Производство противовирусных вакцин. Основные этапы производств. Производство вакцину вирусную

Способ производства вакцины против гриппа

Изобретение относится к области медицины и касается способа производства вакцины против гриппа. Сущность изобретения включает заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа, инкубацию, отбор вируссодержащей жидкости, очистку вируса гриппа, концентрирование и окончательную очистку вируса методом гель-фильтрации на колонке с носителем HW-65C. Очищенные вирионы разрушают детергентом β-октилглюкозидом, который затем удаляют. Три полуфабриката вакцины, полученные с использованием серотипов h2N1, h4N2 и В, объединяют так, чтобы содержание гемагглютинина каждого серотипа составляло около 30 мкг/мл. Преимущество изобретения заключается в удешевлении способа получения вакцины против вируса гриппа и повышении ее качества. 1 табл.

Изобретение относится к вирусологии, иммунологии, биотехнологии и медицине и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики против вирусов гриппа.

Вирус гриппа является возбудителем заболевания, которым каждый год болеют десятки миллионов людей на Земле. Этот вирус относится к группе ортомиксовирусов и состоит из поверхностных белков (гемагглютинина и нейроминидазы), вирусной липидной мембраны (состоящей из фосфолипидов), внутренних белков (мембранный белок, белок нуклеокапсида и белков полимераз) и РНК.

Главным способом борьбы с заболеванием гриппом является иммунопрофилактика при помощи различных вакцин. Вакцины для профилактики гриппа бывают живые (аттенуированные) и инактивированные (цельновирионные, субъединичные, расщепленные, виросомальные).

Известен способ получения живой гриппозной вакцины путем накопления вируса в аллантоисной полости развивающихся куриных эмбрионов с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, стабилизацией и лиофилизацией целевого продукта, раскрытый в авторском свидетельстве СССР №1743270, 1964. Аналогичный, по существу, способ раскрыт в патенте США №4338296, A61K 39/145, C12N 7/00, 1982. Однако данные способы не обеспечивают высокой иммуногенности целевого продукта, о чем, в частности, сообщается в Руководстве по вакцинному и сывороточному делу (М.: Медицина, 1978, с.232-236).

Известен способ производства инактивированных гриппозных вакцин с использованием адъюванта «МФ-59» (Banzhoff A, Influenza ORV, 2008, v.2, р.243-254). Недостатком указанного способа является повышенная реактогенность полученной вакцины по сравнению с аналогичной вакциной без адъюванта «МФ-59».

Наиболее близким аналогом является способ получения вакцины "Гриппол" по патенту РФ №2164148, A61K 39/145, A61K 39/385, 2000. Названный способ предполагает заражение куриных эмбрионов вирусами гриппа A1(h2N1), A2(h4N2) и В, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (далее - ВАЖ), концентрирование ВАЖ на эритроцитах, очистку вирионов в градиенте плотности сахарозы, расщепление вирионов детергентом ТТАБ, удаление внутренних структур вирионов методом ультрацентрифугирования, удаление детергента диализом, стерилизующая фильтрация полуфабрикатов, добавление полиоксидония, сведение и розлив вакцины. Указанный способ принят в качестве наиболее близкого аналога.

Целью заявляемого изобретения является оптимизация технологии производства, а также создание новых методов очистки и стабилизации гриппозных антигенов, удешевление способа получения вакцины против вируса гриппа, повышение качества препарата.

Поставленная цель достигается тем, что куриные эмбрионы заражают вирусом гриппа, инкубируют, отбирают вируссодержащую жидкость, с использованием формализированных эритроцитов реакторным способом очищают вирусы гриппа, концентрируют элюат на мембранах и проводят окончательную очистку вируса методом гель-фильтрации на колонке с носителем HW-65C (фирма ТОСО, Германия). Очищенные вирионы разрушают детергентом β-октилглюкозидом, который удаляют хроматографией на колонке с Сефадексом G-50, и центрифугируют. Стабилизированный таким образом препарат разводят фосфатным буфером до концентрации по белку не более 200 мкг/мл и проводят стерилизующую фильтрацию. Три полуфабриката вакцины, полученные предложенным способом с использованием серотипов A(h2N1), A(h4N2) и В, объединяют в одной емкости так, чтобы содержание гемагглютинина каждого серотипа составляло около 30 мкг/мл, и разливают по ампулам, получая тривалентный препарат.

Следует отметить, что реакторная технология очистки с помощью эритроцитов позволяет повысить технологичность способа получения вакцины против гриппа. Использование хроматографического носителя HW-65С улучшает качество гриппозной вакцины и позволяет снизить себестоимость ее производства. Дополнение технологического процесса центрифугированием позволяет увеличить стабильность препарата при хранении.

Пример 1

Для заражения использовали 10-11-дневные куриные эмбрионы, которым взвесь посевного вируса серотипа A(h2N1) вводили в хориоаллантоисную полость. Эмбрионы инкубировали при 35°С в течение 48 часов, с последующим выдерживанием при температуре 2-4°С в течение 15 часов. Для заражения использовали 12000 куриных эмбрионов, которым вводили по 0,2 мл взвеси возбудителя с инфекционным титром около 104 ЭИД50/мл. После инкубации и охлаждения куриных эмбрионов отбирали вируссодержащую аллантоисную жидкость в асептических условиях. Из 12000 куриных эмбрионов получили около 100 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, из которой вирус сорбировали в реакторе на формалинизированных эритроцитах при 2-4°С в течение 15 часов. После оседания эритроцитов надосадочную жидкость декантировали, а к осадку добавили около 100 л охлажденного до 2-4°С физиологического раствора. Через 15 часов надосадочную жидкость повторно декантировали, а к осадку эритроцитов добавили около 10 л физиологического раствора с температурой 35°С и осуществляли перемешивание в течение 5 часов при той же температуре. Для отделения эритроцитов от элюата осуществляли центрифугирование взвеси при охлаждении. В результате обработки было получено около 9,5 л элюата с титром вируса 1/8192. При этом концентрация гемагглютинина составила 99,4 мкг/мл.

Полученный элюат концентрировали до объема 1000 мл, концентрат очищали гель-фильтрацией с использованием носителя HW-65C. Объем собранного препарата составил 1500 мл при концентрации гемагглютинина по ОРИД - 440 мкг/мл.

Полученные вирионы разрушали β-октилглюкозидом. Для этого к 1500 мл препарата добавили 12,0 г детергента, растворенного в 100 мл стерильной воды, и 1500 мл фосфатного буфера, pH 7,2. Образовавшуюся смесь инкубировали 30 минут при 37°С, после чего лизат концентрировали до объема 1 л.

От детергента освобождались гель-фильтрацией на носителе «Сефадексе G-50».

Очищенный расщепленный препарат собрали в объеме 1400 мл в пике свободного объема колонки и центрифугировали при 80000 g в течение 90 мин для стабилизации препарата. Препарат был разведен так, чтобы концентрация белка была ниже 200 мкг/мл, и подвергнут стерилизующей фильтрации.

Пример 2

Для заражения куриных эмбрионов используют посевной вирус гриппа серотипа В, который готовят с учетом рекомендаций ВОЗ. Для заражения используют 10-11-дневные куриные эмбрионы, которым вводят взвесь вируса в объеме 0,2 мл в хориоаллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при 39°С в течение 72 часов, с последующим выдерживанием при температуре 2-4°С в течение 19 часов. Для заражения использовали 14000 куриных эмбрионов, которым вводили по 0,2 мл взвеси возбудителя с инфекционным титром около 104 ЭИД50/мл. После инкубации и охлаждения куриных эмбрионов отбирали вируссодержащую аллантоисную жидкость в асептических условиях. Из 14000 куриных эмбрионов получили около 120 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, из которой вирус сорбировали в реакторе на формалинизированных эритроцитах при 2-4°С в течение 19 часов. После оседания эритроцитов надосадочную жидкость декантировали, а к осадку добавили около 100 л охлажденного физиологического раствора. Через 19 часов надосадочную жидкость повторно декантировали, а к осадку эритроцитов добавили около 10 л физиологического раствора с температурой 39°С и осуществляли перемешивание в течение 5 часов при той же температуре. Для отделения эритроцитов от элюата осуществляли центрифугирование взвеси при охлаждении. В результате обработки было получено около 10,0 л элюата с титром вируса 1/8192. При этом концентрация гемагглютинина составила 96,4 мкг/мл.

Полученный элюат концентрировали до объема 1000 мл, концентрат очищали гель-фильтрацией с использованием носителя HW-65C. Объем собранного препарата составил 1500 мл при концентрации гемагглютинина по ОРИД - 435 мкг/мл.

Полученный препарат очищенных вирионов разрушали β-октилглюкозидом. Для этого к 1500 мл препарата добавили 12,0 г детергента, растворенного в 100 мл стерильной воды, и 1500 мл фосфатного буфера, pH 7,2. Полученную смесь инкубировали 30 минут при 37°С, после чего лизат концентрировали до объема 1 л.

От детергента освобождались гель-фильтрацией на носителе «Сефадексе G-50». Очищенный расщепленный препарат собрали в объеме 1500 мл в пике свободного объема колонки и центрифугировали при 80000 g в течение 90 мин для стабилизации препарата. Препарат был разведен так, чтобы концентрация белка была ниже 200 мкг/мл, и подвергнут стерилизующей фильтрации.

Пример 3

Для заражения использовали 10-12-дневные куриные эмбрионы, которым взвесь посевного вируса серотипа A(h4N2) вводили в хориоаллантоисную полость. Эмбрионы инкубировали при 37°С в течение 50 часов, с последующим выдерживанием при температуре 2-4°С в течение 17 часов. Для заражения использовали 12000 куриных эмбрионов, которым вводили по 0,2 мл взвеси возбудителя с инфекционным титром около 104 ЭИД50/мл. После инкубации и охлаждения куриных эмбрионов отбирали вируссодержащую аллантоисную жидкость в асептических условиях. Из 12000 куриных эмбрионов получили около 100 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, из которой вирус сорбировали в реакторе на формалинизированных эритроцитах при 2-4°С в течение 17 часов. После оседания эритроцитов надосадочную жидкость декантировали, а к осадку добавили около 100 л охлажденного до 2-4°С физиологического раствора. Через 17 часов надосадочную жидкость повторно декантировали, а к осадку эритроцитов добавили около 10 л физиологического раствора с температурой 37°С и осуществляли перемешивание в течение 5 часов при той же температуре. Для отделения эритроцитов от элюата осуществляли центрифугирование взвеси при охлаждении. В результате обработки было получено около 10 л элюата с титром вируса 1/8192. При этом концентрация гемагглютинина составила 99,4 мкг/мл.

Полученный элюат концентрировали до объема 1000 мл, концентрат очищали гель-фильтрацией с использованием носителя HW-65C. Объем собранного препарата составил 1500 мл при концентрации гемагглютинина по ОРИД - 440 мкг/мл.

Полученные вирионы разрушали β-октилглюкозидом. Для этого к 1500 мл препарата добавили 12,0 г детергента, растворенного в 100 мл стерильной воды, и 1500 мл фосфатного буфера, pH 7,2. Образовавшуюся смесь инкубировали 30 минут при 37°С, после чего лизат концентрировали до объема 1 л. От детергента освобождались гель-фильтрацией на носителе «Сефадекс G-50». Очищенный расщепленный препарат собрали в объеме 1400 мл в пике свободного объема колонки и центрифугировали при 80000 g в течение 90 мин для стабилизации препарата. Препарат был разведен так, чтобы концентрация белка была ниже 200 мкг/мл, и подвергнут стерилизующей фильтрации.

Пример 4

Для определения антигенной активности вакцин против гриппа, полученных заявляемым способом и способом, используемым в производстве (патент РФ №2164148), шести беспородным белым мышам массой 18-20 г двукратно внутрибрюшинно с интервалом 14 суток вводили по 0,5 мл вакцины. Через 12-14 суток после повторной иммунизации полученные сыворотки мышей исследовали с гомологичными антигенами вакцины в РТГА по МУ 3.3.2.1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа". Препарат должен вызывать нарастание антител в титрах не ниже 1:40 к каждому из трех входящих в ее состав штаммов вирусов гриппа типа А и В. В качестве контроля брали смесь сывороток от 2-3 неиммунных мышей.

Как видно из результатов, приведенных в таблице, вакцина, произведенная по предлагаемому способу, обладает более высокой антигенной активностью, чем вакцина, произведенная по технологии производства коммерческой вакцины «Гриппол».

Пример 5

Для изучения профилактической эффективности предлагаемой вакцины в многоцентровом, контролируемом, проспективном, рандомизированном исследовании приняли участие 5611 добровольцев (мужчины и женщины) в возрасте от 18 лет и старше, рандомизированных в две группы в соотношении 1,2:0,8. Указанные группы были сформированы в городах Санкт-Петербург, Томск и Пермь. Основная группа добровольцев 3107 человек (группа вакцинированных) была привита предлагаемой вакциной 45 мкг/доза, группе наблюдения численностью 2504 человека препарат не вводили.

В случае заболевания и лабораторного подтверждения диагноза «Грипп» у добровольцев была сопоставлена заболеваемость, оценены клиническое течение и тяжесть заболевания, возникновение осложнений.

В основной и контрольной группах добровольцев на всем протяжении исследования проводили оценку заболеваемости и тяжести клинического течения гриппа, а также осуществляли дифференциальную диагностику гриппа с другими вирусными и бактериальными инфекциями. Грипп диагностировали на основании клинических данных, а именно выявления основных симптомов: высокая температура, достигающая 39-40°С, длительностью около 3-4 дней; озноб; насморк; першение и боль в горле; сухой, лающий кашель, который сохранялся в течение 2 недель; общая выраженная слабость, недомогание, разбитость; боль и «ломота» в мышцах и суставах; одышка; боль при движении глаз; конъюнктивит.

Кроме того, для подтверждения клинического диагноза «Грипп» среди вакцинированных и невакцинированных участников исследования проведены лабораторно-серологические исследования парных сывороток в первые дни заболевания и через 14-21 день, а также оценены клиническое течение и тяжесть заболевания.

Согласно санитарным правилам (Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов. Санитарные правила СП 3.3.2.561-96, М., 1998) профилактическую эффективность вакцины оценивали по двум показателям: индексу эффективности и коэффициенту эффективности.

Проведенный анализ заболеваемости гриппом и ОРВИ в эпидемический сезон 2007-2008 гг. у привитых добровольцев и наблюдательной группы (невакцинированные) в г.Санкт-Петербург, Томске и Пермь позволил рассчитать профилактическую эффективность предлагаемой вакцины. Коэффициент эффективности вакцины в отношении лабораторно-подтвержденного гриппа составил 86,5%, а индекс эффективности - 7,4.

Из литературы известно, что в процессе эпидемиологических исследований вакцины, взятой за прототип (коммерческая вакцина «Гриппол») (Вакцины и лекарственные препараты, www.medep.ru), коэффициент профилактической эффективности составил - 59,3%, а индекс эффективности - 2,0.

По нашему мнению, более высокие значения профилактической эффективности предлагаемой вакцины по сравнению с коммерческой вакциной связаны с тем, что предлагаемая вакцина дополнительно содержит внутренние антигены возбудителя в нативном состоянии. Полученные результаты дают основания считать, что предлагаемая комбинация поверхностных и внутренних антигенов вируса гриппа обеспечивает получение высокоэффективного клеточного и гуморального иммунитета у привитых добровольцев и у лабораторных животных.

В результате проведенных клинических исследований было доказано, что предлагаемый способ производства вакцины обеспечивает получение безопасного и высокоиммуногенного препарата, обладающего высокой профилактической эффективностью и ареактогенностью.

Способ получения вакцины против вируса гриппа, включающий заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа, инкубацию, отбор вируссодержащей жидкости, концентрирование и очистку вируса, разрушение вируса детергентом β-октилглюзидом, удаление детергента методом гельфильтрации, стерилизующую фильтрацию расщепленного препарата, сведение и розлив вакцины, отличающийся тем, что предварительную очистку вирионов с использованием формализированных эритроцитов осуществляют реакторным методом, окончательную очистку вирионов осуществляют методом гельфильтрации на колонке с носителем HW-65C, а стабилизацию очищенного расщепленного препарата осуществляют ультрацентрифугированием.

www.findpatent.ru

Производство противовирусных вакцин. Основные этапы производств

Содержание:

Введение…………………………………………………………………………3

1. Определение вакцин………………………………………………………….4

2. Классификация вакцин……..……………..………………………………….5

3. Требования к производству вакцин…….…………………………….……12

4. Методы получения современных вакцин……………..……………...…....15

5. Производство противовирусных вакцин. Основные этапы производств.18

6. Заключение………………………………………………………………........22

7. Список литературы……….…………………………………………………24

Введение

«Величайший успех, который  нельзя увидеть,- все люди, которые  не страдают и не умирают от вакциноконтролируемых заболеваний».

 Вальтер Оренстейн.

Инфекционные болезни  во все времена были главными врагами  человека. История знает множество  примеров опустошительных последствий  оспы, чумы, холеры, тифа, дизентерии, кори, гриппа. Достаточно вспомнить, что упадок Древней Греции и Рима связан не столько с войнами, которые они  вели, сколько с чудовищными эпидемиями чумы, уничтожившими большую часть  населения. В XIV веке чума погубила треть населения Европы. Из-за эпидемии натуральной оспы через 15 лет после нашествия Кортеса от30-миллионной империи инков осталось менее 3 млн человек. Пандемия гриппа (так называемой «испанки») в 1918–1920 годах унесла жизни около 40 млн человек, а число заболевших составило около 500 млн человек. Это больше, чем потери на полях сражений Первой мировой войны, где погибли 8 млн 400 тыс. и были ранены 17 млн человек.

В поисках средств против инфекционных заболеваний люди испробовали многое — от заклинаний и заговоров до дезинфицирующих средств и карантинных мер. Однако только с появлением вакцин началась новая эра борьбы с инфекциями. [8]

Цель работы: - изучение вакцин их свойств и способов получения.

Задачи: - Рассмотреть, что такое вакцины;

               - Рассмотреть номенклатуру и  классификацию;

                - Рассмотреть промышленное производство  получения современных вакцин.

1 Определение. Историческая справка

Вакцина (от лат. vacca — корова) — медицинский или ветеринарный препарат, предназначенный для создания иммунитета к инфекционным болезням. Вакцина изготавливается из ослабленных или убитых микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности, или из их антигенов, полученных генно-инженерным или химическим путём.

Вакцинация стимулирует  адаптивный иммунный ответ путем  образования в организме специфических  клеток памяти, поэтому последующая  инфекция тем же агентом вызывает стойкий, более быстрый иммунный ответ. Для получения вакцин используют штаммы патогенов, убитые или ослабленные, их субклеточные фрагменты или анатоксины. [5]

Первая вакцина получила свое название от слова vaccinia (коровья оспа) — вирусная болезнь крупного рогатого скота. Английский врач Эдвард Дженнер впервые применил на мальчике Джеймсе Фиппсе вакцину против натуральной оспы, полученную из пузырьков на руке больного коровьей оспой, в 1796 г. Лишь спустя почти 100 лет (1876—1881) Луи Пастер сформулировал главный принцип вакцинации — применение ослабленных препаратов микроорганизмов для формирования иммунитета против вирулентных штаммов.

Некоторые из живых вакцин были созданы советскими учеными, например, П.Ф. Здродовский создал вакцину против сыпного тифа в 1957—1959 годах. Вакцину против гриппа создала группа ученых: А.А. Смородинцев, В.Д. Соловьев, В.М. Жданов в 1960 году. П.А. Вершилова в 1947—1951 годах создала живую вакцину от бруцеллёза. [8]

2 Классификация  вакцин

В основе классификации вакцин лежит принцип разделения по входящему  в их состав антигену.

Различают 8 групп вакцин:

   1. Живые вакцины.

   2. Инактивированные  корпускулярные (цельновирионные) вакцины.

   3. Химические вакцины.

   4. Анатоксины.

   5. Конъюгированные  вакцины.

   6. Вакцины с искусственными  адъювантами.

   7. Комбинированные  вакцины.

   8. Генно-инженерные  вакцины.

Живые  вакцины

Они содержат ослабленный  живой  микроорганизм. Могут быть получены путем селекции (БЦЖ, гриппозная). Они способны размножаться в организме и вызывать вакцинальный процесс, формируя невосприимчивость. Утрата вирулентности у таких штаммов закреплена генетически, однако у лиц с иммунодефицитами могут возникнуть серьезные проблемы. Как правило, живые  вакцины  являются корпускулярными. Живые  вакцины  получают путем искусственного аттенуирования (ослабления штамма (BCG - 200-300 пассажей на желчном бульоне, ЖВС - пассаж на ткани почек зеленых мартышек) либо отбирая естественные авирулентные штаммы. В настоящее время возможен путь создания живых вакцин путем генной инженерии на уровне хромосом с использованием рестриктаз. Полученные штаммы будут обладать свойствами обеих возбудителей, хромосомы которых были взяты для синтеза. Анализируя свойства живых вакцин следует выделить, как положительные так и их отрицательные качества.

Положительные стороны: по механизму  действия на организм напоминают "дикий" штамм, может приживляться в организме  и длительно сохранять иммунитет (для коревой  вакцины  вакцинация в 12 мес. и ревакцинация в 6 лет), вытесняя "дикий" штамм. Используются небольшие дозы для вакцинации (обычно однократная) и поэтому вакцинацию легко проводить организационно. Последнее позволяет рекомендовать данный тип  вакцин  для дальнейшего использования.

Отрицательные стороны: живая   вакцина  корпускулярная - содержит 99% балласта и поэтому обычно достаточно реактогенная, кроме того, она способна вызывать мутации клеток организма (хромосомные аберрации), что особенно опасно в отношении половых клеток. Живые  вакцины  содержат вирусы-загрязнители (контаминанты), особенно это опасно в отношении обезьяннего СПИДа и онковирусов. К сожалению, живые  вакцины  трудно дозируются и поддаются биоконтролю, легко чувствительны к действию высоких температур и требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи. 

Хотя живые  вакцины требуют специальных условий хранения, они продуцируют достаточно эффективный клеточный и гуморальный иммунитет и обычно требуют лишь одно введение. Большинство живых  вакцин вводится парентерально (за исключением полиомиелитной  вакцины).

На фоне преимуществ живых  вакцин  имеется и одно предостережение, а именно: возможность реверсии вирулентных форм, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. По этой причине живые  вакцины должны быть тщательно протестированы. Пациенты с иммунодефицитами (получающие иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны получать такие  вакцины.

Примером живых  вакцин  могут служить  вакцины  для профилактики краснухи, кори, полиомиелита, туберкулеза, паротита. Живые  вакцины  выпускаются в лиофилизированном виде (кроме полиомиелитной). [2]

Инактивированные (убитые)  вакцины

Инактивированные вакцины  получают путем воздействия на  микроорганизмы  химическим путем  или нагреванием. Такие  вакцины  являются достаточно стабильными и  безопасными, так как не могут  вызвать реверсию вирулентности. Они  часто не требуют хранения на холоде, что удобно в практическом использовании. Однако у этих  вакцин  имеется  и ряд недостатков, в частности, они стимулируют более слабый иммунный ответ и требуют применения нескольких доз. Они содержат либо убитый целый  микроорганизм  (например, цельноклеточная  вакцина против коклюша, инактивированная  вакцина против бешенства,  вакцина против вирусного гепатита А), либо компоненты клеточной стенки или других частей возбудителя, как например в ацеллюлярной вакцине против коклюша, коньюгированной  вакцине против гемофилусной инфекции или в вакцине против менингококковой инфекции. Их убивают физическими (температура, радиация, ультрафиолетовый свет) или химическими (спирт, формальдегид) методами Еще одним недостатком инактивированной вакцины является то, что микробный штамм не приживляется, поэтому вакцина слабая и вакцинация проводится в 2 или 3 приема, требует частых ревакцинаций, что труднее в плане организации по сравнению с живыми вакцинами. Инактивированные вакцины выпускают как в сухом (лиофилизированном), так и в жидком виде.

Инфекции, для профилактики которых используются инактивированные вакцины: бешенство, грипп, клещевой энцефалит, коклюш, холера, гепатит А, герпес, брюшной тиф, лептоспироз, сыпной тиф.     [1]

Химические  вакцины

Представляют собой наиболее активные антигены, извлекаемые из микробных клеток с помощью кислот, спиртов, ферментов или разрушением  вирионов с помощью физических или  химических методов. Для очистки  выделенных антигенов используют ультрафильтрацию, центрифугирование, гель фильтрацию, хромотографию на ионообменниках  и аффинную хромотографию. Достигается высокая - до 95% – степень очистки вакцины.

Основной принцип заключается  в выделении протективных антигенов и очистка их  от балластных веществ, что обеспечивает развитие надежного иммунитета.

Преимущество химических вакцин – их потенциальная нереактогенность и безвредность в отличие от живых или убитых вакцин, у которых сохраняется носитель генетический информации, и поэтому, у живых вакцин имеется опасность реверсии к дикому типу. Химические вакцтны более стабильны и могут вводится в больших дозах без побочных эффектов. Для повышения иммуногенности химических вакцин применяют адъюванты, которые способствуют длительному циркулированию протективного антигена в организме.[3]

Инфекции, для профилактики которых используют химические вакцины: грипп, менингококковая инфекция, брюшной  тиф, холера, вирус ящера и клещевого  энцефалита.[1]

Анатоксины.

Представляют собой бактериальные  экзотоксины, обезвреженные длительным воздействием формалина при повышенной температуре.

Подобная технология получения  анатоксинов позволяет сохранять  антигенные и иммуногенные свойства токсинов, делает невозможной реверсию их токсичности. При этом периодически необходимо проверять возможную реверсию их токсичности. В процессе производства анатоксины подвергают очистке от балластных веществ (питательной среды, других продуктов метаболизма и распада микробной клетки) и концентрации. Эти процедуры снижают их реактогенность и позволяют использовать для иммунизации небольшие объемы препарата. Впервые анатоксины (дифтерийный и столбнячный) были получены  французским ученым Рамоном в 1916 году.

Очищенный от балластных веществ  и концентрированный анатоксин  сорбируют на гидроксиде алюминия.

Анатоксины обеспечивают формирование антитоксического иммунитета, который, естественно, уступает иммунитету, образующемуся посл перенесения заболевания, и не предотвращают явления бактерионосительства. 

Инфекции, для профилактики которых применяют анатоксины: дифтерия, столбняк, газовая гангрена, холера, ботулизм, стафилококковые и синегнойные  инфекции.[1]

Конъюгированные вакцины.

  Некоторые бактерии, вызывающие такие опасные заболевания, как менингиты или пневмонию, имеют антигены, трудно распознаваемые незрелой иммунной системой новорожденных и грудных детей. В конъюгированных  вакцинах  используется принцип связывания таких антигенов с протеинами или анатоксинами другого типа микроорганизмов, хорошо распознаваемых иммунной системой ребенка. Протективный иммунитет вырабатывается против конъюгированных антигенов.

На примере  вакцин  против менингита  показана эффективность  в снижении заболеваемости Hib-менингитами  детей до 5-ти лет в США за период с 1989 по 1994 г.г. с 35 до 5 случаев.

В практике вакцинопрофилактики существует две конъюгированные вакцины – вакцина против гемофильной типа Б инфекции и менингококковая вакцина группы С. Разрабатывается также брюшнотифозная конъюгированная вакцина. [1]

Вакцины с искусственными адъювантами.

Принцип создания заключается  в использовании естественных антигенов  и синтетических носителей. Одним  из вариантов таких вакцин является гриппозная вакцина, состоящая из белков вируса гриппа (гемаглютинина и нейроминидазы) и искусственного иммуномодулятора – полиоксидония, обладающего выраженными адъювантными свойствами.[1]

Комбинированные вакцины

Разработка комбинированных  вакцин обычно проводится на основе существующих монопрепаратов. К комбинированным вакцинам, выпускаемым в России, относятся вакцины АКДС, менингококковая А+С, а также АДС анатоксины. Пермское НПО «БИОМЕД» совместнос НПК «Комбиотех» разработали комбинированные вакцины Бубо-М и Бубо-Кок для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В.За рубежом выпускатся вакцины против коклюша, дифтерии, столбняка и полиомиелита – Тетракок 05; вакцину против столбняка, коклюша, дифтерии, полиомиелита и гемофильной инфекции типа В – ПЕНТАктХИБ; вакцину против кори, краснухи, эпидемического паротита – ММR, Приорикс.

Необходимо подчеркнуть, что комбинированные препараты  внедряются в медицинскую практику только в том случае, если результаты, полученные при их клиническом испытании, свидетельствуют, что их антигенная активность не отличается от антигенной активности монопрепаратов, а чаще всего превышает, и при этом не происходит потенцирования реактогенности.

Генно-инженерные вакцины.

Принцип создания генно-инженерных вакцин заключается в том, что  в геном живых аттенуированных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток эукариотов встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина.

myunivercity.ru

  Глава 4 КРУПНОМАСШТАБНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ

Южной Америки ежегодно вырабатывали до 600 млн. доз моновалентной инактивированной противоящурной вакцины [1114]. Для этой цели необходимо еженедельно получать около 20 ООО л суспензионной культуры клеток ВНК-21. До недавнего времени производство большинства вирусных препаратов основывалось на использовании первичных культур клеток из нормальных тканей различных видов домашних и лабораторных животных. Кроме того, в качестве клеточных субстратов для производства вакцин, применяемых в медицине, использовали немногие линии диплоидных клеток с ограниченной жизненной потенцией. Широкое применение таких препаратов в медицине и ветеринарной практике дало возможность достичь больших успехов в борьбе со многими опасными вирусными болезнями человека и животных. Однако первичные культуры клеток во многих отношениях не являются перспективными клеточными субстратами. Их приготовление связано с периодическим убоем животных и необходимостью выделения клеток из тканей. Первичные культуры отличаются нестандартностью, таят в себе опасность в отношении эндогенной контаминации различными вирусами и микроорганизмами. Наконец, их сложно выращивать в условиях крупносерийного производства. Отмеченные трудности значительно возрастают в связи с тенденцией постоянного увеличения масштабов изготовления противовирусных препаратов. Кроме того, в последнее время все более широкое развитие получает разработка концентрированных и субъединичных вакцин, при изготовлении которых требуется большое количество вирусного материала. Естественно, что стоящая задача может быть решена лишь путем использования постоянных (перевиваемых) линий клеток, отличающихся способностью к бесконечной пересеваемо- сти вне организма, высокой стандартностью, низкой стоимостью, относительной простотой трансфекции рекомбинантной ДНК и последующего клонирования высокоэффективных продуцентов, высокой вероятностью правильного посттрансляционного процессинга вновь синтезируемых белков, кодируемых трансфецирующей ДНК. Ветеринарная наука в течение последней четверти века накопила большой опыт в изготовлении вирусных вакцин с использованием в качестве субстрата для размножения вирусов культур постоянных линий клеток животных. Особый успех достигнут в изготовлении инактивированной противоящурной вакцины. Производство вакцин против ящура имеет наиболее цитируемую технологию. Она основана на использовании линии трансформированных клеток новорожденного хомяка, выращиваемых в суспензии. Эта технология достаточно экономична, ее выполняют в биореакторах большой емкости [1114]. Накоплены определенные доказательства безопасности некоторых постоянных клеточных линий, используемых в качестве субстрата в производстве ряда биологических препаратов. Например, инактивированную противо- ящурную вакцину готовят из вируса, выращенного в культуре постоянной линии клеток почки новорожденного хомяка (линия ВНК-21). Более чем за 20- летний период этой вакциной привито свыше 100 млн. голов крупного рогатого скота и не обнаружено каких-либо нарушений у привитых животных, по крайней мере, в течение 2—4 лет после введения вакцины. Имеется много других примеров безопасности применения инактивированных и даже живых вакцин против ряда болезней животных, приготовленных из вирусов, размноженных в культурах различных постоянных линий клеток. Применение биологических препаратов, полученных на основе перевиваемых клеточных линий, в медицине началось намного позже, чем в ветеринарной практике. Несмотря на очевидные преимущества постоянных линий клеток, медицинская практика до недавнего времени воздерживалась от их применения в производстве вирусных вакцин [102]. Причина заключалась в том, что, согласно существовавшему мнению, для изготовления медицинских вирусных вакцин можно было использовать клетки из тканей только клинически здоровых животных. Производство таких вакцин ограничивалось использованием первичных и диплоидных культур клеток. В диплоидных линиях клеток человека никогда не были обнаружены латентные вирусы или спонтанная трансформация клеток. Основное возражение против использования постоянных клеточных линий для репликации вирусов и векторных рекомбинатов в производстве вирусных вакцин медицинского назначения заключалось в их возможной онкогенности [48] из-за контаминации вакцин клеточной ДНК или генными продуктами (регуляторными белками). Интеграция гетерогенной ДНК может привести к предзлокачествен- ным изменениям в результате активации протоонкогенов, запуску онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии. В процессе репродукции вакцинных штаммов для живых вакцин с использованием клеточных линий, латентно кон- таминированных другими вирусами, могут появляться вирусные гибриды с неожиданными свойствами [1721]. Этот вопрос рассматривался неоднократно на различных научных форумах в Европе и Северной Америке. Ценность постоянных клеточных линий в качестве субстратов стала особенно очевидной благодаря успехам, достигнутым в последнее время в области фундаментальных биологических исследований, а также в связи с перспективой их использования в рекомбинантной ДНК-техноло- гии и получении генно-инженерных биопрепаратов. Общая тенденция к применению постоянных клеточных линий в производстве медицинских иммунобиологических препаратов наметилась на рубеже 70—80-х годов. Так, в 1978 г. в Лейк-Плесиде (США) было предложено использовать лимфобластоидные клетки человека для крупномасштабного производства альфа-интерферона. В 1981 г. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов одобрил применение неопухолевых и неконтаминированных вирусами постоянных клеточных линий для производства инактивированной полиомиелитной вакцины, а затем также для инактивированной вакцины против бешенства. Такое решение дало возможность в короткий срок разработать методы крупномасштабного выращивания вирусов с использованием микроносителей и создать высокоэффективные вирусные вакцины. В истории создания биологических препаратов ключевая роль всегда принадлежала выбору приемлемо безопасных вариантов. Решение о применениилюдям биопрепаратов, полученных с использованием постоянных клеточных линий, основывалось на оценке различными комитетами выгод и риска, связанных с созданием новых препаратов, по сравнению с существующими. Важнейшие потенциальные факторы риска, связанные с биологическими препаратами, производимыми на постоянных клеточных линиях, можно разделить на три категории: примесь гетерогенной ДНК, вирусы и трансформирующие белки. Одним из основных вопросов, требующих самого пристального внимания, является потенциальная долгосрочная опасность, связанная с присутствием в препаратах примесей гетерогенных ДНК, особенно в тех случаях, когда последние могли содержать потенциально онкогенные кодирующие или регуляторные последовател ьности. Однако, вероятность того, что ДН К из постоянных клеточных линий способна вызывать опухоли у людей, считается крайне низкой. Даже подкожное введение людям больших количеств клеток HeLa не сопровождалось канцерогенным действием. Анализ имеющихся экспериментальных данных показывает, что концентрация ДНК в культуральных жидкостях постоянных линий клеток гораздо ниже возможных трансформирующих уровней [14]. Совещание экспертов ВОЗ в Лондоне в 1989 г. определило, что предельное содержание гетерогенной ДНК (из клеточных систем и сконструированных векторов) в одной парентеральной дозе вакцин медицинского назначения не должно превышать 100 пкг. Подкожное введение 2 мкг ДНК вируса полиомы вызывает образование опухолей у 50% чувствительных животных. 100 пкг гетерогенной ДНК составляет 0,5х10'4 туморогенной дозы. Контаминирующая ДНК способна подавлять супрессорные гены или активировать протоонкогены после интеграции в клеточный геном. Риск мало зависит от происхождения контаминирующей ДНК. Все последовательности ДНК, обладающие характеристиками сильных промоторов, могут после рекомбинации создавать одинаковый риск. Вероятность присутствия опасной активности на 1 молекулу ДНК составляет 10'16—10~19. Особую опасность могут представлять мно- гокопийные плазмиды, амплифицированные сильные промоторные последовательности. Белковые контаминанты с коротким сроком жизни представляют меньший риск [788]. Таким образом, принято считать, что риск, связанный с примесью гетерогенной клеточной ДНК, ничтожен, если ее количество не превышает 100 пкг в одной дозе препарата, вводимого парентерально. При оральном применении вакцины этот риск еще более снижается [1684]. Агенты, применяемые для инактивации вирусов в вакцинах, могут снижать или устранять биологическую активность гетерогенной клеточной ДНК, повышая тем самым их безопасность даже в тех случаях, когда количество ДНК в дозе вакцины, вводимой парентерально, превышает 100 пкг [154]. Кроме того, современные методы очистки вирусных препаратов позволяют снизить содержание клеточной ДНК до уровня, при котором ее присутствие даже теоретически не представляет опасности. Высокая степень очистки от клеточной ДНК (10 пкг/мл) достигнута при изготовлении лимфобластоидного интерферона, вакцины против полиомиелита на клетках Vero и поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках СНО [14].

Риск, обусловленный вирусной контаминацией постоянных линий клеток, может быть связан с полными вирусами, механизм репликации которых известен, вирусными частицами, напоминающими ретро-вирусы типа А, а также вирусными генами, интегрированными в ДНК таких клеток. При использовании постоянных клеточных линий для снижения или устранения риска вирусной контаминации следует, прежде всего, применять систему посевных клеток. Создание резервных запасов постоянных линий клеток, проверенных в соответствии с требованиями ВОЗ (1982, 1987 гг.), является необходимым условием производства лицензированных вакцин. Предполагаемый риск, связанный с белками, кодируемыми онкогенами постоянных линий клеток, ограничен лишь факторами роста, действие которых транзисторно и обратимо. В обнаруживаемых концентрациях они не представляют серьезной опасности и, кроме того, многие из них быстро разрушаются [ 154]. Методы контроля должны гарантировать отсутствие в конечном препарате биологически активных количеств потенциально онкогенных примесей (гетерогенная ДНК, трансформирующие белки, эндогенные вирусы). Исследовательские группы, рассматривавшие проблему приготовления медицинских иммунобиологических препаратов, пришли к заключению, что несмотря на существование потенциального риска, данные, подтверждающие безопасность препаратов, оправдывают их применение [154]. В 1985 г. Комитетом экспертов по стандартизации биологических препаратов были приняты «Требования к непрерывным линиям клеток, используемым в производстве биологических продуктов». Отмена запрета на использование постоянных клеточных линий в качестве субстрата в производстве медицинских биологических препаратов открыла новые возможности в деле расширения производства вирусных препаратов, повышения их качества и снижения стоимости. В настоящее время в ряде стран широко используют постоянные линии клеток для изготовления медицинских биопрепаратов. Использование постоянных линий клеток в качестве субстрата в производстве вирусных вакцин имеет ряд преимуществ. Они не требуют сложных условий культивирования, их можно выращивать в промышленных культиваторах и ферментерах, хорошо изучить и охарактеризовать, а маточные расплодки, свободные от контаминации эндогенными и экзогенными вирусами, длительно хранить при низкой температуре. Многие ученые считают, что приготовление вакцин с использованием клеток Vero по сравнению с первичными культурами клеток почек обезьян, представляет меньший риск вирусной контаминации. Накапливается все больше данных, что клетки Vero и ВНК-21 - безопасные субстраты для производства медицинских биопрепаратов. Клетки Vero не обладали туморогенными свойствами, а клетки ВНК-21 (клон 13) оставались кариологически стабильными в течение 52 пассажей. Изучение чистоты и биологической безопасности белка клеток показало отсутствие посторонних вирусов, а также следов вирусных последовательностей в геноме клеток Vero. Клетки Vero используют в производстве вакцин против полиомиелита и бешенства человека. Инактивированная полиовакцинаулучшенного качества лицензирована в 1982 г., в последующие 5 лет ею было привито более 20 млн. детей без побочного эффекта. В 1988 г. ее производство составило 60 млн. доз. Инактивированная вакцина против бешенства лицензирована в 1985 г. В последующий период были использованы сотни тысяч доз вакцины при низком уровне клинических реакций. Успешно завершились широкомасштабные клинические испытания живой полиовакцины для орального применения из вируса, размноженного в клетках Vero. В 1987 г. во Франции лицензирована компонентная вакцина против гепатита В, изготавливаемая на основе рекомбинантной линии клеток СНО. В Великобритании, Японии и Китае получали интерферон в культуре постоянной линии клеток Namalva. В связи с возможностью клинического применения моноклональных антител [154], актуальность приобретает культивирование таких клеток в больших масштабах. Предварительные результаты [72] показывают, что непрерывное крупномасштабное культивирование гибридом в свободной суспензионной культуре в сочетании с непрерывным диализом культуральной среды может дать хороший урожай секретируемых антител (100—140 мг/л). При крупномасштабном производстве один работающий 1000-литровый ферментер фирмы Celltech может обеспечить получение килограммовых количеств моноклональных антител [254]. Кроме того, гибридные клеточные линии сами по себе могут быть использованы в качестве субстрата для репродукции вирусов. Таким образом, только пересмотр существующих ограничений по применению тканевых культуральных систем для производства вирусных вакцин позволяет использовать индустриальные методы массового выращивания вирусов на основе суспензионного культивирования - подобно тому, как это делают в микробиологической промышленности. Ученых, работающих в этой области, не обескураживают даже очевидные успехи генной инженерии. Многие ученые считают, что генная инженерия с использованием микроорганизмов может упразднить проблемы, связанные с развитием и использованием массового культивирования клеток животных, и поэтому технология, основанная на их применении, не имеет будущего. Однако в конкуренции традиционной и новой технологий изготовления вирусных препаратов, где решающее значение имеет качество конечного продукта, обнаружились непредвиденные обстоятельства. Во-первых, при попытке экспрессии вирусных генов в прокариотических организмах не всегда получены удовлетворительные практические результаты. Во- вторых, с тех пор как стало возможным клонировать в клетках животных гены, кодирующие вирусные белки, важность крупномасштабного производства клеточных культур еще более возросла. Данные обстоятельства позволили выразить надежду, что биотехнология клеток животных сохранит свою авангардную роль 

www.med24info.com

Производство противовирусных вакцин. Основные этапы производств

Получаемые подобным образом  клетки могут быть или разрушены  с целью выделения и последующей  очистки соответствующего антигена – рекомбинантные вакцины, или вводятся в организм – векторные вакцины.

Векторные (рекомбинантные) вакцины

Рекомбинантные  вакцины  - для производства этих  вакцин  применяют рекомбинантную технологию, встраивая генетический материал  микроорганизма  в дрожжевые клетки, продуцирующие антиген. После культивирования дрожжей из них выделяют нужный антиген, очищают и готовят вакцину. Примером таких  вакцин  может служить  вакцина против гепатита В (Эувакс В).

Для создания векторных живых  вирусных вакцин используют аттенуированный ДНК-содержащий вирус, в геном которого встраивается необходимый предварительно клонированный ген.

Вирусный вектор создает  иммунитет против заболеваний:

   1) Заболевания, вызываемого  данным вирусом

   2) Заболевания, вызываемого  инфекционным агентом – хозяином  встраиваемой в вирусный геном  ДНК.

Экспериментальные векторные  вакцины на основе вируса осповакцины получены к ветряной оспе, гриппу А, гепатиту А и В, малярии, простому герпесу.

Другой подход к созданию вакцины заключается в использовании  в роли векторов аттенуированных бактерий. Естественным кандидатом такого вектора является вакцина БЦЖ, поскольку геном этих бактерий по расчетам достаточно велик для включения генов любых других микробов. В качестве вектора можно также использовать ряд мутантных штаммов сальмонелл, способных при пероральном введении проиммунизировать лимфоидную ткань кишечника. Эти бактерии идеально подходят как векторная вакцина для индукции местного иммунитета в кишечнике – очень важная задача, если учесть, что диарейные заболевания составляют главную причину детской смертности на земном шаре. Еще одно преимущество аттенуированных микроорганизмов как векторов заключается в том, что их могут поглощать макрофаги, вызывая в результате системный иммунный ответ вследствие миграции в другие части тела. [1]

3 Требования к  производству вакцин

Требования к производству иммунобиотехнологических препаратов изложены в ряде документов по надлежащей производственной практике GMP, в разделах посвященных производству биологических и генно-инженерных продуктов. В отличие от препаратов, как правило, получаемых и контролируемых воспроизводимыми химическими и физическими методами, биологические препараты производятся с использованием биологических процессов и материалов, таких как культуры клеток, живые микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибы), кровь или плазма человека, животных и т.п. Эти процессы отличаются присущей им вириабельностью, так что диапазон и природа побочных продуктов также варьируется. Кроме того, контроль препаратов осуществляется на лабораторных животных, культуре клеток, живых микроорганизмах. По этой причине при производстве биологических препаратов необходимо точнейшее следование принципам GMP на всех стадиях производства.

   1. Для всех производственных  операций должны существовать  стандартные рабочие методики, стандартные  операционные процедуры, стандарты  предприятия.

   2. В спецификации  на исходное сырье должны быть  включены подробные описания  их источников происхождения  и метода производства, а также  применявшихся методов контроля, в частности, микробиологической  чистоты.

   3. Питательные среды  следует вводить в биореакторы или ферментаторы в тщательно контролируемых условиях, обеспечивающих исключение загрязнения.

   4. При осуществлении  инактивации (при получении анатоксинов и вакцин), то следует принять меры, которые позволят избежать риска перекрестной контаминации инактивированного и неинактивированного продуктов.

   5. Чтобы избежать нежелательного дрейфа свойств, который может наблюдаться при повторяющемся субкультивировании или множественном воспроизведении, производство препаратов, получаемых с помощью микробных культур (например, вакцина БЦЖ), клеточных культур (например, вакцины против кори или полиомиелита), или размножением в эмбрионах или животных, должно основываться на системе главных и рабочих партий посевного материала или банка клеток.

   6. Количество поколений  (удвоений) между партией посевного  материала или банком клеток  и конечным продуктом должно  согласовываться с досье препарата.  Масштабирование процесса не  должно менять этого фундаментального  соотношения. Партии посевного  материала и банки клеток должны  быть созданы, храниться и использоваться  таким образом, чтобы свести  к минимуму риск загрязнения  или изменения. Должен проводиться  постоянный мониторинг температуры  хранения материала с фиксацией  полученных результатов. Любые  отклонения от установленных  пределов и любые предпринятые  действия по корректировке должны  протоколироваться.

   7. Только уполномоченному  персоналу должна быть разрешена  работа с материалом. Эта работа  должна выполняться под контролем  ответственного лица. Доступ к  хранящемуся материалу должен  контролироваться. Различные партии  посевного материала или банки  клеток должны храниться таким  образом, чтобы предотвратить  путаницу или перекрестное загрязнение.

   8. Центрифугирование,  сепарирование или смешивание  продуктов может привести к  образованию аэрозолей. При этом  необходимо принимать меры предосторожности  для предотвращения переноса  живых микроорганизмов.

   9. Для хроматографической очистки ряда препаратов (например, вакцины против гепатита В, полиомиелита) используется целый ряд оборудования, и, как правило, такое оборудование должно быть предназначено для очистки одного продукта, должно стерилизоваться и проходить санитарную обработку между партиями. Не рекомендуется использование одного и того же оборудования на различных этапах обработки. Должны быть определены критерии приемлемости, срок службы и способы санитарной обработки и стерилизации колонок.

   10. Критические стадии  производственного процесса биологических  препаратов и существенные изменения  производственного процесса должны  пройти валидационные исследования.

   11. Во время производства  необходимо составлять протоколы  рукописным способом  или с  использованием записывающего прибора,  который документально подтверждает, что действительно проведены  все стадии, требуемые установленными  методиками и инструкциями, а  также, что количество и качество  продукции соответствует запланированным  нормам. Любые значительные отклонения  должны быть полностью запротоколированы  и исследованы. Протоколы производственного  процесса, позволяющие исчерпывающе  проследить историю серии,  следует  составлять в полной и доступной  форме.

   12. Следует отметить, что новый продукт может требовать  дополнительных доклинических исследований, подтверждающих его исходное  клиническое применение. Необходимо  включать информацию о процессе  очистки и предоставлять данные  о стабильности, показывающие стабильность  продукта в течение клинических  испытаний. В дополнение к этому  может возникнуть потребность  в проведении исходных клинических  испытаний на небольших исследуемых  группах или с повышением дозы  вакцины с целью установления  безопасности продукта. Кроме того, может быть необходимым проведение  прямого сравнения старых и  новых продуктов в ходе рандомизированных клинических испытаний, чтобы установить взаимосвязь между функционированием двух продуктов.[4]

4 Методы получения современных вакцин

Живые вакцины получают, используя аттенуированные (ослабленные) штаммы бактерий и вирусов. Основным свойством вакцинных штаммов, принципиально отличающих их от патогенных, является стойкая утрата ими способности вызывать в организме человека типичное инфекционное заболевание.

Методы получения аттенуированных штаммов:

   1. Путем селекции  спонтанно возникших вакцинных  штаммов с ослабленной вирулентностью (туляремийная и бруцеллезная вакцины).

   2. Длительное культивирование  в неблагоприятных условиях.

   3. Путем длительного пассирования в организме невосприимчивых животных или на куриных эмбрионах – метод адаптации к новому хозяину (вирусные вакцины).

   4. Методом гибридизации «актуальных» эпидемических штаммов вируса с холодоадаптированными штаммами, безвредными для человека (гриппозные вакцины).

   5. Воздействием на  патогенные культуры мутагенами  различной природы с последующим  отбором непатогенных вариантов,  сохранивших иммунные свойства.[3]

Инактивированные (убитые) корпускулярные вакцины получают путем инактивации бактерий или вирусов физическими или химическими мутагенами: прогревание при температуре 50-60ºС, обработка ультрафиолетовыми лучами или формалином, спиртом, фенолом и другими веществами с сохранением корпускулярности.

Этапы получения живых  и убитых вакцин:

   1. Выбор штамма  и разработка условий его культивирования.

   2. Накопление биомассы  клеток в биореакторах после предварительного внесения посевного материала.

   3. Концентрирование  биомассы.

   4. Инактивация культуры в случае получения убитой вакцины и выделение клеток живой вакцины.

   5. Стандартизация.

Химические вакцины готовят  из антигенов, извлекаемых из микробных  клеток и вирусов. В отличие от корпускулярных, химические вакцины  вызывают защиту против определенных патогенных субстанций возбудителя  и не содержат избыточного количества балластных структур. Химические вакцины  готовят из поверхностных структур вирусных частиц или микроорганизмов (капсидов и суперкапсидов вирусов, клеточных стенок и мембран бактерий), содержащих антигены, обладающие протективной активностью. К этой группе относятся также и анатоксины, представляющие собой препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, обезвреженных длительным воздействием формалина при повышенной температуре.

Этапы производства химических вакцин:

   1. Наработка биомассы  клеток возбудителя.

   2. Выделение протективного антигена путем дезинтеграции вирионов или экстракции из клеток с использованием органических растворителей.

   3. Очистка антигена (используют: ультрафильтрацию, центрифугирование  в градиенте концентрации сахарозы, гель-фильтрацию, хроматографию на  ионообменниках, аффинную хроматографию)

   4. Стерилизация вакцины.

   5. Стандартизация  и контроль качества вакцины.

Вакцины с искусственными адъювантами создаются, используя  естественные антигены и синтетические  носители.

Комбинированные вакцины  создаются на основе имеющихся монопрепаратов.

Генно-инженерные вакцины  – препараты, полученные с использованием рекомбинантных клеток. Принцип создания заключается в том, что в геном живых аттенуированных вирусов, бактерий, дрожей или клеток эукариотов (вектор) встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина.

Процесс создания рекомбинантных вакцин:

   1. Выделение или  получение гена, кодирующего протективный антиген.

   2. Внедрение гена  в экспрессирующий вектор (плазмида, фаг, вирус) и введение в пермиссивную клетку.

   3. Культивирование  модифицированного микроорганизма  in vitro.

   4. Выделение и очистка  требуемого антигенного продукта, используемого затем как вакцинный препарат.[3]

5 Производство противовирусных вакцин. Основные этапы производства

Прежде чем приступить к производству какого-либо вида вирусной вакцины, необходимо получить определенное количество вирусного материала. В  отличие от бактерий, вирусы не растут ни в каких других условиях, кроме  как в клетках живых организмов. При использовании целостных  организмов возникают немалые сложности. Каждый организм обладает спектром индивидуальных свойств, зависящих от самых различных  причин, но все они влияют на успех  заражения. Выбор животного того или иного вида и возраста зависит  от применяемого вида вируса. Наиболее широко используют белых мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов. Но для промышленного производства используют, в основном, культуры клеток. В настоящее время вакцины, получаемые в культурах клеток, отличаются большим  разнообразием: это вакцины против бешенства, чумы, гепатита, оспы, энцефалитов  и т.д.[2]

Индикация, идентификация  и определение титра вируса

После накопления вирусов  в клетках следующим этапом в  производстве вакцин является индикация, идентификация и определение  титра вирусного материала. Прямое непосредственное выявление вирусов  возможно с помощью электронного микроскопа, но при условии, что в  пробе содержится не менее 10-100тыс. вирионов в 1мл. Этот метод не всегда можно  применить.

myunivercity.ru

Производство вакцин от гриппа: shvarz

Как все знают, наверно, вакцину от гриппа каждый год создают заново: по одинаковым технологиям, но с разными штаммами гриппа. Вот так выглядит ежегодный календарь производства вакцины:

Еще в январе компании начинают производство первого штамма для вакцины. Выбор штамма они делают на собственный страх и риск, никто им не гарантирует, что именно этот штамм окажется в вакцине. В феврале происходит заседание ВОЗ, которые выдают рекомендации о том, какие штаммы следует включать в вакцину. В конце февраля-начале марта каждая страна решает сама следовать ли им рекомендациям ВОЗ или выбрать другие штаммы. После этого решения штаммы известны и процесс включается на полную мощность. Примерно 4 месяца уходят на производство трех (или четырех, если вакцина квадривалентная) штаммов, контроль качества, и смешивание их в нужных (не всегда равных) пропорциях. Еще примерно месяц уходит на расфасовку. Конечный продукт нужно протестировать в волонтерах на безопасность, лицензию выдают только после такого испытания. И еще месяц на распространение по всей стране. Если все идет гладко, то первые дозы вакцины оказываются на местах в середине августа, но основные объемы таки распространяются в сентябре-октябре, как раз к началу сезона вакцинации.Надо отметить, что производство вакцины от гриппа это потрясающе сложный процесс. Он требует детального планирования и в нем много ступеней, и ошибка на каждой из ступеней ведет к тому, что компания не сможет произвести вовремя требуемое количество вакцины. А это не только денежные потери, но и негативное освещение в новостях, потенциальные разборки в конгрессе, и прочие неприятности. При этом многие шаги в этом процессе зависят не от производителей, а от международных и государственных структур, занимающихся наблюдением за вирусом, а также от регуляторных агенств разных стран.

Такой плотный календарь, практически не допускающий ошибок или задержек, связан с тем, что вакцину от гриппа производят очень старой технологии: выращивая вирус гриппа в огромных количествах в куриных эмбрионах. Весь процесс автоматизирован до предела - человеческие руки яиц практически не касаются, инокуляция, сбор вируса, его инактивация и очищения почти полностью автоматизированы. Но сама биология процесса требует определенного времени, которое сократить невозможно.

Очень много времени уходит на то, чтобы выбрать нужные штаммы вируса для включения в вакцину, но об этом мы поговорим в следующий раз.

Большинство человеческих штаммов очень плохо растут в куриных эмбрионах, их нужно специально адаптировать для производства. Для адаптации, куриные эмбрионы заражают одновременно двумя штаммами – выбранным для вакцины и способным хорошо размножаться в эмбрионах. Генетический материал этих двух вирусов перемешивается и получаются самые разные химерные вирусы. Их клонируют, отбирают тех, что несут нужный ген HA, и тестируют каждый клон на репликацию в эмбрионах. Самый лучший клон отбирают для производства. Для многих штаммов гриппа подобные клоны уже существуют, но если принимается решение включить в вакцину какой-то новый штамм, то время необходимое для создания стартового клона следует добавить к времени производства.

Планирование производства затрудняется тем, что разные штаммы растут с разной продуктивностью и поэтому для производства разных штаммов требуется разное количество яиц. Заказывать яйца надо за 6 месяцев до начала производства (то есть в августе-сентябре предыдущего года), потому что используются не абы какие яйца, а яйца от куриц выращеных в специальных стерильных условиях и производителям надо заранее планировать, сколько таких куриц им будет нужно для выполнения заказа. В последнюю минуту изменить заказ невозможно. Заказал слишком мало – не сможешь произвести вакцину в нужном количестве, слишком много – несешь потери на закупке ненужных яиц.

Уже довольно давно компании и академические ученые работают над новыми подходами к производству вакцины от гриппа. Разрабатывают разные системы клеточных линий и векторов, которые бы позволили более гибкое или более быстрое производство, не связанное с яйцами. Эти системы тестируются и показывают хорошие результаты но, насколько я понимаю, пока что все они существенно дороже производства в яйцах и поэтому компании не спешат переходить на эти методы.

Раз уж зашла речь о деньгах. Часто говорят о том, какой это гигантский бизнесс и как фарма-компании наживаются на вакцине от гриппа. На самом деле для больших фарма-компаний вакцина от гриппа это огромная головная боль и не очень большие прибыли. Сложности с производством и планированием, и отсутствие гарантированных доходов выше я уже выше описал. К этому надо добавить, что сама ситуация с сезонным производством это отдельная проблема – компании надо постоянно придумывать чем занимать производственные мощности и специалистов в не-сезон. Дополнительной проблемой является также то, что вакцина от гриппа делается на один сезон. Если не успели или не смогли продать к ноябрю, то весь оставшийся продукт надо уничтожать. Прибыли от вакцины от гриппа традиционно ниже, чем от каких-либо других вакцин или лекарств. И вся эта морока ради очень небольших объемов продаж – суммарный мировой рынок вакцины от гриппа – 3 миллиарда долларов. Для большинства крупных производителей вакцин, вакцина от гриппа составляет меньше одного процента от их продаж. И мне приходилось слышать от некоторых людей в фарм-компаниях, что единственно почему они продолжают производить вакцину от гриппа - это давление со стороны политиков и министерств здравоохранения. Не знаю, насколько это правда, но с учетом описанного выше, допускаю что доля правды в этом возможно имеется. Но все же правильнее смотреть на производство вакцин от гриппа, как на вынужденное сотрудничество между частным и общественным секторами, в котором обе стороны держат друг друга ответственными.

Полезные ссылки по теме:Egg-Based Production of Influenza Vaccine: 30 Years of Commercial Experience (pdf)Influenza Vaccine Manufacturing Industry Perspective for 2015-16 Northern Hemisphere Influenza Vaccine Supply (pdf)

shvarz.livejournal.com

Смотрите также

• 
  Вакцина ротавек корона
• 
  Акдс зарубежная вакцина
• 
  Реактогенные вакцины это
• 
  Вакцина живая бцж
• 
  Вакцина гриппозная живая
• 
  Вакцина для котят
• 
  Вакцина для щенков
• 
  Вакцина гепатит с
• 
  Бруцеллезная лечебная вакцина
• 
  Вакдерм вакцина инструкция
• 
  Вакцина мультикан 6