шести морских свинок подкожно вакцинировали штаммом SO2 по настоящему изобретению или БЦЖ. Через десять недель после вакцинации всем морским свинкам вводили ингалируемые дозы M. tuberculosis h47Rv.

Животных, которые получили более низкую дозу, забивали через 4 недели и рассчитывали бактериальную нагрузку в легких и селезенке. Протективную эффективность определяли сравнением количества жизнеспособных M. tuberculosis h47Rv, полученных из органов морских свинок в каждой обработанной группе. В этом эксперименте снижение величин КОЕ в легких и селезенке существенно различалось между не вакцинированными контрольными животными и вакцинированными БЦЖ или штаммом M. tuberculosis SO2 (р=0,005). Тем не менее, между вакцинированными группами не было обнаружено значительного различия (Фиг.5).

Морских свинок, которые получили высокую дозу, забивали через 180 дней после аппликации или когда регистрировали снижение массы тела на 20%. Уровни протекции определяли сравнением сроков жизни морских свинок каждой обработанной группы. У вакцинированных/инфицированных морских свинок также исследовали прогрессирование развития поражений и сравнивали с тем, что наблюдали у невакцинированных/неинфицированных животных. Во время фазы эксперимента, следующей за ингаляцией, все не вакцинированные морские свинки и четыре морские свинки, вакцинированные BCG, были забиты в конечной точке, определенной человеком, до конечной точки окончания эксперимента (180 дней) по причине развития тяжелого прогрессирующего заболевания (Фиг.6а). Наоборот, все морские свинки, вакцинированные штаммом SO2 по настоящему изобретению, остались живы на протяжении всего исследования. Морские свинки, вакцинированные штаммом SO2 по настоящему изобретению, остались живы гораздо дольше, чем вакцинированные БЦЖ (p=0,018), которые, в свою очередь, оставались живы гораздо дольше, чем контрольные морские свинки, которых обрабатывали физиологическим раствором (р=0,0049). Более того, морские свинки, вакцинированные штаммом SO2, имели прибавку в весе и у них не наблюдалось ни одного видимого или клинического симптома заболевания.

Степень выраженности заболевания легких, оцениваемая общей консолидацией ткани легкого, также варьировала между различными обработанными группами. Максимальный уровень прогрессирования заболевания наблюдался, как и предполагалось, у не вакцинированных морских свинок, и в этой группе животных был определен средний процент консолидации 76% (Фиг.6b, 6c). У морских свинок, вакцинированных БЦЖ, также было четко выражено слияние гранулем со средней величиной консолидации 70%, измеренной в легких. Наоборот, у морских свинок, вакцинированных штаммом SO2 по настоящему изобретению, наблюдали меньшую консолидацию (около 50%), эта консолидация намного меньше (р<0,05), чем у не вакцинированных животных и вакцинированных БЦЖ (Фиг. 6с). Это облегчение тяжести заболевания также нашло отражение в количестве бактерий гомогенатов легкого и селезенки. В вакцинированных группах различие уровней ингибирования роста M. tuberculosis h47Rv обнаружили в обоих органах. Величины КОЕ, полученные от морских свинок, вакцинированных штаммом SO2, оказались сниженными более чем на 1×log10 по сравнению с величинами КОЕ от морских свинок, вакцинированных БЦЖ, и это снижение было статистически значимым (р<0,05) в селезенке (Фиг.6d). Эти данные указывают на то, что штамм SO2 по настоящему изобретению оказался эффективнее, чем БЦЖ, в отношении получения более высокой степени выживаемости инфицированных морских свинок, снижения тяжести заболевания легких и предотвращения распространения инфекции в селезенку.

Пример 7. Аттенуация штамма SO2 по настоящему изобретению обусловлена двойной мутацией PhoP-DIM-

Исследования с заражением мышей Balb/c внутривенным введением штамма SO2 (phoP-DIM-) в сравнении со штаммом МТ103 дикого типа и штаммом, дополненным phoP (SO2 + рSO5), показали, что аттенуация инфицирования SO2 у мышей Balb/c путем внутривенного введения не воспроизводится дополнением phoP. Уменьшение колоний (КОЕ) как в селезенке (7а селезенка), так и в легком (7b легкое), определенное через 3 и 6 недель, не воспроизводилось в дополненном штамме, хотя он и невирулентен для иммунокомпетентных мышей, эти эксперименты указывают на то, что неожиданная аттенуация могла быть вызвана второй дополнительной мутацией (Фиг.7).

Исследования липидов различных штаммов M. tuberculosis посредством тонкослойной хроматографии показали, что штамм SO2 не продуцирует DIM, и это не зависит от мутации phoP (Фиг.8).

Чтобы показать, что штамм SO2 нетоксичен, шесть морских свинок заражали 50-кратной дозой вакцины. После окончания 6-месячного эксперимента степень выживаемости составила 100%. Через 6 месяцев у всех животных была обнаружена прибавка веса, что указывает на нетоксичность штамма SO2 (Y= масса в граммах каждую неделю после инфицирования. Х= время в неделях) (Фиг.12).

Также исследовали чувствительность к противотуберкулезным лекарственным препаратам. Для следующих противотуберкулезных лекарственных препаратов: этамбутола, изониазида, рифампицина и стрептомицина, определяли минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) в отношении следующих штаммов M. tuberculosis: h47Rv, МТ103 (дикий тип) в качестве контроля и штамма SO2. Данные величины (микрограммы/мл) указывают на то, что после инактивации гена phoP кандидатный вакцинный штамм SO2 сохраняет свою чувствительность к большинству общеизвестных лекарственных препаратов, использующихся для лечения туберкулеза.

	Этамбутол	Изониазид	Рифампицин	Стрептомицин
h47Rv	2	0,5	<0,004	<0,5
МТ103	2	0,5	<0,004	<0,5
SO2	2	0,5	<0,004	<0,5

Исследования аттенуации на интратрахеально зараженных мышах Balb/c показали, что со штаммом M. tuberculosis DIM- (1A29) через 20 недель выжило 50% мышей. Все животные, зараженные штаммом SO2 (мутант phoP- и DIM-), удивительным образом выжили в течение 20 недель эксперимента (Фиг.11).

Пример 8. Защита штамма SO2 по настоящему изобретению обусловлена двойной мутацией PhoP-DIM-

Протекцию исследовали на морских свинках, вакцинированных и инфицированных аэрозолем с M. tuberculosis h47Rv. Выживаемость морской свинки через 300 дней. Для исследования выживаемости после подкожной вакцинации животных заражают вирулентным штаммом M. tuberculosis (h47Rv) в высокой дозе. Через 60 дней 6 морских свинок, которые не были вакцинированы, умерли, тогда как группы, вакцинированные штаммами SO2, phoP- и БЦЖ, выжили. Через 300 дней после заражения умерли 3 морские свинки, вакцинированные БЦЖ и phoP-, по сравнению с единственной свинкой из группы, вакцинированной штаммом SO2, что указывает на то, что защита мутанта phoP аналогична защите используемой в настоящее время вакцины БЦЖ, в то же время вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP- и DIM-, на модели морской свинки защищает эффективнее (Фиг.13).

Эти исследования протекции на морских свинках продолжались 400 дней, хотя 6 не вакцинированных морских свинок умерли через 60 дней. Через 400 дней после заражения из группы, вакцинированной штаммом SO2, выжили 3 морские свинки (Фиг.14а), тогда как выжила всего лишь 1 морская свинка, вакцинированная БЦЖ (Фиг.14а и Фиг.14b) и phoP- (Фиг.14b), вновь указывая на то, что защита мутанта phoP аналогична защите БЦЖ, в то время как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP- и DIM-, через 400 дней эксперимента защищает эффективнее.

Пример 9. Создание кандидатной противотуберкулезной вакцины, основанной на мутации делецией гена fadD26

Штаммами M. tuberculosis, использованными для создания мутанта делецией гена fadD26 ( fadD26), являются штамм SO2, который содержит ген phoP, инактивированный инсерцией устойчивой к канамицину кассеты, и клинический штамм МТ103.

1. Создание плазмид

1.1. Клонирование гена fadD26, который вовлечен в синтез DIM. Ген fadD26 амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК из M. tuberculosis h47Rv и используя праймеры fadD26Fw (SEQ ID NO:1) и fadD26Rv (SEQ ID NO:2). Для создания плазмиды рAZ1 продукт ПЦР встраивали в вектор рGEM-T Easy (Promega).

1.2. Делеция гена fadD26 и инсерция устойчивой к гигромицину кассеты. Для создания плазмиды рAZ3 в плазмиду рAZ1 между сайтами BamHI-EcoRV гена fadD26 встраивали фрагмент BamHI-EcoRV плазмиды pWM27 (Malaga et al. 2003), который содержит кассету res- hyg-res (сайты res, распознаваемые резолвазой , сделают возможным удаление резистентного маркера при втором пересеве).

1.3. Создание суицидального вектора для инактивации гена путем гомологичной рекомбинации. Плазмиду рAZ3 расщепляли рестриктазой XhoI, высвобождая инсерцию fadD26:: hyg, которую встраивали в вектор pJQ200X, линеаризованный тем же ферментом. Конечную плазмиду назвали рAZ5.

2. Создание штаммов M. tuberculosis DIM-

2.1. Плазмиду рAZ5 встраивали в штаммы M. tuberculosis SO2 и МТ103.

2.2. Селекция одинарных рекомбинантов. Культивирование в гигромицине (20 мкг/мл) бактерий, которые включают плазмиду, и проверка на их устойчивость к гентамицину (10 мкг/мл).

2.3. Селекция двойных рекомбинантов. Культивирование одинарных рекомбинантов в 2% растворе сахарозы (Pelicic et al. 1997) и гигромицине и проверка на их чувствительность к гентамицину.

3. Удаление из мутации fadD26 маркера устойчивости к антибиотику.

3.1. Для удаления кассеты res- hyg-res и продукции мутации без маркера устойчивости к антибиотику встраивают плазмиду pWM19, которая содержит резолвазу , и проводят селекцию на устойчивость к гентамицину, после чего плазмиду удаляют, инкубируя при 39°С в 2% растворе сахарозы (Malaga et al. 2003).

Пример 2.2. Штамм M. tuberculosis, использованный для создания двойного мутанта посредством делеции phoP fadD26, представляет собой МТ103 fadD26.

4. Создание плазмид

4.1. Клонирование гена phoP. Ген phoP амплифицировали посредством ПЦР, используя геномную ДНК M. tuberculosis h47Rv и праймеры phoPF (SEQ ID NO:3) и phoPR (SEQ ID NO:4). Для создания плазмиды рAZ11 продукт ПЦР встраивали в вектор pGEM-T Easy (Promega).

4.2. Делеция гена phoP и инсерция устойчивой к канамицину кассеты. Для создания плазмиды рAZ13 фрагмент BamHI-EcoRV плазмиды pCG122 (Malaga et al. 2003), который содержит кассету res- km-res, встраивали между сайтами Bc/I-EcoRV гена phoP в плазмиде рAZ11.

4.3. Создание суицидального вектора для инактивации гена с помощью гомологичной рекомбинации. Плазмиду рAZ13 расщепляли рестриктазой XhoI, высвобождая инсерцию phoP:: km, которую встраивали в вектор pJQ200X, линеаризованный тем же ферментом. Конечную плазмиду назвали рAZ15.

5. Создание штамма M. tuberculosis с двойной мутацией phoP fadD26.

5.1. Плазмида рAZ15 должна быть встроена в штамм M. tuberculosis МТ103 fadD26.

5.2. Селекция одинарных рекомбинантов. Культивирование в канамицине (20 мкг/мл) бактерий, которые включают плазмиду, и проверка на их устойчивость к гентамицину (10 мкг/мл).

5.3. Селекция двойных рекомбинантов. Культивирование одинарных рекомбинантов в 2% растворе сахарозы (Pelicic et al. 1997) и канамицине и проверка на их чувствительность к гентамицину.

6. Удаление из мутации phoP маркера устойчивости к антибиотику.

6.1. Для удаления кассеты res- km-res и продукции мутации без маркера устойчивости к антибиотику необходимо встроить плазмиду pWM19, которая содержит резолвазу , и провести селекцию на устойчивость к гигромицину (20 мкг/мл), после чего плазмида должна быть удалена инкубацией при 39°С в 2% растворе сахарозы (Malaga et al. 2003).

Литература

1. WHO. Global Report tuberculosis. Global tuberculosis control - surveillance, planning, financining. World Health Organization, Geneva, 2005.

http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/index.html.

2. WHO/IUATLD. Anti-Tuberculosis Drug Resistance in the World. Report no. 3: prevalence and trends. WHO/IUATLD. Global Project on Anti-Tuberculosis Drug Resistance Surveillance 1999-2002. World Health Organization and International Union Against Tuberculosis and Lung Disease, Geneva, 2004.

http://www.who.int/tb/publications/who_htm_tb_2004_343/en/index.html.

3. Young, D.B. Building a better tuberculosis vaccine. Nat Med 2003, 9(5), 503-504.

4. Fine, P.E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet 1995, 346(8986), 1339-1345.

5. Behr, M.A. BCG--different strains, different vaccines? Lancet Infect Dis 2002, 2(2), 86-92.

6. Pym, A.S., Brodin, P., Majlessi, L. et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med 2003, 9(5), 533-539.

7. Young, D.B. Current tuberculosis vaccine development. Clin Infect Dis 2000, 30 Suppl 3, S254-256.

8. Orme, I.M. Preclinical testing of new vaccines for tuberculosis: A comprehensive review. Vaccine 2006, 24(1), 2-19.

9. Kaufmann, S.H. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible? Nat Med 2000, 6(9), 955-960.

10. Britton, W.J. & Palendira, U. Improving vaccines against tuberculosis. Immunol Cell Biol 2003, 81(1), 34-45.

11. Pelicic, V., Jackson, M., Reyrat, J.M., Jacobs, W.R., Jr., Gicquel, B. & Guilhot, C. Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(20), 10955-10960.

12. Bardarov, S., Kriakov, J., Carriere, C. et al. Conditionally replicating mycobacteriophages: a system for transposon delivery to Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(20), 10961-10966.

13. Clark-Curtiss, J.E. & Haydel, S.E. Molecular genetics of Mycobacterium tuberculosis pathogenesis. Annu Rev Microbiol 2003, 57, 517-549.

14. Cole, S.T., Brosch, R., Parkhill, J. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 1998, 393(6685), 537-544.

15. Camacho, L.R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B. & Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol 1999, 34(2), 257-267.

16. Cox, J.S., Chen, B., McNeil, M. & Jacobs, W.R., Jr. Complex lipid determines tissue-specific replication of Mycobacterium tuberculosis in mice. Nature 1999, 402(6757), 79-83.

17. Sambandamurthy, V.K., Wang, X., Chen, B. et al. A pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis is highly attenuated and protects mice against tuberculosis. Nat Med 2002, 8(10), 1171-1174.

18. Smith, D.A., Parish, T., Stoker, N.G. & Bancroft, G.J. Characterization of auxotrophic mutants of Mycobacterium tuberculosis and their potential as vaccine candidates. Infect Immun 2001, 69(2), 1142-1150.

19. Groisman, E.A. The pleiotropic two-component regulatory system PhoP-PhoQ. J Bacteriol 2001, 183(6), 1835-1842.

20. Fields, P.I., Groisman, E.A. & Heffron, F. A Salmonella locus that controls resistance to microbicidal proteins from phagocytic cells. Science 1989, 243(4894 Pt 1), 1059-1062.

21. Soto, C.Y., Menendez, M.C., Perez, E. et al. IS6110 mediates increased transcription of the phoP virulence gene in a multidrug-resistant clinical isolate responsible for tuberculosis outbreaks. J Clin Microbiol 2004, 42(1), 212-219.

22. Gonzalo Asensio, J., Maia, C., Ferrer, N.L. et al. The virulence-associated two-component PhoP-PhoR system controls the biosynthesis of polyketide-derived lipids in Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem 2005.

23. Perez, E., Samper, S., Bordas, Y., Guilhot, C., Gicquel, B. & Martin, C. An essential role for phoP in Mycobacterium tuberculosis virulence. Mol Microbiol 2001, 41(1), 179-187.

24. Pym, A.S., Brodin, P., Brosch, R., Huerre, M. & Cole, S.T. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti. Mol Microbiol 2002, 46(3), 709-717.

25. Sambrook, J.a.R., DW. Molecular Cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001.

26. Arriaga, A.K., Orozco, E.H., Aguilar, L.D., Rook, G.A. & Hernandez Pando, R. Immunological and pathological comparative analysis between experimental latent tuberculous infection and progressive pulmonary tuberculosis. Clin Exp Immunol 2002, 128(2), 229-237.

27. Williams, A., Davies, A., Marsh, P.D., Chambers, M.A. & Hewinson, R.G. Comparison of the protective efficacy of bacille calmette-Guerin vaccination against aerosol challenge with Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis. Clin Infect Dis 2000, 30 Suppl 3, S299-301.

28. Hondalus, M.K., Bardarov, S., Russell, R., Chan, J., Jacobs, W.R., Jr. & Bloom, B.R. Attenuation of and protection induced by a leucine auxotroph of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 2000, 68(5), 2888-2898.

29. Horwitz, M.A., Lee, B.W., Dillon, B.J. & Harth, G. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92(5), 1530-1534.

30. Baldwin, S.L., D'Souza, C., Roberts, A.D. et al. Evaluation of new vaccines in the mouse and guinea pig model of tuberculosis. Infect Immun 1998, 66(6), 2951-2959.

31. Horwitz, M.A., Harth, G., Dillon, B.J. & Maslesa-Galic, S. Recombinant bacillus calmette-guerin (BCG) vaccines expressing the Mycobacterium tuberculosis 30-kDa major secretory protein induce greater protective immunity against tuberculosis than conventional BCG vaccines in a highly susceptible animal model. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97(25), 13853-13858.

32. Behr, M.A., Wilson, M.A., Gill, W.P. et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 1999, 284(5419), 1520-1523.

33. Mollenkopf, H.J., Kursar, M. & Kaufmann, S.H. Immune Response to Postprimary Tuberculosis in Mice: Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin Induce Equal Protection. J Infect Dis 2004, 190(3), 588-597.

34. Sampson, S.L., Dascher, C.C., Sambandamurthy, V.K. et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun 2004, 72(5), 3031-3037.

35. Horwitz, M.A. & Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect Immun 2003, 71(4), 1672-1679.

36. Brandt, L., Skeiky, Y.A., Alderson, M.R. et al. The protective effect of the Mycobacterium bovis BCG vaccine is increased by coadministration with the Mycobacterium tuberculosis 72-kilodalton fusion polyprotein Mtb72F in M. tuberculosis-infected guinea pigs. Infect Immun 2004, 72(11), 6622-6632.

37. Wiegeshaus, E.H., McMurray, D.N., Grover, A.A., Harding, G.E. & Smith, D.W. Host-parasite relationships in experimental airborne tuberculosis. 3. Relevance of microbial enumeration to acquired resistance in guinea pigs. Am Rev Respir Dis 1970, 102(3), 422-429.

38. Williams, A., Hatch, G.J., Clark, S.O. et al. Evaluation of vaccines in the EU TB Vaccine Cluster using a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb) 2005, 85(1-2), 29-38.

39. McShane, H., Pathan, A.A., Sander, C.R. et al. Recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing antigen 85A boosts BCG-primed and naturally acquired antimycobacterial immunity in humans. Nat Med 2004, 10(11), 1240-1244.

40. Kamath, A.T., Fruth, U., Brennan, M.J. et al. New live mycobacterial vaccines: the Geneva consensus on essential steps towards clinical development. Vaccine 2005, 23(29), 3753-3761.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантный микроорганизм комплекса Mycobacterium tuberculosis, отличающийся тем, что содержит инактивацию или делецию гена phoP и инактивацию или делецию гена fadD26 для профилактики туберкулеза у людей или животных.

2. Способ конструирования рекомбинантного микроорганизма по п.1, который включает:a) инактивацию или делецию гена phoP; иb) инактивацию или делецию гена fadD26.

3. Вакцина для иммунизации против туберкулеза, которая содержит эффективное количество рекомбинантного микроорганизма по п.1 и фармакологически приемлемые эксципиенты.

4. Способ получения вакцины по п.3 для иммунизации против туберкулеза, который включает, по меньшей мере:a) введение рекомбинантного микроорганизма по п.1 в подходящую среду для введения человеку или животным в терапевтически эффективной дозе;b) добавление эксципиентов, которые являются фармакологически приемлемыми для получения вакцин.

5. Применение рекомбинантного микроорганизма по п.1 для профилактики туберкулеза у людей или животных.

6. Применение рекомбинантного микроорганизма по п.1 в качестве вакцины для профилактики туберкулеза у людей или животных.

7. Применение рекомбинантного микроорганизма по п.1 для получения вакцины по п.3 для профилактики туберкулеза у людей или животных.

www.freepatent.ru

Смотрите также

• 
  Вакцина дюрамун
• 
  Ас вакцина
• 
  Вакцина сибиреязвенная
• 
  Хранение вакцин
• 
  Какую вакцину
• 
  Вакцина эувакс
• 
  Вакцина ротарикс
• 
  Вакцина вгв
• 
  Вакцина бешенство
• 
  Бешенство вакцина
• 
  Тримовакс вакцина