/ Статья про адъюванты. Адъюванты в вакцинах
Статья про адъюванты
|
Annals of Mechnikov Institute, N 4, 2013 | | | 10 | | |
www.imiamn.org.ua /journal.htm | | | | | | |
антител, особенно когда в составе водной эмульсии | Одним из самых перспективных адъювантов |
используется 1 % минеральное масло. На его основе | ученые рассматривают наночастицы, которые эф- |
разработан синтетический | адъювант, | содержащий |
фективно поглощаются антигенпредставляющими |
синтетические | мурамилдипептиды | и | трехблочный | клетками [57]. В результате этого, если с наночасти- |
полимер L=121, состоящий из оксипропилена и двух | цами связать антиген, то он будет направленно |
частей полиоксиэтилена. В качестве добавок исполь- | поглощаться макрофагами, а это приведет к усиле- |
зуют сквален и твин-80.Адъювант не оказывает | нию иммунного ответа [58 -59]. | |
местного и системного повреждающего эффекта, | В качестве транспортных средств доставки |
стимулирует синтез антител, клеточный иммунитет | антигена и стимуляции иммунной системы исследу- |
и формирует Т- и В-клеточнуюпамять. Его исполь- | ется целый ряд наночастиц: липосомы, виросомы, |
зуют для иммунизации животных против вируса | ниосомы, иммуностимулирующие комплексы, поли- |
лейкоза кошек, гриппа и гепатита В. | | | мерные наносферы, вирусоподобные частицы и др |
Примером | вакцины с | искусственными | [60]. Наночастицы представлены: | |
адъювантами, которая внедрена в практику здраво- |
(а) структурными компонентами вируса, ко- |
охранения, является гриппозная вакцина. Она пред- | торые включают капсид и белки оболочек, но не |
ставлена белками вируса гриппа (гемагглютинина и | имеют генетического материала, | |
нейраминидазы) и искусственным стимулятором по- | (б) липосомы - средство доставки антигена |
лиоксидонием, | который | проявляет | выраженные | и, при необходимости, стимулятор иммунной клет- |
адъювантные свойства [25]. | | | | ки, | | |
|
Также внимание ученых привлекают неион- | (в) частицы, состоящие из синтетических |
ные блоки - сополимеры, синтезированные из окси- | биоразлагаемых полимеров, которые могут перено- |
да этилена и оксида пропилена, которые способны | сить антиген и стимулировать иммунитет (обычно |
доставлять антиген. Другие композиции антигена на | антиген загружается внутрь частицы), о которых го- |
основе поли-(L)-лактидастимулируютТ-клеточный | ворилось ранее, | | |
иммунный ответ [78]. | | | | (г) вирусные векторы, используемые для до- |
Несмотря на явные преимущества, суще- | ставки генетического материала определенным клет- |
ствует ряд недостатков: дороговизна производства, | кам-мишеням, | | |
низкая устойчивость к воздействию секретов желу- | (д) фаговые частицы [61]. | |
дочно – кишечного тракта. Поэтому ученые продол- | Липосомы. В результате поисков наиболее |
жают дальнейшие исследования в данном направле- | эффективных адъювантов появилось целое новое |
нии, отдавая предпочтение более простым в произ- | направление в науке, основателями которого по пра- |
водстве и недорогим полимерам. При этом учитыва- | ву считаются Sessa и Weissmann: их изобретение ли- |
ют период распада исследуемых адъювантов на фи- | посом (в 1968 году) определило направления иссле- |
зиологически безопасные вещества в организме. В | довательских работ последующих лет. Липосомы - |
последние годы уменьшение размеров капсул до 1 | микроскопические | структуры, | состоящие из |
мкм позволило задействовать наибольшее количе- | нескольких концентрических липидных бимембран- |
ство клеток, способных к эндоцитозу [45]. | ных структур, окруженных водой [62 - 63]. Они
|
В настоящее время интенсивно проводятся | представляют собой везикулы, которые способны |
исследования, направленные на разработку новых и | инкапсулировать антиген и выступать в качестве |
улучшение существующих систем доставки [54 - | средств его доставки [26]. Ряд авторов считают, что |
65]. Они являются важными вспомогательными | липосомы, благодаря своему близкому строению с |
компонентами, которые позволяют не только надле- | цитоплазматической | мембраной | клеток, позволяют |
жащим образом доставить антиген, а к тому же ча-
| предохранять антиген не только от разрушения в ак- |
сто обладают собственной иммуногенной активно- | тивных средах организма, но и от взаимодействий с |
стью [46 - 53]. Уделяют внимание рассмотрению со- | компонентами крови, а также осуществлять направ- |
стояния безопасности систем доставки частиц, их | ленный транспорт к клеткам ретикулоэндотелиаль- |
составу, физико-химическимсвойствам, ассоциации | ной системы [64 - 65]. Многочисленные исследова- |
антигенов и выбору путей введения [52]. | ния доказали возможность использовать липосомы |
|
Вакцины нового поколения чаще стимули- | не только в качестве носителей, но и в качестве иму- |
руют клеточный иммунный ответ, особенно типа | номодулятора, обнаружив иммуномодулирующие |
Th2. Важное значение данные разработки приобре- | свойства самих липосом [66 - 67]. | |
тают при хронических инфекционных заболеваниях, | Недостаток липосомных носителей заклю- |
которые вызваны | способными к внутриклеточному | чался в ограничении включаемых в них веществ. В |
размножению | микроорганизмами | (вирус герпеса, |
последующем данная проблема была решена, хотя и |
вирус гепатита С, Helicobacter pylori, Plasmodium | повлекла за собой усложнение процесса их произ- |
falciparum, Mycobacterium tuberculosis), а также для | водства [68 - 70]. Сложное строение липосом позво- |
терапевтических вакцин против рака, аутоиммунных | лило программировать свойства носителей (длитель- |
заболеваний, аллергии [55]. Новые технологии необ- | ность циркуляции, афинность к клеткам и органам- |
ходимы для создания препаратов против вируса | мишеням, скорость запуска иммунологических реак- |
гриппа, ВИЧ, |
вируса папилломы, поскольку требу- | ций и т.д.), но при этом ещё больше усложнило про- |
ют новых путей введения, нового состава и новых | цесс изготовления [71-72].Кроме того, имея в осно- |
адъювантных систем [56]. | | | | ве своей структуры фосфолипиды, липосомы нужда- |
| | | | | | лись в эффективной защите от перекисного окисле- |
studfiles.net
АДЪЮВАНТЫ — Большая Медицинская Энциклопедия
АДЪЮВАНТЫ (латинский adjuvans — помогающий, поддерживающий) — неспецифические стимуляторы иммуногенеза, вещества различного происхождения и состава.
Адъюванты могут обладать антигенными свойствами (убитые микроорганизмы или полисахариды бактериального происхождения) и не обладать ими (минеральные масла, квасцы и так далее). Действие адъювантных стимулирующих веществ отмечено в 1925 году Районом (G. Ramon), установившим активацию продукции антитоксинов (см.) у лошадей при совместном введении анатоксинов (см.) с квасцами, хлористым кальцием, тапиокой, лецитином, холестерином, ланолином, бензоином.
К адъвантам неорганической природы относят гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, хлористый кальций, алюминиево-калиевые квасцы, гидрат окиси железа, активированный уголь и другое. Среди органических веществ адъювантным действием обладают агар-агар, глицерин, желатина, крахмал, ланолин, лецитин, пектиновые вещества, протамины и другое. Более сложные адъюванты состоят из смесей масел или липополисахаридов с добавлением эмульгаторов, а также смесей липидов с минеральными сорбентами.
Наиболее тщательно изучено и широко применяется для усиления действия антигенов при изготовлении вакцинных препаратов (см. Вакцины) лишь небольшое количество адъювантных веществ. В качестве сорбентов при изготовлении вакцин чаще всего применяют гидрат окиси алюминия — Аl(ОН)3 и фосфат алюминия — АlРO4. Гидрат окиси алюминия представляет собой минеральный гель, содержащий 6—22 мг Аl(ОН)3 в 1 мл, с хорошими сорбционными свойствами; безвреден для организма. Фосфат алюминия также высокодисперсный препарат.
При изготовлении ассоциированных вакцин используют в качестве адъюванты убитые бактерии.
Разнообразные адъюванты находят применение в производстве лечебных сывороток (см.) и особенно в экспериментальных исследованиях по иммунологии. При этом нередко используют более реактогенные препараты (1% раствор алюминиево-калиевых квасцов, ланолин, холестерин, водно-масляные эмульсии, адъювант Фрейнда). Полный адъювант Фрейнда содержит BCG или липополисахариды, полученные из микобактерий туберкулеза, сложные жирные кислоты (дериваты ланолина), масла и эмульгаторы (Арлацел А или Твпн-80). Адъювант Фрейнда, лишенный фракции микобактерий туберкулеза, называют неполным. Он является мощным стимулятором иммуногенеза, но не применяется в профилактической вакцинации в связи с его токсичностью и аллергизирующим действием. Использование адъюванта Фрейнда способствует индукции гиперчувствительности замедленного типа и развитию аутоиммунных процессов (см. Аутоантигены, Аутоантитела).
Выраженным адъювантным действием обладают бактериальные эндотоксины, нуклеиновые кислоты и продукты их распада, синтетические нуклеотиды и полианионы.
Механизм стимулирующего действия адъвантов на организм окончательно не выяснен. Усиление антигенного воздействия зависит прежде всего от развития в организме воспалительного процесса и стимуляции пролиферативной и фагоцитарной активности ретикулоэндотелиальной системы, усиления плазмоклеточной реакции и генерализации иммунологического процесса по лимфоидным органам и резкого увеличения общего синтеза белка. Вероятную роль играет также замедленная резорбция антигена из депо с замедлением разрушения антигена и дискретным действием его на лимфоидную ткань.
Адъюванты широко применяют как стимуляторы иммуногенеза при введении в организм человека и животных специфических антигенов. К последним относятся сорбированные на гидрате окиси алюминия анатоксины, полные антигены и противовирусные вакцины (против клещевого энцефалита, гриппа), а также ассоциированные препараты, напр, адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС). Обычно очищенные антигены сорбируют в определенном соотношении на стандартной суспензии гидрата окиси алюминия, проверяют на иммуногенность и реактогенность, а также учитывают ряд физико-химический констант: рН, содержание сорбента и так далее. (см. Вакцины, Иммунизация).
В 60-х годах пытались использовать в медицинской практике вакцины с адъювантами из минеральных масел. Испытания показали, что эти вакцины более иммуногенны, чем несорбированные, вызывают образование более широкого спектра антител. Однако при их использовании на месте введения иногда образовывались гранулемы, что послужило причиной прекращения их применения.
Для приготовления высокоактивных сывороток от животных, а также для получения гиперчувствительности замедленного типа, кроме полного и неполного адъюванта Фрейнда, успешно используют простые и двойные водно-масляные эмульсии, эмульгированные с раствором антигена до получения стойкой эмульсии. Двойные эмульсии получают при дальнейшем эмульгировании с равным объемом 2% раствора Твина-80 обычно на механическом эмульгаторе.
В фармакологии адъювантами называются вещества, усиливающие или пролонгирующие действие лекарственных средств.
Адъювантная болезнь
Адъювантная болезнь — заболевание у животных, вызываемое введением адъюванта Фрейнда и характеризующееся комплексом воспалительных изменений с преобладанием пролиферативного компонента, локализующихся главным образом в суставах и периартикулярной ткани. Это заболевание имеет сходство с такими заболеваниями человека, как ревматоидный артрит, узловатая эритема и используется как экспериментальная модель для их изучения.
Впервые «адъювантный артрит» был описан Пирсоном (C. M. Pearson, 1956) у крыс в виде острого воспаления в суставах хвоста, стопы и лодыжки с последующим развитием периоститов и экзостозов. Установлено, что воспалительные изменения развиваются не только в суставах, но и в коже, центральной нервной системы, легких, глазах, печени, почках, мочевыводящих путях и многих других органах. Поэтому в 1961 году был предложен термин «адъювантная болезнь», который более соответствует сущности изменений.
Адъювантная болезнь лучше всего воспроизводится у крыс различных линий обоего пола. Установлена зависимость между тяжестью болезни и линейной принадлежностью крыс.
Адъюванты готовят как по классической прописи (минеральное масло, ланолин, вода, в 1 мл которой содержится 3 мл микобактерий туберкулеза, убитых нагреванием), так и в различных вариациях. Вариации касаются состава эмульгатора, замены микобактерий туберкулеза отдельными фракциями из них или другими бактериями. Наиболее эффективный способ воспроизведения адъювантной болезни — однократная инъекция адъюванта в подушечки задних или всех четырех лап животного в дозе 0,05—0,1 мл.
Поражения суставов. Первые признаки воспаления суставов и окружающих тканей появляются через 10—16 дней после введения адъюванта. Суставы опухают, в полости суставов появляется экссудат, развивается периостит. Артриты носят мигрирующий характер и возникают у крыс в 70—100% случаев. Поражаются преимущественно запястно-пястные, межпястные, пястно-фаланговые и плечевые суставы на передних конечностях, а также предплюсне-плюсневые. межплюсневые, пястно-фаланговые и тазобедренные суставы па задних конечностях крыс.
Тяжелые формы артритов имеют тенденцию к затяжному течению, разрушению хрящевой поверхности суставов, развитию соединительной ткани, склероза и анкилоза суставов. В первые дни развития артритов гистологически определяется отечность периартпкулярной соединительной ткани и синовиальных оболочек, инфильтрация их мононуклеарами (моноциты, лимфоциты, гистиоциты), пролиферация фибробластов.
Через 3—4 недели среди клеток инфильтрата преобладают лимфоциты, усиливаются пролиферативные процессы, в костной ткани суставов — гиперплазия остеобластов. У большинства животных артриты заканчиваются выздоровлением с восстановлением подвижности в суставах.
Поражения кожи. Вслед за развитием артритов у крыс могут появляться участки облысения и сыпь в виде папул и бугорков. Гистологически в области небольших бугорков выявляются перивенозные мононуклеарные инфильтраты преимущественно из гистиоцитов и лимфоцитов и более диффузная гиперплазия гистиоцитов без выраженной перивенозной локализации. В больших узлах — массивная клеточная инфильтрация с изолированными фокусами некроза, содержащими материал, похожий на фибрин. Через 1—1,5 месяцев развиваются поздние кожные изменения в виде выпадения волос, шелушения, трещин, которые держатся до 3—4 мес.
Поражения селезенки и лимфатических узлов. В селезенке выявляется гиперплазия клеточных элементов, образование светлых центров в лимфатических фолликулах. Характерна гиперплазия лимфатических узлов, увеличение светлых центров реактивности (размножения) в фолликулах, пролиферация плазматических клеток в мякотных шнурах.
Поражения центральной нервной системы аналогичны тем, которые обнаруживаются при введении адъювантов с гомогенатом ткани спинного мозга и сопровождаются развитием экспериментального аллергического энцефаломиелита. Однако введение одного адъюванта не дает демиелинизацию.
Поражения глаз в виде конъюнктивита, эписклерита, увеита, иридоциклита возникают после развития артрита у небольшой части животных и держатся обычно от 2 до 14 дней. В легких случаях все явления проходят. В тяжелых случаях в передней камере глаза наблюдается скопление фибринозного экссудата, развитие задних синехий и атрофии радужки, образование преципитата на внутренней стороне роговицы и ее помутнение.
Поражения желудочно-кишечного тракта. Резко выраженная диарея отмечается примерно в 20% случаев. Она продолжается от нескольких дней до двух недель.
Поражения печени. Гистологически выявляется пролиферация клеток ретикулоэндотелиальной системы, образование клеточных инфильтратов.
Поражение почек и мочевыводящих путей. Развиваются различные виды нефрита.
Поражения органов и систем у разных видов животных, а также разных органов в пределах одного вида животных в общем однотипны, хотя имеются видовые и органные различия. Так, например, в печени, селезенке и легких мышей, морских свинок и хомяков хорошо выражена пролиферация элементов ретикулоэндотелиальной системы, но она отсутствует в сердце и почках этих животных. Амилоидоз печени, почек и селезенки наблюдается у мышей, но отсутствует у морских свинок и хомяков.
Патогенез
Существует две теории патогенеза адъювантной болезни.
1. Инфекционная теория предполагает активирование эндогенной инфекции (например, у крыс — активирование микробов семейства Mycoplasmataceae, часто обнаруживаемых у практически здоровых животных). Эта теория не получила подтверждения, так как посевы крови, ткани суставов и ткани с места инъекции адъюванта, жидкости из камер глаза оказывались стерильными, а введение больших доз различных антибиотиков не тормозило развития болезни.
2. Аутоаллергическая теория предполагает участие иммунологических механизмов. Эту теорию подтверждают следующие факты: а) латентный период при адъювантной болезни такой же, как при развитии других экспериментальных аутоаллергических процессов, при реинокуляции стимулятора он уменьшается; б) развитие заболевания тормозится воздействиями, угнетающими иммунологическую реактивность, — облучением рентгеновскими лучами в дозе 600 р, введением иммунодепрессантов, в частности 6-меркаптопурина и больших доз глюкокортикоидов, предварительной (за 4—12 нед.) тимэктомией, введением антилимфоцитарной сыворотки; в) воспроизведение адъювантной болезни невозможно у новорожденных и молодых крыс, так как механизмы иммунологической реактивности у них еще не развиты или только формируются; г) характер аутоаллергических механизмов развития болезни указывает на их отношение к реакциям замедленного типа, что подтверждается возможностью пассивного переноса адъювантной болезни взвесью клеток лимфоидного ряда и невозможностью переноса сывороткой крови, а также гистологической картиной тканевых изменений, характерной для реакций замедленного типа, торможением реакции миграции макрофагов, отсутствием снижения титра комплемента во время острого периода болезни; д) возможно воспроизведение феномена иммунологической толерантности (см. Толерантность иммунологическая), то есть подавление развития адъювантной болезни у животных, получивших при рождении микобактерий туберкулеза.
Библиография: Воробьев А. А. и Васильев Н. Н. Адъюванты, М., 1969, библиогр.; Гурвич Г. А. и др. Эндотоксины как неспецифические биостимуляторы антителообразования, Вести. АМН СССР, Л» 8, с. 50, 1964; Здродовский П. Ф. Проблемы инфекции, иммунитета и аллергии, с. 192, М., 1969; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., с. 316 и др., М., 1968; Рамон Г. Сорок лет исследовательской работы, пер. с франц., с. 235, М., 1962; Учитель И. Я. и Хасман Э. Л. О механизме адъювант-ного действия неспецифических стимуляторов антителообразования, Вестн. АМН СССР, № 3, с. 23, 1964, библиогр.; Chase М. W. Production of antiserum, в кн.: Methods in immunol. a. immunochem., ed. by C. A. Williams a. M. W. Chase, v. 1, p. 197, N. Y. — L., 1967; Freund J. The mode of action of immunologic adjuvants, Advanc. Tuberc. Res., v. 7, p. 130, 1956; Herbert W. J. Methods for the preparation of water-in-oil, and multiple, emulsions for use as antigen adjuvants, Handbook exp. immunol., ed. by D. M. Weir, p. 1207, Oxford — Edinburgh, 1967, bibliogr.; International symposium on adjuvants of immunity, ed. by R. H. Regamey a. o., Basel — N. Y., 1967; Merritt K. a. Johnson A. G. Studies on the adjuvant action of bacterial endotoxins of antibody formation, J. Immunol., v. 94, p. 416, 1965, bibliogr.; Schmidtke J. R. a. Jоhnsоn A. G. Regulation of the immune system by synthetic polynucleoti-des, ibid., v. 106, p. 1191, 1971, bibliogr.
Адъювантная болезнь — Канчурин А. X., Аскеров М. А. и Лазько И. Е. Адъювантная болезнь, Пат. физиол. и эксперим. тер., т. 13, №2, с. 78, 1969, библиогр.; Amkraut A. A., Sоlоmon G. F. a. Kraemer H. C. Stress, early experience and adjuvant-induced arthrits in the rat, Psychosom. Med., v. 33, p. 203, 1971; Bonhomme F. a. o. Arthritogenicity of unaltered and acetylated cell walls of mycobacteria, Int. Arch. Allergy, v. 36, p. 317, 1969; Carter R. L., Jamison D. G. a. Vоllum R. L. Histological changes evoked in mice by Freund's complete adjuvant, J. Path. Bact., v. 97, p. 503, 1969; Laufer A., Tal C. a. Веhar A. J. Effect of adjuvant (Freund's type) and its components on the organs of various animal species, Brit. J. exp. Path., v. 40, p. 1, 1959; Pearson С. М. Development of arthritis, periarthritis and periostitis in rats given adjuvants, Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.), v. 91, p. 95, 1956; Pearson C. M. a. Wооd F. D. Studies of arthritis and other lesions induced in rats by the injection of mycobacterial adjuvant, Amer. J. Path., v. 42, p. 73, 1963; Pearson C. M., Waksman В. Н. a. Sharp J. T. Studies of arthritis and other lesions induced in rats by injection of mycobacterial adjuvant, J. exp. Med., v. 113, p. 485, 1961, bibliogr.; Rosenthale M. E. A comparative study of the Lewis and Sprague Dawley rat in adjuvant arthritis. Arch. int. Pharmacodyn., v. 188, p. 14, 1970, bibliogr.; Steiner J. W., Langer B. a. Sсhatz D. L. The local and systemic effects of Freund's adjuvant and its fractions. Arch. Path., v. 70, p. 424, 1960, bibliogr.; Waksman B. H. a. Bullington S. J. Studies of arthritis and other lesions induced in rats by injection of mycobacterial adjuvant, Arch. Ophthal., v. 64, p. 751, 1960, bibliogr.; Waksman B. H. a. Wennersten C. Passive transfer of adjuvant arthritis in rats with living lymphoid cells of sensitized donors, Int. Arch. Allergy, v. 23, p. 129, 1963.
И. Н. Кокорин; В. И. Пыцкий (Адъювантная болезнь).
xn--90aw5c.xn--c1avg
Адъювант
Изобретение используется в биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных. Адъювант содержит эмульгатор алкиломодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер (АПС) - продукт полиприсоединения силоксанов и органических олефинов и масляную основу при соотношении указанных компонентов (мас.%) 5:10-90:95. АПС растворяют в масляной основе в указанных соотношениях и смесь стерилизуют. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость светлого цвета, допускается слабая опалесценция. Технический результат заключается в снижении реактогенности, вязкости и повышении стабильности адъюванта и вакцины на его основе. 8 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии, а более конкретно к масляным адъювантам, и может быть использовано при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных.
При изготовлении средств специфической профилактики инфекционных болезней животных нашли применение, в основном, следующие адъюванты: минеральные сорбенты в сочетании с сапонином для изготовления сорбированных вакцин и масляные адъюванты - для эмульсионных. Исследования свидетельствуют о преимуществах и перспективе использования эмульсионных препаратов, которые готовят с использованием масляных адъювантов [1, 2]. Изготовление эмульсионных препаратов является результатом смешивания двух взаимно нерастворимых фаз: масляной (масляного адъюванта) и водной, содержащей антиген (антигены), путем их энергичного перемешивания (эмульгирования). При этом в зависимости от состава масляного адъюванта может быть получена эмульсия различных типов: "вода в масле" (обратная), "масло в воде" (прямая) или "вода - масло - вода" (множественная). Для иммунизации сельскохозяйственных животных наиболее широко используют эмульсии обратного типа, для получения которых используют адъюванты следующего состава, мас.%: 1. Неполный адъювант Фрейнда [3]: Минеральное масло Байоль F - 85 Эмульгатор Арлацел A - 15 2. Масляная основа - 85 Эмульгатор безводный ланолин - 15 [4] В качестве масляной основы обычно используют вазелиновое, парфюмерное масло, масло для эмульгированных вакцин и антигенов или минеральное масло для противоящурных биопрепаратов. Общими недостатками вышеуказанных адъювантов являются высокая вязкость и реактогенность для крупного и мелкого рогатого скота полученных с их использованием препаратов. Наиболее близким по совокупности существенных признаков предлагаемому изобретению является масляный адъювант, включающий эмульгатор безводный ланолин и в качестве масляной основы минеральное масло для противоящурных биопрепаратов при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: Эмульгатор - 15 Масляная основа - 85 [4] Недостатки прототипа состоят в его высокой реактогенности, а также высокой вязкости при температуре ниже 20oC. В задачу создания настоящего изобретения входила разработка адъюванта и иммунизирующего препарата на его основе, обладающих низкой вязкостью и реактогенностью, а также высокой стабильностью. Поставленная задача решена созданием изобретения, включающего совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технологического результата во всех случаях, на которые испрашивается объем правовой охраны. Поставленная задача решена тем, что известный адъювант, включающий эмульгатор и масляную основу, в соответствии с изобретением содержит в качестве эмульгатора алкилмодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер (АПС) общей формулы
где A - [-C2h5O]x[C3H6O]y - R; R - H; Ch4, C4H9, COCh4; x = 9 - 36, y = 0 - 33; a = 4 - 62, b = 1 - 3, c = 0 - 30, m = 7 - 17 при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: АПС - 5 - 10 масляная основа - 90 - 95 Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый адъювант и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются: 1) адъювант, который включает: 2) эмульгатор, 3) масляную основу. По сравнению с прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются включение в состав адъюванта в качестве эмульгатора АПС общей формулы
где A - [-C2h5O]x[C3H6O]y - R; R - H; Ch4, C4H9, COCh4; x = 9 - 36, y = 0 - 33; a = 4 - 62, b = 1 - 3, c = 0 - 30, m = 7 - 17 и выбор следующего соотношения ингредиентов, входящих в состав адъюванта, мас.%: АПС - 5 - 10 масляная основа - 90 - 95 АПС является новым и ранее неизвестным продуктом полиприсоединения силоксанов и органических олефинов. АПС имеет следующие физико-химические показатели: Внешний вид и цвет - однородная, вязкая жидкость от светлого до коричневого цвета Вязкость при 50oC, мПа
с - 500 Плотность при 50oC, г/см3 - 0,909 Показатель преломления П2D - 1,453 Водородный показатель (pH водной вытяжки) - 7,0 ГЛБ - 6 Растворимость в минеральных маслах и синтетических жидкостях - Хорошая Стойкость к высоким и низким температурам - Высокая Эмульгирующая способность - Высокая Гарантийный срок хранения не менее 1 года. АПС хорошо сочетается с жирными, минеральными, растительными, синтетическими маслами и синтетическими жидкостями, а также с ПАВ (пентол, ланолин, Эпол, ВНИИЖ, сорбитаноолеат и др.). АПС не является токсичным, относится к 4 классу веществ, малоопасных для развития острых отравлений. В предлагаемом изобретении авторами впервые предложено использовать АПС в качестве эмульгатора в составе масляного адъюванта. В качестве масляной основы используют минеральное масло для универсального адъюванта, минеральное масло ВГМ-6М, углеводородное синтетическое масло МЦ, минеральные вакцинные масла марок "М", "С" и "В", полиэтилсилоксановую жидкость ПЭС-3, при использовании которых получены положительные результаты [5 - 10]. В результате анализа решении, известных из уровня техники, установлено, что существенный отличительный признак предлагаемого адъюванта, заключающийся в использовании в его составе АПС в качестве эмульгатора, не известен. Другие отличительные признаки предлагаемого адъюванта, характеризующие количественное содержание входящих в его состав ингредиентов, не могут рассматриваться в отрыве от признаков, характеризующих его качественное содержание. По результатам опытом на лабораторных и сельскохозяйственных животных обнаружены новые свойства эмульгатора АПС: он не разрушает вирусы и микробы, не обладает токсичностью, его использование в составе вакцины приводит к снижению ее вязкости и реактогенности, повышению стабильности эмульсий. Достижение технического результата изобретения обусловлено свойствами АПС: снижение реактогенности предлагаемого адъюванта - высокой поверхностной активностью АПС и его способностью проникать через клеточные мембраны, снижение вязкости вакцины - относительно низким показателем вязкости и текучестью АПС при низких температурах, повышение стабильности эмульсий - высокой эмульгирующей способностью АПС, что подтверждено результатами многочисленных испытаний предлагаемого адъюванта в составе эмульсионной противоящурной вакцины (ПЯВ) типа A22, эмульсионной вакцины против инфекционного бурсита кур (ИБК) и эмульсионной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и буйволов, сведения о которых приведены ниже, что никоим образом не ограничивает объем изобретения. Пример 1. Предлагаемый адъювант готовят следующим образом. Навеску АПС растворяют или в минеральном масле для универсального адъюванта, или минеральном масле БГМ-6М, или углеводородном синтетическом масле МЦ, или вакцинных маслах марок "М", "С", "В" или полиэтилсилоксановой жидкости ПЭС-3 в оптимальных отношениях. Полученный раствор стерилизуют известными методами: нагреванием в сушильном шкафу при 120 - 130oC в течение 2 ч. или путем стерилизующей фильтрации с помощью пластин марок "СФ", EKS, YAM и т.п. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость светлого цвета, допускается слабая опалесценция. Адъювант разливают в стерильные флаконы и хранят при комнатной температуре до момента использования. Пример 2. Состав адъюванта, мас.%: АПС - 5 Масляная основа - 95 Адъювант готовят так, как описано в примере 1. Пример 3. Состав адъюванта, мас.%: АПС - 7,5 Масляная основа - 92,5 Адъювант готовят так, как описано в примере 1. Пример 4. Состав адъюванта, мас.%: АПС - 10 Масляная основа - 90 Адъювант готовят так, как описано в примере 1. Пример 5. Для экспериментальной проверки предлагаемого адъюванта были подготовлены пять смесей его ингредиентов, три из которых показали оптимальные результаты. Оптимальный состав предлагаемого адъюванта определили в результате изучения физических свойств (вязкость, стабильность) полученных на его основе эмульсионных ПЯВ типа A22. Эмульсионные ПЯВ получали путем смешивания инактивированного ящурного антигена и предлагаемого адъюванта в отношении 1:1 в размельчителе тканей РТ-2 в течение 5 мин при 5000 об/мин. Вязкость образцов эмульсионных ПЯВ определяли с помощью ротационного вискозиметра "Эмиля" при 20oC и выражали в мПас. Согласно существующим требованиям [4] срок годности эмульсионных ПЯВ определен 12 месяцами. В течение этого времени вакцина должна быть стабильной. Стабильность эмульсионных ПЯВ определяли путем визуального наблюдения за расслоением 20 см3 образца эмульсии при 37oC. Стабильность характеризовали временем ее хранения до начала выделения водной фазы. Кроме того, определялась стабильность эмульсии центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Стабильными считали эмульсии, устойчивые к центрифугированию и не выделяющие водной фазы в течение 12 и более месяцев. Допускается выделение не более 5% масляной фазы от общего объема эмульсии. Результаты исследований приведены в табл.1. Из табл. 1 следует, что оптимальный состав предлагаемого адъюванта следующий: АПС - 5 - 10 Масляная основа - 90 - 95 (образцы 2, 3, 4, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 27, 28, 29, 32, 33, 34). В этом случае устойчивость эмульсий сохраняется в течение 12 и более месяцев, а вязкость не превышает 280 мПас, что обеспечивает легкую инъецируемость препаратов. Повышение содержания эмульгатора не улучшает свойств эмульсии (значительно увеличивает вязкость препаратов и ведет к необоснованному расходу компонентов), а уменьшение до 2,5% приводит к снижению устойчивости эмульсии (образцы 1, 6, 11, 16, 21, 26). Пример 6. Эффективность предлагаемого адъюванта в сравнении с прототипом проверена в ряде опытов также в составе эмульсионной ПЯВ типа A22. Реактогенность адъювантов определяли количественным методом на белых мышах и качественным - на свиньях и крупном рогатом скоте. Белым мышам массой 18 - 20 г в область подушечки одной из задних конечностей вводили образцы адъювантов в дозе 0,025 мл. Вторая конечность служила контролем. На каждый образец использовали 10 мышей. Через 10 дней мышей убивали, задние лапки отсекали по скакательный сустав и взвешивали раздельно. Реактогенность определяли как процент прироста массы лапок в результате воспалительной реакции по формуле K = (M1/M - 1)100%, где K - коэффициент реактогенности; M1 - сумма веса опытных лапок; M - сумма веса контрольных лапок. Реактогенность адъювантов на свиньях и крупном рогатом скоте оценивали по наблюдениям за клиническим состоянием, температурой тела и по результатам патологоанатомического исследования через 10 дней после введения ПЯВ, содержащих различные адъюванты. Крупному рогатому скоту препараты вводили подкожно, а свиньям - внутримышечно в область шеи. В табл. 2 и 3 приведены результаты оценки реактогенности предлагаемого адъюванта и эмульсионной вакцины на его основе в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Как видно из табл. 2 и 3, предлагаемый адъювант и вакцины на его основе обладают значительно меньшей реактогенностью, чем известный. Из опытов на мышах (табл.2) следует, что реактогенность предлагаемого адъюванта в 1,2 - 2 раза ниже, чем у адъюванта-прототипа. Данные табл.3 свидетельствуют, что вакцина с предлагаемым адъювантом вызывает на месте введения у крупного рогатого скота значительно меньшую воспалительную реакцию, чем вакцина с адъювантом-прототипом. Кроме того, она не вызывает образования абсцессов у животных. Пример 7. В опыте на белых мышах была изучена иммуногенная активность эмульсионных ПЯВ типа A22 с предлагаемым адъювантом и адъювантом-прототипом путем установления 50% иммунизирующих доз (ИмД50). Вакцину вводили в дозе 0,4 мл подкожно в область спины в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8 (по 10 голов на каждое разведение). Вакцину разводили "Плацебо" с использованием аналогичного адъюванта. Контрольное заражение проводили на 21 день после вакцинации путем подкожного введения 104,0 ЛД50/мл гомологичного вируса ящура, адаптированного к взрослым белым мышам. Результаты исследований представлены в табл.4. Из данных табл.4 видно, что вакцины, изготовленные на основе предлагаемого адъюванта, не уступают по иммуногенной активности вакцине, изготовленной с использованием адъюванта-прототипа. Пример 8. В опыте на свиньях были изучены иммуногенная активность и реактогенность вакцин с предлагаемым адъювантом и адъювантом-прототипом. Препараты вводили в дозе 1 мл внутримышечно в область шеи в разведениях 1:10, 1: 100, 1:1000 (по 4 головы на каждое разведение). Вакцину разводили "Плацебо" с использованием аналогичного адъюванта. Через 10 дней после вакцинации всех привитых и 2 контрольных животных заражали 10000 ИД50/0,2 мл гомологичным вирусом в слизистую языка. Через 8 дней после заражения учитывали результаты и оценивали реактогенность по месту введения. Результаты приведены в табл.5. Как видно из табл. 5, вакцина с предлагаемым адъювантом создает у свиней напряженный иммунитет, не уступая при этом вакцине с масляным адъювантом-прототипом. Кроме того, при патологоанатомическом исследовании в месте введения вакцины с предлагаемым адъювантом не отмечено воспалительных реакций, тогда как у 7 из 12 животных, привитых вакциной с адъювантом-прототипом, установлено образование гранулем и абсцессов. Пример 9. Предлагаемый адъювант испытан также в составе эмульсионной вакцины против ИБК, содержащей, мас.%: Полиэтилсилоксановая жидкость (ПЭС-3) - 45 АПС - 5 Антиген - 50 Антигеном служила инактивированная димером этиленимина суспензия ткани фабрициевой сумки. Вакцину против ИБК готовили аналогично ПЯВ. Приготовили 3 опытных образца эмульсионной вакцины против ИБК. В качестве контроля использовали сорбированную вакцину против ИБК, приготовленную в соответствии с классической прописью. Для изучения иммуногенной активности каждой вакциной иммунизировали внутримычешно по 10 голов 30-дневных цыплят (по 0,5 мл в область грудной мышцы). Через 30 дней после вакцинации у цыплят отбирали пробы крови, а затем их убивали и проводили патологоанатомическое исследование. Иммунный ответ у цыплят изучали в реакции диффузной преципитации (РДП) по накоплению титров антител в сыворотках крови. В табл. 6 представлены результаты иммунизации цыплят инактивированной эмульсионной вакциной против ИБК с использованием предлагаемого адъюванта в сравнительном аспекте с сорбированной вакциной. Как видно из табл. 6, предлагаемый адъювант стимулирует достаточно высокий синтез антител у цыплят в титре 1:8 - 1:16 (средний показатель по группе сывороток), что свидетельствует о способности эмульсионной вакцины активно вовлекать в процесс иммуногенеза иммунокомпетентные клетки организма. Индивидуальные титры антител в сыворотках крови цыплят составляют 1:4 - 1:32. За весь период опыта (30 дней) при ежедневном осмотре птиц не наблюдалось клинических признаков инфекционного бурсита (болезни Гамборо). При массовом убое и вскрытии птиц не обнаруживалось никаких изменений ни во внутренних органах, ни на месте введения инактивированной эмульсионной вакцины. Следовательно, вакцина на основе предлагаемого масляного адъюванта безвредна, обладает высокой иммуногенной активностью и пригодна для иммунизации против ИБК. Пример 10. Предлагаемый адъювант испытан также в составе эмульсионной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и буйволов, содержащей, мас.%: Полиэтилсилоксановая жидкость (ПЭС-3) - 43 АПС - 7 Антиген - 50 Антигеном служила формалинизированная суспензия производственного штамма пастерелл, используемая для изготовления коммерческой эмульсионной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец, буйволов. Эмульсионную противопастереллезную вакцину готовили путем эмульгирования концентрированного пастереллезного инактивированного антигена в масляном адъюванте на лабораторном размельчителе тканей РТ-2. К стерильному и охлажденному до комнатной температуры адъюванту при постоянно работающей мешалке (3000 об/мин) постепенно добавляли антиген. Окончательное эмульгирование проводили при 5000 об/мин в течение 5 - 7 мин. Было приготовлено и испытано 4 опытных образца вакцины. После проверки вакцины на стерильность (путем высева на различные питательные среды) приступили к дальнейшим исследованиям препарата. Стабильность и вязкость противопастереллезной вакцины и реактогенность адъюванта проверили аналогично эмульсионным противоящурным препаратам. В результате проведенных исследований установлено: все 4 образца вакцины термостабильны при температуре 37oC в течение двухнедельного выдерживания в термостате, стабильны при центрифугировании в течение 30 мин при 3000 об/мин, при температуре 20 oC имели относительно низкую вязкость (140 мПас), коэффициент реактогенности адъюванта составил 30%. Вышеперечисленные показатели отвечали существующим требованиям, предъявляемым к противопастереллезной вакцине. Иммуногенную активность противопастереллезной вакцины определяли путем качественной оценки в опытах на взрослых кроликах массой 2,5 - 3 кг. Препараты вводили внутримышечно однократно 5 кроликам в дозе 1,5 мл в области бедра, три животных служили контролем. Через 30 дней после вакцинации животных заражали предварительно подтитрованной смертельной дозой вирулентного штамма пастерелл. Результаты контрольного заражения приведены в табл.7. Из табл.7 следует, что все опытные вакцины обладали высокой иммуногенной активностью. Безвредность вакцины определяли на взрослых кроликах массой 1,5 - 2 кг и белых мышах массой 18 - 20 г в сравнении с эмульсионной вакциной против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и буйволов. На каждую серию вакцины использовали 32 кролика и 5 белых мышей. Вакцину вводили кроликам внутримышечно в дозе 3 мл (по 1,5 мл в области каждого бедра), мышам - подкожно в области спины по 0,3 мл. Результаты проверки представлены в табл.8. Результаты испытания на кроликах и мышах показали, что животные, привитые вакциной с предлагаемым адъювантом и коммерческой вакциной, на протяжении периода наблюдения были живы, следовательно, вакцина на основе жидкости ПЭС-3 и эмульгатора АПС безвредна. Из вышеизложенного следует, что предлагаемый адъювант обладает более низкой реактогенностью по сравнению с прототипом наряду с прототипом наряду с высокой иммуностимулирующей активностью. Кроме того, препараты, полученные с использованием предлагаемого адъюванта, стабильны и легко инъецируемы. Экономический эффект от использования предлагаемого адъюванта будет складываться из уменьшения потерь мяса ввиду незначительных изменений на месте введения препаратов, изготовленных с его использованием. Предлагаемый адъювант найдет применение при изготовлении и применении средств диагностики и специфической профилактики инфекционных болезней у различных видов домашних и сельскохозяйственных животных. Источники информации 1. De Mello P.A. The use of oil adjuvanted foot-and-mouth disease vaccine in endemie areas. - Bol. CPFA, 1982, 45 - 46, 33 - 42. 2. Bahnemann H.G. Large scale application of oil adjuvanted foot-and-mouth disease vaccine. In. : Europe. Comm. Control FMD. Rio de Janeiro, Brasil, 15 - 10 Oct. 1985. Rome, 1986, 132 - 135. 3. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адъюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). - М.: Медицины, 1969, 20. 4. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа A, типа O, типа C, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ МСХ СССР 24.01.91 (прототип). 5. ТУ 38.101 1224-89. 6. ТУ 38.401 841-91. 7. ТУ 38.401 764-89. 8. ТУ 0253-002-00151911-93. 9. ТУ 38.401 139-93. 10. ГОСТ 13004-77.Формула изобретения
Адъювант, включающий эмульгатор и масляную основу, отличающийся тем, что в качестве эмульгатора он содержит алкилмодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер общей формулы
где A - [-C2h5O]x [C3H6O]y - R; R - H; Ch4; C4H9; COCh4, x = 9 - 36; y = 0 - 33; a = 4 - 62; b = 1 - 3; c = 0 - 30; m = 7 - 17, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: Сополимер - 5 - 10 Масляная основа - 90 - 95.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 16.01.2003
Номер и год публикации бюллетеня: 10-2004
Извещение опубликовано: 10.04.2004
NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение
Извещение опубликовано: 27.02.2005 БИ: 06/2005
www.findpatent.ru
