Вакцины завтрашнего дня. Вакцины на основе трансгенных растений

Вакцины на основе вирусоподобных частиц и трансгенных растений

Протективные антигены многих оболочечных и безоболочечных вирусов образуют вирусоподобные частицы, которые представляют собой капсидные белки, формирующие оболочечные структуры без вирусной нуклеиновой кислоты внутри. Такие структуры не образуются индивидуальными очищенными капсид- ными белками. Некоторые из эпитопов ВПЧ сформированы двумя капсиднымибелками, что обеспечивает им некоторое преимущество функционирования в качестве иммуногенов. Первоначально было показано, что в процессе трансляции in vitro пикорна- вирусной геномной РНК, в которой отсутствовала большая часть 5'-кодирующей области генома, капсидные белки могут подвергаться неполной самосборке. Первым успехом на этом пути явилась вакцина против гепатита В из ВЧП, полученных в дрожжах с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Когда клонированные в плазмиды гены, кодирующие синтез и процессинг капсидных белков некоторых безоболочечных вирусов, экспрессируются, образуются индивидуальные капсидные белки, которые объединяются в вирусоподобные частицы [ 1130]. Такие «пустые» или не всегда пустые ВПЧ полностью лишены нуклеиновой кислоты, а потому безопасны. В иммуногенном отношении они могут быть эквивалентны цельновирионным инактивированным вакцинам, но в отличие от них, не имеют повреждений эпитопных участков, которые могут произойти в процессе инактивации. Иммуногенность ВПЧ была показана у пикорна-, калици-, ро- та- и орбивирусов. Однако вакцины на основе ВПЧ пока не получили коммерческого использования. Возможной причиной явился низкий выход антигенного продукта, высокая стоимость приготовления и менее выраженная иммуногенность по сравнению с существующими вакцинами, в том числе с цельновирион- ными инактивированными адъювантными вакцинами [1130, 1135]. Важным преимуществом ВПЧ является их эффективность при оральном и назальном применении, что открывает новые перспективы в создании иммунитета слизистых. Неспособность некоторых вирусов размножаться в культуре клеток является препятствием в создании живой и инактивированной вакцин. Однако, данная проблема может быть решена наличием у них способности образовывать вирусоподобные частицы, которые являются обильным источником капсидного антигена [645]. ВПЧ оказались безопасными и иммуногенными при испытании на лабораторных животных и взрослых добровольцах [1307, 1534]. Обнадеживающие результаты получены с компонентной рекомбинантной вакциной против вируса Норволк на основе капсидного антигена для орального применения [281, 645]. Полные вирионы калицивируса кошек и 15S субвирусные частицы содержат основной капсидный белок, а также общий эпитоп нейтрализации [1528]. Раздельная иммунизация кроликов вирионами и 15S -частицами показала, что оба антигена индуцируют синтез ВН-антител. Полученные данные позволили считать перспективным создание вакцины из субвирусных частиц 15S. Специфический клеточный и антительный ответ наблюдали у мышей после назального или орального введения ВПЧ вируса папилломы человека. При обоих способах иммунизации наблюдали синтез IgA на слизистых [615, 703]. Особый интерес в последнее время вызвала перспектива использования трансгенных растений для изготовления субъединичных вирусных вакцин. Установление способности трансгенных растений к экспрессии антигена вируса гепатита В (HBsAg) открыло возможность создания съедобных компонентов растений в качестве оральных вакцин [128, 1020]. Помимо HBsAg, разработаны способы экспрессии антигенов вируса иммунодефицита человека, ящура, риновируса в листьях вигны. Продуктивность полипептида gp41 ВИЧ достигала 2 г на кг биомассы листьев вигны. Иммунизация животных этим полипептидом сопровождалась образованием вируснейтрализу- ющих антител. Показана возможность экспрессии протективного гликопротеина вируса бешенства в трансгенных томатах [ 128]. Экспрессия генов капсидных белков вируса Норволк в трансгенных растениях сопровождалась образованием ВПЧ, которые вызывали иммунный ответ при испытании на лабораторных животных и добровольцах [456, 1307, 1534]. Результаты этих исследований указывали на возможность создания субъединичной вакцины для профилактики гастроэнтерита, вызываемого этим вирусом преимущественно у детей [456, 732]. Главный структурный белок VP60 вируса геморрагической болезни кроликов экспрессировался в трансгенных растениях картофеля. Иммунизация кроликов экстрактом листьев такого картофеля вызывала образование специфических антител в высоком титре и защищала кроликов от летальной инфекции при заражении [456]. Получены трансгенные растения люцерны, экспрессирующие главный им- муногенный белок VP1 вирусаящура. У мышей, парентерально иммунизированных экстрактом листьев и получавших с пищей свежесобранные листья трансгенных растений, развивался специфичный иммунный ответ и создавалась защита против экспериментального заражения вирусом ящура [1657]. Аналогичные исследования проведены с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС). Белок S или его фрагмент, содержащий четыре антигенных сайта (А, В, С и Д), экспрессированные в бакуловирусной системе, вызывали образование вируснейтрализующих антител у свиней [1549]. Созданы трансгенные картофель [722] и моцерна [1550], экспрессирующие гликопротеин S вируса ТГС. Скармливание таких растений животным вызывало образование специфических вируснейтрализующих антител. Полученные результаты позволили высказать мнение, что, возможно, в ближайшем будущем из белков генетически модифицированных растений будут готовить «пищевые» и «кормовые» вакцины [456, 732] против некоторых заболеваний преимущественно для иммунизации молодых организмов. 

Вакцины завтрашнего дня

Благодаря развитию новых технологий наш словарь обогащается новыми понятиями. Свежий пример – съедобные вакцины. Это уже почти реальность: крепкий сибирский помидорчик с трансгенной "начинкой", кандидатная вакцина против вирусов гепатита и ВИЧ.

Вакцинация, изобретенная более 200 лет назад, стала эффективным и доступным способом защиты населения от инфекционных заболеваний. Первые вакцины получали методом проб и ошибок, но благодаря бурному развитию молекулярной биологии и генетической инженерии открылись небывалые возможности для создания новых способов иммунизации и новых вакцин.

Сибирские ученые задались целью создать съедобную профилактическую вакцину против двух грозных заболеваний современности – гепатита В и СПИДа, использовав в качестве носителя один из наиболее популярных овощей. Весьма необычным был сам подход - исследователи решили встроить в "сеньора Помидора" ген, кодирующий искусственный белок-иммуноген. Насколько удачной оказалась эта попытка - судить вам, читатель!

В мае 1796 года произошло событие «ценою» в миллионы спасенных человеческих жизней. Английский врач Эдуард Дженнер открыл способ предохранения от грозного заболевания — натуральной оспы — путем заражения легкой формой схожего заболевания, оспой коров. Эстафету Дженнера принял знаменитый французский ученый Луи Пастер — настоящий «микробный» Леонардо Да Винчи XIX века. С этого времени вакцинация (от лат. vaccus — корова) стала наиболее популярным, эффективным и доступным способом защиты населения от заболеваний, вызванных патологическими микроорганизмами, особенно — вирусами, фармацевтические препараты против которых практически отсутствуют.

Суть вакцинации заключается в том, что в организм вводятся убитые или ослабленные микробы, что обеспечивает развитие у человека иммунитета, т. е. невосприимчивости к болезни. Патогенные агенты «несут» на себе антигены, молекулы разной природы (белки, полисахариды и т. д.), которые распознаются организмом и вызывают защитный иммунный ответ. Первые вакцины получали методом проб и ошибок, но в наше время, благодаря развитию молекулярной биологии и генетической инженерии, открылись небывалые возможности для создания новых способов иммунизации и новых вакцин.

Среди них — ДНК-вакцины на основе генно-инженерных плазмид, микрокапсулированные и «леденцовые» вакцины с углеводом трегалозой, синтетические вакцины из искусственно синтезированных белков и полисахаридов... Требования к новым вакцинам едины: они должны быть безопасными, недорогими, простыми в использовании, длительно сохраняться и транспортироваться без использования холодильного оборудования. Все эти требования сполна удовлетворяют вакцины на основе генетически модифицированных растений со встроенными фрагментами ДНК патогенных микроорганизмов: их применение может стать революционным событием в профилактической медицине.

Съел — и в порядке!

Слизистые (иначе мукозные, от англ. mucosal) оболочки пищеварительного, дыхательного и мочеполового трактов являются обычными местами проникновения и колонизации для многих патогенных микроорганизмов. Защита этих оболочек обеспечивается иммунокомпетентными клетками, организованными в специальные лимфоидные ткани. Эта так называемая мукозная иммунная система является первым барьером на пути инфекций в отличие от исторически первой изученной системной иммунной системы, обеспечивающей защиту внутренних органов организма.

Стимуляция гуморального иммунитета в результате инъекционной вакцинации обычно эффективно предотвращает системные инфекции, но при этом не защищает слизистые оболочки. Мукозная же иммунизация чаще всего приводит к стимуляции как мукозного, так и системного иммунных ответов.

Однако проводить иммунизацию через слизистые оболочки непросто из-за ряда физиологических барьеров, препятствующих проникновению антигенов. Оболочка же растительных клеток обеспечивает антигену естественную защиту при прохождении через пищевод и желудок с кислым пищеварительным соком. Затем «упакованный» антиген благополучно достигает кишеч­ника и соответственно, — мукозной иммунной систе­мы.

Привлекательным свойством растительных вакцин является не только их потенциальная дешевизна, простота хранения и применения, но и огромный спектр самих пищевых прототипов — овощей, фруктов, злаков. Более того, можно создать растения, продуцирующие одновременно антигены разных инфекционных агентов, т. е. съедобные многокомпонентные вакцины! Не такой ли — почти «идеальной» — представлялась вак­цина будущего основоположникам вакцинологии более 200 лет назад?

Начинка для Сеньора Помидора

Ученые из Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (наукоград Кольцово, Новосибирская область) в содружестве с сотрудниками Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск) и новосибирского Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН поставили перед собой задачу создать кандидатные съедобные вакци­ны против вируса гепатита В человека и вируса иммунодефицита человека на основе трансгенных растений томата. Проект получил финансовую поддержку Министерства сельского хозяйства США (грант № 2176р Международного научно-технического центра).

Вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатита В, к сожалению, хорошо известны и не нуждаются в «ре-кламе». Отметим только, что в современном мире распространение этих инфекций приобретает характер эпидемии. По данным ВОЗ смертность от СПИДа достигает 2–3 млн, а от гепатита В — 1 млн человек в год! Поэтому неудивительно, что эти болезни привлекают к себе пристальное внимание биотехнологов во всем мире.

Конструируем химеру

На основе этой методологии сотрудником ГНЦ ВБ «Вектор» А. М. Ерошкиным вместе с коллегами был рассчитан полиэпитопный белок-иммуноген против ВИЧ, названный ТВI (T- and B-cellular immunogen). Затем для этого белка синтезировали кодирующую ДНК-последовательность и встроили ее в кишечную палочку E. coli. У животных, иммунизированных полученным рекомбинантным белком, был обнаружен как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ против вируса иммунодефицита, что доказало правильность используемого подхода.

Исследователи пошли дальше по пути создания именно съедобных вакцин. Было решено встроить подобную генетическую конструкцию в растения томатов, в результате чего в них должен был синтезироваться «непри­родный» белок. И не просто искусственный, но еще и химерный, поскольку к набору из девяти иммуногенных эпитопов белков ВИЧ-1 (TBI) был добавлен еще и поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). В результате ожидалось получить мультивалентную синтетическую вакцину одновременно против двух вирусных заболеваний. Генетические конструкции для переноса в растения были созданы сотрудниками «Вектора» и ИХБиФМ, а перенос их в растения томата и селективный отбор трансгенных растений осущестили сотрудники СИФИБРа.

Цена «золотых яблок»

Здесь следует обратить внимание на следующий нюанс. Вакцина — не лекарство, она является лишь про­филактическим средством. Как проверить ее эффективность, особенно в случае тяжелейших, более того — смертельных заболеваний? В этом случае нам, пожалуй, не стоит следовать не слишком гуманному при­меру гениального Дженнера, проверившего свое открытие на восьмилетнем ребенке. Нельзя ведь, в самом деле, накормив добровольцев (если таковые и нашлись бы) помидорами, затем заражать их ВИЧ-инфекцией и смотреть на результат?

Поэтому в «бой», как всегда, вступили лабораторные мыши. Правда, СПИДом, как, впрочем, и гепатитом, мыши не болеют, однако их иммунная система должна была отреагировать на интервенцию антигенного белка. Помидоры мыши тоже недолюбливают, поэтому массу из измельченных плодов сотрудники «Вектора» через катетер вводили животным прямо в пищевод. Для оценки же мышиного иммунитета использовался стандартный иммуноферментный анализ (ИФА) на наличие антител к вирусам гепатита В и ВИЧ-1.

Эксперимент, в котором мышей кормили помидорами три раза с интервалом в 2 недели, закончился совсем недавно — в сентябре этого года. И его можно однозначно назвать успешным: уже после второго кормления в крови иммунизированных животных значительно увеличился уровень антител против вируса гепатита В. Более того, мукозный иммунный ответ, судя по результатам анализа мышиных фекалий, начинался еще раньше — уже после первого кормления — и сохранялся до конца эксперимента. В отношении ВИЧ картина была схожей и, хотя уровни выявленных антител были не столь высоки, они достоверно отличались от анало­гичных анализов у контрольных животных, сидевших на «диете» из обычных нетрансгенных томатов.

Таким образом, можно сказать, что кандидатная съедобная вакцина одновременно против двух вирусных инфекций — гепатита В и ВИЧ-инфекции (СПИДа) — в принципе получена. В этой фразе отметим два слова — в принципе и кандидатная, которые, как макушка айсберга, обозначают проблему.

Вообще-то, планов у участников проекта много: кроме томатов, хотелось бы использовать и другие привлекательные носители трансгенов, например, морковь, сладкий перец, злаки, объединяя свои усилия с учеными из других городов и институтов. А еще можно попробовать увеличить продуктивность растений-вакцин, трансформируя не только их ядерный геном, но и генетический материал многочисленных хлоропластов, в которых происходит фотосинтез. Судя по нашим предварительным результатам, перспективным может оказаться «комбинированный» путь, т. е. сочетание съе­добной вакцины с инъекцией плазмидных ДНК-вакцин. Эффективность полученной вакцины оценивалась косвенным путем, — почему бы не перейти к прямым клиническим испытаниям — например, на приматах? Но в Сибири бананы не растут, а уж сколько стоят здесь обезьяны…

И так во всем, — когда речь заходит о каких-то мас­штабных проверках, доклинических и прочих, о выведении устойчивых трансгенных линий растений, на перед­ний план выходит сакраментальный для нашей страны призыв: «Ищите деньги!». Пока будущее — в тумане. А для продолжения работ требуется не менее 200 тысяч долларов в год. Интересно было бы знать — покры­вает ли такая сумма хотя бы суточные траты Центра исследования СПИДа, что под Вашингтоном?

scfh.ru

Life science. In progress.: Вакцины из теплицы

Самый эффективный способ борьбы с инфекционными заболеваниями – вакцинация, и более доступные сопоры получения вакцин могли бы значительно расширить их применение. Первые вакцины готовились из убитых или живых, но ослабленных, патогенов. Сейчас такие вакцины тоже используются против ряда заболеваний. Более безопасные вакцины включают в качестве иммуногена 1-2 белка рекомбинантного происхождения, которые нарабатываются в культуре клеток или микроорганизмов и, затем, очищаются. Они гораздо более безопасны, но получить их сложнее. Ещё один, ограничивающий распространение вакцин, фактор – то, что это, в основном, инъекционные препараты, то есть для их введения в организм необходимо, чтобы они были стерильны, а процедура проводилась с участием специалиста, в соответствующих условиях, с использованием одноразовых игл и шприцов. Это увеличивает их стоимость и возможность применения в условиях развивающихся стран. Создание растений, которые могут употребляться как вакцина, облегчит его транспортировку вакцины (соблюдение температурного режима) и её использование. До 90% стоимости вакцины может составлять очистка антигена, если для вакцинации использовать растительное сырьё, не нуждающееся в дополнительной сложной очистке, и поступающее в организм перорально – экономия будет огромна.

lsciinprogress.blogspot.ru

Растения-биофабрики

Развитие биотехнологий открыло новые возможности использования живых организмов на благо человечества. Методы генетической инженерии позволяют производить различные вещества в живых объектах, следовательно, мы можем использовать эти объекты в качестве природных «фабрик». Центральная догма молекулярной биологии в общем случае гласит: ДНК → РНК → белок. Именно белок часто является конечным продуктом биотехнологического производства: это может быть инсулин, интерфероны, антитела, ферменты, вакцины... Нам лишь нужно задать программу и «записать» ее в ДНК, а живой объект всё сделает сам. В качестве «фабрик» используют клетки дрожжей, бактерий, растений, а также культуры клеток насекомых и млекопитающих. В этой статье речь пойдет о растительных биофабриках.

Что такое растение-биофабрика?

Как объяснить понятие «растение-биофабрика»? Можно сказать, что это природное предприятие, которое будет изготавливать нужный нам биопродукт. В отличие от обычной фабрики, на таком предприятии будут трудиться не рабочие, а компоненты клеток: полимеразы нуклеиновых кислот, рибосомы, тРНК и многие другие. А производить они будут белок.

Почему именно растения?

Рисунок 1. Сравнение систем продукции рекомбинантных белков (от самых привлекательных «+» до наименее привлекательных «—»).

В настоящее время для наработки белков чаще всего используют бактерий, дрожжи, культуры клеток насекомых и млекопитающих. Очень привлекательной системой синтеза и накопления рекомбинантных белков (экспрессионной системой) являются и растения, и тому есть несколько причин. Прежде всего, в растительных тканях нет риска загрязнения рекомбинантного белка вирусами животных и прионами — инфекционными белками [1]. Растительные клетки обеспечивают правильную модификацию рекомбинантного белка, характерную для эукариотических клеток [2, 3]. Также большое значение имеют стоимость, простота и время. На рисунке 1 сравнивается несколько основных экспрессионных систем.

Из таблицы видно, что идеальной системы экспрессии не существует. Сегодня в России шире всего распространены бактериальные системы с E. coli в качестве самой популярной «рабочей лошадки». Еще в 2009 г. на долю этого микроорганизма приходилось 85% от всех систем экспрессии, несмотря на ряд существенных недостатков.

У каждой биофабрики есть свои плюсы и свои минусы. Но растительная система для многих ситуаций оказывается наиболее привлекательной.

Как заставить растение производить белок?

Для того чтобы растение производило нужный белок, в клетки этого растения необходимо внести чужеродный генетический материал — последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность нужного белка.

Первый этап модификации растений с применением методов генетической инженерии включает поиск и выделение (или синтез) генов, которые будут перенесены в растительный геном. Гены, представляющие интерес для биотехнологов (целевые гены), могут быть «выращены» химическим путем, а также наработаны с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции). Затем целевой ген встраивается в подходящий вектор*, который и доставляет его к месту производства белка — подобно тому, как вагон с сырьём прицепляется к паровозу, направляющемуся к фабрике.

Как перенести в растительную клетку необходимую последовательность ДНК?

В настоящее время чаще используют два способа.

Первый связан с использованием природных генно-инженерных «навыков» почвенной агробактерии Agrobacterium tumefaciens, способной переносить фрагменты ДНК в растительную клетку, то есть модифицировать ее генетически. Этот процесс в природе происходит повсеместно и регулярно. В природной A. tumefaciens помимо хромосомы содержится Ti-плазмида, в состав которой входит так называемая Т-ДНК (transferred DNA) длиной 12–22 т.п.н., встраивающаяся в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов — производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии.

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее почти идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений (а при некоторых стараниях можно добиться заражения и однодольных, в том числе злаков). Во-вторых, интегрированная в геном растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя. Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения — заражение его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, дальнейшее же предоставляется естественному ходу событий. Необходимо только уметь встраивать нужные гены в Т-сегмент плазмидной ДНК.

После проникновения агробактерий в межклеточное пространство Т-ДНК переносится из агробактерии в ядро растительной клетки и встраивается в хромосомную ДНК. Далее происходят транскрипция и трансляция — синтезируется целевой белок. Сама бактерия в клетку при этом не проникает, а остается в межклеточном пространстве.

Второй способ — баллистическая трансформация с использованием генной пушки. Маленькие золотые или вольфрамовые частицы покрывают чужеродной ДНК и «выстреливают» в молодые растительные клетки. Этот метод позволяет встраивать нужные гены не только в хромосомы растений, но и в геном их органелл — пластид. Это очень полезно в первую очередь для получения растений, защищенных от вредителей, но при этом безопасных для опылителей: ведь трансгены не экспрессируются в не имеющих пластид цветках. Недавно таким способом создали трансгенный (а именно — транспластомный) картофель, в хлоропластах которого образуется и сохраняется неповрежденной двухцепочечная РНК, блокирующая синтез жизненно важного белка колорадского жука — β-актина. Поедая листья такого картофеля, личинки жуков погибают в считанные дни [6].

Менее распространенные, но всё же действенные способы трансформации — электропорация и трансформация с помощью вирусов.

Постоянная и временная экспрессия гена

Рисунок 2. Транзиентная экспрессия чужеродных генов в растениях с помощью агроинфильтрации. А — общий механизм процесса, Б — визуализация синтезируемого в растении репортера — GFP (зеленого флуоресцентного белка) — освещением листа ультрафиолетом.

В генетической инженерии растений можно встретить такие понятия: генетически модифицированное (ГМ, или трансгенное) растение и растение, обеспечивающее транзиентную (временную) экспрессию гена. В чем же разница?

Если речь идет о трансгенном растении, то подразумевается, что чужеродная ДНК интегрирована в хромосому. К настоящему времени получены десятки видов трансгенных растений, в геном которых перенесена ДНК, кодирующая различные белки медицинского назначения, такие как антигены различных возбудителей инфекционных заболеваний, терапевтические белки и моноклональные антитела [7, 8, 9]. Однако количество синтезируемого целевого белка в таких растениях обычно небольшое (менее 1% от общего растворимого белка).

При транзиентной экспрессии ДНК обычно не включается в ядерный геном, не реплицируется и не передается по наследству. Этот вид экспрессии не постоянный, однако некоторое время в одной клетке может присутствовать большое количество копий чужеродной ДНК, что обеспечивает высокий уровень синтеза конечного продукта. При наработке белков в растениях данный вариант наиболее эффективен. Мы как бы арендуем фабрику, и это оказывается более рентабельным, чем ее покупка. На рисунке 2 представлена модель переноса в растительную клетку ДНК для транзиентной экспрессии (в роли курьера — Agrobacterium tumefaciens).

Что может производить растение-биофабрика?

Использование растений в биотехнологии развивается в нескольких направлениях (рис. 3).

Рисунок 3. Возможности использования растений в биотехнологических целях.

Первое направление включает в себя создание растений с новыми свойствами. О несомненных плюсах трансгенных растений сказано немало [10]. Так, ведется разработка сортов, устойчивых одновременно к насекомым-вредителям и болезням, вызываемым вирусами, плесневыми грибками и бактериями. Идут исследования, которые позволят вывести сорта сельскохозяйственных культур, переносящих неблагоприятные климатические и химические условия, например, засуху и засоленность почвы [11]. Создаются продукты, в которых значительно увеличена доля полезных и питательных веществ, снижено содержание насыщенных жиров и аллергенов. Особое внимание уделяется разнонаправленным модификациям риса — ценного и относительно недорогого продукта питания, который можно было бы производить во всех беднейших регионах мира, включая засушливые [12].

В эту же группу можно отнести трансгенные растения, которые используются в качестве модельных объектов для изучения фундаментальных проблем функционирования генов.

Многие ГМ-растения сейчас находятся в массовом производстве. Это соя, кукуруза, картофель, маслянистые растения (рапс и подсолнух) и многие другие (рис. 4). Странами-лидерами в производстве таких растений являются США, Канада, Аргентина и Бразилия. Догоняют их Китай и Япония. С рядом растений работают некоторые страны ЕС и Австралия.

Среди компаний, разрабатывающих трансгенные растения, можно отметить Calgen, Monsanto, Ciba Seeds. Несмотря на то, что ГМ-растения продаются на многих рынках мира, дискуссии о безопасности их использовании еще не закончены. Больше всего слухов и скандалов разворачивается вокруг компании «Монсанто». Основная продукция этой фирмы — генетически модифицированные семена кукурузы, сои, хлопка, а также самый распространенный в мире гербицид «Раундап» (непатентованное название — глифосат).

Основанная Джоном Фрэнсисом Куини в 1901 году как чисто химическая компания, «Монсанто» эволюционировала в концерн, специализирующийся на высоких технологиях в области сельского хозяйства. Ключевым моментом в этой трансформации стал 1996 год, когда «Монсанто» выпустила на рынок первые генно-модифицированные сельскохозяйственные культуры: сою «Раундап Рэди» (Roundup Ready, RR), устойчивую к глифосату, и хлопок «Боллгард» (Bollgard), устойчивый к насекомым-вредителям (гусеницам).

Рисунок 4. Примеры трансгенных растений.

В марте 2005 года «Монсанто» приобрела крупнейшую семеноводческую компанию Seminis, специализирующуюся на производстве семян овощей и фруктов, в 2007–2008 годах поглотила 50 компаний — производителей семян по всему миру, после чего подверглась жесткой критике со стороны общества. В знак протеста против генетических манипуляций биотехнологического гиганта 25 мая 2013 года прошел «Марш против „Монсанто“», в котором приняли участие более 2 млн человек на шести континентах, в 52 странах мира.

В Центре «Биоинженерия» Российской академии наук на протяжении двух десятилетий ведутся работы по генетической инженерии растений — как для фундаментальных исследований, так и для сельского хозяйства. Были созданы генетически модифицированные сорта картофеля, устойчивые к колорадскому жуку, сорта свёклы, устойчивые к гербицидам и вирусам и др. Эти культуры могли бы решить ряд задач сельского хозяйства, но из-за до сих пор действующего в России законодательного ограничения они не выращиваются в открытом грунте. Само собой, этот запрет более чем странен, ведь ввоз ГМ-продукции в страну разрешен.

Второе направление представляет собой создание съедобных вакцин. В данном случае получают генно-модифицированное растение, синтезирующее вакцину. Такой привлекательной кажется идея: лежишь под пальмой, ешь банан, и ни одна тропическая зараза не берет!

Рисунок 5. Препарат трипсина, полученного в растениях (Sigma).

Концепцию производства вакцин в растениях впервые сформулировал Xью Мэйсон с соавторами [13]. Они предприняли попытку получения съедобной вакцины против вируса гепатита В на основе трансгенного табака. На следующем этапе был создан ГМ-картофель, продуцирующий поверхностный антиген вируса гепатита В. При скармливании мышам клубней такого картофеля наблюдали развитие специфического иммунного ответа. В 1999 г. были начаты эксперименты на добровольцах, и у людей, употреблявших в пищу сырые клубни картофеля, наблюдали формирование специфического иммунитета. Также были получены съедобные вакцины против вируса гепатита В на основе люпина и салата.

Созданы трансгенные растения картофеля и табака, производящие белок нуклеокапсида вируса Норфолк, вызывающего у людей острый гастроэнтерит и устойчивого к спиртовым антисептикам. Появился и трансгенный картофель, синтезирующий полипептид LT-B — субъединицу термолабильного токсина Е. coli, вызывающего диарею. Однако, несмотря на активные исследования в этой области, коммерческих препаратов на сегодняшний день нет.

Третье направление связано с наработкой в растениях определенных продуктов, которые затем выделяются из растений и могут быть использованы, например, в качестве лекарственных препаратов. Биотехнологическими компаниями по всему миру уже создано большое количество ГМ-растений для получения белков, в том числе и медицинского назначения [14]. Среди компаний, деятельность которых основана на использовании трансгенных растений, следует отметить фирмы Рrotalix (Израиль), Medicago (Канада), LemnaGene (Франция), Planet Biotechnology (США), ProgyGene (Люксембург), Сhlorogen Inc. (США), SemBioSys Genetics (Канада) и Bayer AG (Германия). Из белков медицинского назначения у производителей наиболее популярны инсулин, лизоцим, лактоферрин, коллаген, липаза, антитела, вакцины и др. Многие из этих препаратов уже проходят клинические испытания. А вот трипсин уже можно купить у компании Sigma (рис. 5).

При наработке в растительных клетках продуктов медицинского назначения тоже используют метод агробактериальной трансформации, обеспечивающей транзиентную экспрессию генов на высоком уровне. Очевидными преимуществами этих систем являются простота манипуляций, скорость, низкая стоимость и высокий выход конечного продукта. Кроме того, в данном случае возможен синтез сложных белков, состоящих из нескольких субъединиц. Этот способ позволяет получать в течение нескольких дней белок в больших количествах (до нескольких граммов белка на килограмм массы растения). Выход продукта начинается уже через три часа (!) после проникновения агробактерий в клетку и переноса ДНК, а экспрессия сохраняется до 10 дней. Максимум наработки определяется для каждого белка индивидуально, но в среднем это 3–4 суток. Суммарно на получение белков в растениях уходит 2–3 недели (рис. 6).

Рисунок 6. Принципиальная схема экспрессии генов целевых белков в растениях. Весь процесс получения белка занимает 2–3 недели.

В растениях уже нарабатываются вакцины от вирусов папилломы человека, гепатита В [15], гриппа, папилломы крупного рогатого скота [16], африканской катаральной лихорадки, герпеса рогатого скота [17], ящура [18] и др.

В Центре «Биоинженерия» также ведутся работы по экспрессии терапевтических белков в растениях. Так, в клетках Nicotiana benthamiana (вид табака) были произведены вакцинные препараты против вируса гриппа [19, 20]. Основой препарата служит высококонсервативный вирусный белок M2, который присоединен к белку-носителю для увеличения иммуногенности. Носителем может быть кóровый белок вируса гепатита В или бактериальный флагеллин. В случае флагеллина вакцинный препарат применяют интраназально, что является явным преимуществом. А использование высококонсервативной последовательности белка M2 делает вакцину универсальной, что исключает необходимость изготовления каждый год всё новых и новых ее вариантов. Эти вакцинные препараты показали хорошие результаты по иммуногенности и протективности в экспериментах с лабораторными животными; следующим этапом должно стать клиническое тестирование.

Об успехах в мире

Персонифицированная терапевтическая вакцина для лечения лимфомы, полученная с помощью транзиентной экспрессии в растении Nicotiana benthamiana, уже прошла I и II фазы клинических испытаний [21]. На данный момент (2015 год) ожидается старт III фазы. Растительная вакцина против пандемического гриппа H5N1 проходит II фазу клинических испытаний, результаты будут опубликованы в июне 2015 г. [22, 23]. Вакцина была разработана компанией Medicago. Стандартный процесс получения этой компанией вакцинных белков в растениях показан на видео.

Клинические испытания вакцинных препаратов занимают продолжительное время (около 10 лет). Невольно возникает вопрос с вакциной от гриппа, так как каждый год появляются новые штаммы, и будет ли прошедшая клинические испытания вакцина актуальной? Здесь большее значение имеет технология получения препарата. Новый тип вакцины проходит полный цикл клинических испытаний, а затем уже по отработанной методике может быть получена вакцина с учетом циркулирующих штаммов вируса. Так, сейчас сезонные профилактические прививки от гриппа получают в куриных яйцах, и такие вакцины уже не проходят клинических испытаний. Как будут обстоять дела с производством в растениях рекомбинантных вакцин для массового применения, покажет время.

* * *

Подводя итог, можно сказать, что растения дали возможность получения жизненно важных белков методами биотехнологии. Человек научился брать от природы всё лучшее и избегать худшего. Как Уильям Шекспир в «Ромео и Джульетте» написал про растение:

В его цветах — целебный аромат,А в листьях и корнях — сильнейший яд.

Так и человечество научилось брать целебный аромат, но не смертельный яд у растений. У растений-биофабрик — большое будущее!

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ-6150.2014.4.

1. Прионы: исследования таинственных молекул продолжаются;
2. Fischer R., Schilberg S., Helliwig S., Twyman R.M., Drossard J. (2012). GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins. Biotechnol. Adv. 30, 434–439;
3. Martinez C.A., Guilietti A.M., Talou R. (2012). Research advances in plant-made flavivirus antigens. Biotechnol. Adv. 30, 1493–505;
4. Молекулярное клонирование, или как засунуть в клетку чужеродный генетический материал;
5. А не замахнуться ли нам на… изменение генома?;
6. Двухцепочечная РНК защищает трансгенные растения только от нежелательных насекомых;
7. Sourrouille C., Marshall B., Lienard D., Faye L. (2009). From Neanderthal to nanobiotech: from plant potions to pharming with plant factories. Methods Mol. Biol. 483, 1–23;
8. Rybiski E.P. (2008). Plant-produced vaccines: promise and reality. Drug Discov. Today. 14, 16–24;
9. Yusibov V., Rabindran S. (2008). Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Rev. Vaccines. 7, 1173–1183;
10. Трансгенные растения — спасители планеты или бомбы замедленного действия?;
11. Лекарству от голода — средство от засухи;
12. Готовим ГМ-рис вместе;
13. Mason H.S., Lam D.M., Arntzen C.J. (1992). Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 11745–11749;
14. Paul M., Ma J.K-C. (2011). Plant-made pharmaceuticals: Leading products and production platforms. Biotechnol. Appl. Biochem. 58, 58–67;
15. Thuenemann E.C., Lenzi P., Love A.J., Taliansky M., Becares M., Zuniga S. et al. (2013). The use of transient expression systems for the rapid production of viruslike particles in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5564–5573;
16. Love A., Chapman S., Matic S., Noris E., Lomonosoff G., Taliansky M. (2012). In planta production of a candidate vaccine against bovine papillomavirus type 1. Planta. 236, 1305–1313;
17. Pérez Filgueira D.M., Zamorano P.I., Domínguez M.G., Taboga O., Del Médico Zajac M.P., Puntel M. et al. (2003). Bovine herpes virus gD protein produced in plants using a recombinant tobacco mosaic virus (TMV) vector possesses authentic antigenicity. Vaccine. 21, 4201–4209;
18. Wigdorovitz A., Pérez Filgueira D.M., Robertson N., Carrillo C., Sadir A.M., Morris T.J., Borca M.V. (1999). Protection of mice against challenge with foot and mouth disease virus (FMDV) by immunization with foliar extracts from plants infected with recombinant tobacco mosaic virus expressing the FMDV structural protein. Virology. 264, 85–91;
19. Равин Н.В., Котляров Р.Ю., Марданова Е.С., Куприянов В.В., Мигунов А.И., Степанова Л.А. и др. (2012). Продукция в растениях рекомбинантной противогриппозной вакцины на основе вирусоподобных HBc-частиц, несущих внеклеточный домен М2-белка. Биохимия. 77, 33–40;
20. Mardanova E.S., Kotlyarov R.Y., Kuprianov V.V., Stepanova L.A., Tsybalova L.M., Lomonosoff G., Ravin N.V. (2015). Rapid high-yield expression of a candidate influenza vaccine based on M2 protein linked to flagellin in plants using viral vectors. BMC Biotechnology. В печати;
21. McCormick A.A., Reddy S., Reinl S.J., Cameron T.I., Czerwinkski D.K., Vojdani F. et al. (2008). Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin’s lymphoma: safety and immunogenicity in a Phase I clinical study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 10131–10136;
22. D’Aoust M.A., Couture M.M., Charland N., Trépanier S., Landry N., Ors F., Vézina L.P. (2010). The production of hemagglutinin-based virus-like particles in plants: a rapid, efficient and safe response to pandemic influenza. Plant Biotechnol. J. 8, 607–619;
23. Sheldon E., Seiden D.J. (2014). Immunogenicity, safety and tolerability of a plant-derived seasonal virus-like-particle quadrivalent influenza vaccine in adults. ClinicalTrials.gov. (сервис Национальных институтов здоровья США)..

biomolecula.ru

трансгенные растения

ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ –ПРОДУЦЕНТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ЦЕННЫХ БЕЛКОВ

Рост народонаселения мира, а также сокращение площадей на которых возможно выращивание культурных растений заостряет проблему обеспечения людей пищей. Для повышения количества и качества пищи традиционных подходов сегодня недостаточно. Именно по этой причине производство пищевых продуктов стало самым важным направлением генной инженерии. Задачей этого направления является повышение на принципиально новой основе урожайности сельскохозяйственных растений и, прежде всего, злаковых культур как источника хлеба. Пионером в создании ГМО являются США, где многие сорта сои, кукурузы, картофеля, томатов, сахарной свеклы, пшеницы, являются трансгенными. Всего в мире, в настоящее время, под такими растениями занято 67.7 млн. га посевных площадей и из них 63% приходится на США. В России на поля не выведен ни 1 сорт ГМ растений.

Использование растений для медицинских целей.

Для медицинских целей растения используются человечеством уже многие тысячи лет. Однако только на рубеже 21 века с помощью методов генетической инженерии стало возможным создавать новые типы растений, в тканях которых могут синтезироваться и накапливаться белки из различных гетерологичных систем (вирусов, бактерий, животных и человека). В биотехнологии развитых стран наблюдается тенденция привлечения растительных систем экспрессии для производства различных биофармацевтических веществ в трансгенных растениях. Привлекательность растений в качестве систем экспрессии для накопления рекомбинатных фармацевтически ценных белков обеспечивается многими обстоятельствами. В растительных тканях нет риска загрязнения рекомбинантного белка патогенами животного происхождения – вирусами и прионами. Растительные клетки обеспечивают правильную посттрансляционную модификацию рекомбинантного белка, характерную для эукариотических клеток, а также его сборку и фолдинг. Экспрессированные в растительных клетках рекомбинантные белки могут быть направлены в различные компартменты растительной клетки (вакуоли или люмены эндоплазматического ретикулюма), а также в апопласт и различные органы растения (семена, клубни, плоды и т.д.). Благодаря этому рекомбинантные белки в растительных тканях могут быть длительное время (месяцы и годы) сохранены без каких-либо изменений и снижения биологической активности.

Поиск различных систем для экспрессии чужеродных генов связан с развитием трёх основных подходов.

Первым из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном которых перенесены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных белков. Получение таких растений было основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные целевые гены. В качестве целевых можно было использовать и гены гетерологичных белков медицинского назначения. Использование только агробактериального переноса в значительной степени сужало круг растений-реципиентов и ограничивало его до двудольных. Поэтому были разработаны методы прямой доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции, электропорация и биобаллистика . Биобалллистика - суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), напыляется ДНК вектор, содержащий необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносятся на пластиковую пулю и помещаются внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10-15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0.1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. В этом случае для переноса использовалась очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструкции с целевыми генами.

При переносе в геном растения чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются и передаются потомкам в последующих поколениях согласно законам Менделя . Расщепление 3:1.Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них необходимо отметить низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях табака составило 0,02 % от суммарного белка. Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродного гена, когда её уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов. Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме растительной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляющих его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз. Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Интеграция чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена и с рядом проблем биобезопасности использования генетически модифицированных организмов. При получении трансгенных растений в сельскохозяйственных масштабах существует опасность утечки трансгена в окружающую среду в результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Для повышения уровня биобезопасности рядом исследователей было предложено использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения .

Другой проблемой, возникающей при интеграции гетерологичных генов в ядерный геном растений, является вероятность "замолкания" трансгенов в последующих поколениях (сайленсинг). Вероятность сайленсинга резко возрастает при встраивании множества копий чужеродного гена на геном растения). Поэтому при создании трансгенных растений-биопродуцентов рекомбинантных белков среди трансформантов отбирают растения, содержащие только одну встройку чужеродного гена.

В связи с вышеперечисленными проблемами, возникающими при интеграции трансгенов в ядерный геном, весьма привлекательным представляется способ переноса экзогенной ДНК в геном хлоропластов. В одной растительной клетке в среднем содержится от 5 до 10 тыс. копий хлоропластной ДНК, за счёт чего уровень экспрессии чужеродных белков достигает значений, сравнимых с уровнем экспрессии в E. coli (до 40 % от суммарного белка клетки). Однако встречаются только единичные работы по получению растений с генетически модифицированными хлоропластами. Это связано с чрезвычайной сложностью методов их трансформации и последующего отбора.

Третий путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки растений и колонизировать растительные ткани .На этой основе возникает реальная возможность модификации вирусного генома и адаптации его не только в качестве вектора для доставки в растения соответствующих генетических конструкций, но и в качестве матриц для экспрессии генов, кодирующих синтез белко,. Для заражения растительных тканей используются рекомбинантные РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего генома транскрипт чужеродного гена. Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений.

В настоящее время широко используются два вида вирусов для продукции чужеродных белков в растениях: вирус табачной мозаики (ВТМ) и вирус мозаики коровьего гороха (ВМКГ). Вектор на основе РНК ВТМ использовался для получения ингибитора репликации ВИЧ α-трихосантина в Nicotiana benthamiana. При интеграции генов в геном вирусов в зараженных вирусами растениях обеспечивается их временная (транзиентная) экспрессия. Накопление соответствующих белковых продуктов будет определяться периодом вегетации зараженного растения-хозяина. С другой стороны, пре-имуществом вирусного пути накопления белков в растениях является короткий период размножения вирусных частиц, простота инфицирования растений, а также широкий диапазон различных видов растений, которые могли бы быть использованы для этих целей.

Растения-продуценты антител

Цель иммунизации организма вакцинами - индуцировать продукцию антител на патогенный агент. Альтернативой такому подходу является метод пассивной иммунизации, основанный на введении готовых иммуноглобу-линов. Были получены трансгенные растения-продуценты различных типов антител к эпитопам ряда патогенных агентов. Анализируя уровень экспрессии перенесённых генов в геноме растений-биопродуцентов антител, можно отметить, что уровень продуктивности иммуноглобулина к поверхностному антигену Staphylococcus mutants в растениях табака оказался наиболее высоким и составил 500 мкг/г сырого веса .Такие антитела, выделенные из трансгенных растений табака, предупреждали развитие кариеса у пациентов при непосредственном нанесении их на зубную эмаль и не уступали по своим свойствам аналогичным антителам, получаемым из гибридомы мышей.

Иммуноглобулины к раковому эмбриональному антигену были получены в трансгенных растениях риса и пшеницы . Такие антитела используются в иммунотерапии онкологических заболеваний.

Растения-продуценты субъединичных вакцин

Трансгенные растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов человека и животных получили название "съедобных вакцин". Механизм иммунизации такими вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. Следует отметить, что мукозная вакцинация стимулирует как иммунный ответ слизистых оболочек - первого защитного барьера на пути патогенных агентов, так и общий иммунный ответ организма.

Основные преимущества "съедобных вакцин" - экономичность, безопасность и доступность для широкой иммунопрофилактики населения.

Растения-продуценты фармацевтических белков

За последние несколько лет в ведущих биотехнологических центрах мира созданы трансгенные растения-продуценты широкого спектра гормонов, цитокинов, факторов роста и ферментов, имеющих потенциальное применение в фармакологии .Все они не уступали по биологической активности аналогам, получаемым из других систем экспрессии.

По закону, принятому Всемирной организацией здравоохранения, любые предлагаемые источники лекарственных препаратов, в частности трансгенные растения, должны быть зарегистрированы и пройти серию клинических испытаний. Первые клинические испытания трансгенных растений риса, синтезирующих активный человеческий a-1-антитрипсин для терапии фиброзного кистоза, были начаты в 1998 г.

Производство рекомбинантных белков для медицинских целей с использованием традиционных систем требует значительных финансовых затрат. Так, например, недостаток лизосомального фермента гликоцеребрози-дазы в организме вызывает синдром Гоше. Единственным видом терапии этого заболевания является внутревенное введение гликоцереброзидазы. Долгое время этот белок получали из плаценты человека, на поддержание жизни одного пациента в течение года требовалось 160000$. Переключение продукции гликоцереброзидазы на культуру клеток млекопитающих снизило стоимость этого препарата, однако не вытеснило его из группы "самых дорогих лекарств в мире". Было показано, что трансгенные растения способны синтезировать биологически активную гликоцереброзидазу человека. В дальнейшем были получены высокопродуктивные трансгенные растения табака, в которых содержание гликоцереброзидазы человека варьировало от 1 до 10 % TSP. Ожидается, что получение рекомбинантной гликоцереброзидазы из таких растений позволит значительно снизить её стоимость.

В заключение хотелось бы отметить, что несмотря на значительные достижения в области продукции рекомбинантных белков медицинского назначения в растениях, это направление находится лишь на начальном этапе своего развития. Учёные-биотехнологи уверены, что в будущем рекомбинантные препараты, получаемые из генетически модифицированных растений, заменят дорогостоящие бактериальные и животные аналоги на фармацевтическом рынке. "Съедобные вакцины" позволят значительно усовершенствовать программы всеобщей иммунизации, особенно для населения развивающихся стран.

studfiles.net

Съедобные вакцины - Трансгенные растения

Трансгенные растения - инновационные продуценты белков

Смертность от инфекционных болезней составляет около 25%  в мире, 45%  - в слаборазвитых странах и 63% среди детей во всем мире (Arntzen et al., 2005). ВОЗ и различные другие организации указывают на потребность в инновационных технологиях получения вакцин против инфекционных болезней, что позволило бы увеличить глобальную иммунизированность населения и понизить стоимость вакцин. Огромное значение придается безыгольной доставке вакцин и их термостабильности, как ключевым элементам в достижении этой цели

Убитые или аттенуированные патогенны были основой всех вакцин до 1980-х. Технологии клеточных культур млекопитающих были главной инновацией последней половины 20-го века; стало возможным больше производить единообразных вакцин с повышенной иммуногенностью. Во всем мире это служит основой современного производства вакцинных препаратов.

Однако в последнее десятилетие все большую заинтересованность вызывает растительная биотехнология, как многообещающая инновационная стратегия, совмещающая достижения медицинской науки с белковым биопроизводством.

В настоящее время уже известно, что животных и человека необязательно вакцинировать классическим образом - с помощью микроорганизмов (живых или убитых), можно делать это используя лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма. Для вирусов такими компонентами, как правило, являются протективные антигенные белки, в основном некоторые белки его оболочки. Новейший подход к созданию вакцин состоит в получении трансгенных растений, продуцирующих эти белки. Такие растения могут использоваться в качестве съедобных вакцин, стимулирующих мукозальный иммунитет кишечника. При поедании сырых тканей растения, стенки растительных клеток обеспечивают эффективную защиту целевого белка (антигена) микроорганизма, находящегося в них, от условий  среды ротовой полости и желудка. Поэтому антиген эффективно достигает кишечника, где индуцирует иммунный ответ слизистых оболочек; затем к ответу подключается и весь системный иммунитет. Важной особенностью съедобных вакцин является их потенциальная дешевизна, биологическая безопасность (отсутствие в растениях вирусных патогенов человека и животных), простота хранения и применения. Более того, в будущем можно будет создать растения, продуцирующие одновременно несколько протективных антигенов различных патогенов. Это будут мультивалентные съедобные вакцины (Giddings et al., 2000; Lal et al., 2007).

Использование живых организмов в качестве "фабрик" для производства чужеродного белка, подразумевает введение в генетический аппарат этого организма фрагмента ДНК (гена и его регуляторных последовательностей), кодирующего этот чужеродный белок. Такие организмы назвают трансгенными, т.е. организмами с перенесенными (превнесёнными из вне) генами. На этом сайте мы рассмотрим конкретно только один из методов трансформации растений, поскольку до недавнего времени он был самым распространенным. Многие двудольные растения были трансформированы именно с его использованием - это метод агробактериальной трансформации.

Перенос генов из бактерий рода Agrobacterium в растения

Наиболее известным подходом для переноса целевых генов в ядерный геном растения является использование агробактерий (почвенных бактерий). Возможность использования растений в качестве продуцентов чужеродных белков основана на природной способности грамотрицательных почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes переносить определенный фрагмент своей природной Ti-плазмиды (от англ. tumor inducing – опухоль индуцирующая), называемый Т-областью или Т-ДНК, в геном растительной клетки. Именно эта часть плазмиды агробактерий была использована в дальнейшем для переноса генно-инженерных конструкций, включающих различные гены, в том числе, кодирующие белки медицинского назначения.

Еще в 1907 г. Э. Смит и К. Таунсенд обнаружили, что Agrobacterium tumefaciens (Рис. 1) является патогеном для двудольных растений, но только в 1974 г. удалось установить, что собственно опухолеродным агентом у этой бактерии является мегаплазмида Ti, размер которой обычно составляет 200-250 т.п.н.

Рис. 1. Агробактерии (Agrobacterium tumefaciens) на поверхности растительной клетки (рисунок с сайта www.genomenewsnetwork.org)

Рис.  2. Обобщенная схема плазмиды Ti октопинового типа. TL, TR - левая и правая Т-ДНК; LB , RB - последовательности левой и правой границ Т-ДНК

В 1977 г. Мэри-Дэл Чилтон с соавторами обнаружила, что плазмида Ti (Рис.  2) содержит особый район, который назвали Т-ДНК (от англ. transferred DNA – переносимая ДНК), размер которого в разных плазмидах варьирует от 10 до 30 т.п.н. За счет активности примерно 35 генов вирулентности vir, расположенных на Ti-плазмиде, Т-ДНК способна передаваться в растительную клетку с последующей встройкой в хромосомы ядра (Nester et al., 1977) В составе плазмиды Т-ДНК с обеих сторон ограничена специфическими последовательностями, состоящими из несовершенных прямых повторов длиной 25 п.н., называемыми правой и левой границами (right и left borders, RB и LB). После попадания в растение Т-ДНК способна произвольно встраиваться в хромосомы ядра и модифицировать биосинтез растительной клетки. Природный процесс переноса Т-ДНК в растение приводит к заболеванию, называемому корончатым галлом – опухоли в районе соединения стебля и корня (Рис. 3).

Рис. 3. Корончатый галл на стебле розы (рисунок с сайта www.genomenewsnetwork.org)

Рис. 4. Основные этапы агробактериальной трансформации:  I— активация хеморецептора VirA продуктами гидролиза клеточной стенки растения; II— фосфорилирование VirG; III— внесение однонитевого разрыва в районе RB, репликация с вытеснением Т-цепи; IV— связывание с Т-цепью белков VirE2 и VirD2 и транспорт к поре; V— прохождение Т-цепи в комплексе с белками в растительную клетку; VI — интеграция Т-цепи в хромосому растения. (Рисунок взят из статьи (Лутова, 2000))

Проникновение Т-ДНК в ядро растительной клетки опосредовано полипептидами virD2 и virE2. Эти же белки обеспечивают стабильную встройку перенесённой ДНК в геном растения (Дрейпер и др., 1991). Сайты инсерции Т-ДНК в хромосому растительной клетки случайны, хотя ряд авторов отмечают преимущественное внедрение Т-ДНК в транскрипционно активные области генома (Barakat et al., 2000; Brunaud et al., 2002).

Экспериментально установлено, что последовательность ДНК,  заключенная  между  RB и LB, никак не влияет на эффективность переноса Т-ДНК из агробактерии в клетку растения. Это позволило предположить, что Т-ДНК можно использовать для переноса чужеродных генов из A. tumefaciens в геном растительных клеток. Поэтому способность Т-ДНК встраиваться в растительные хромосомы используется в настоящее время при создании векторов трансформации растений. В геном клетки растения можно перенести любую чужеродную ДНК. Она должна быть фланкирована концевыми последовательностями Т-ДНК и стабильно поддерживаться в штамме агробактерии, несущем полный набор vir-генов.

Однако существуют технические сложности при введении генов в Т-ДНК обычных природных Ti-плазмид. Нативные агробактериальные плазмиды имеют очень большой размер, а районы Т-ДНК обычно не содержат уникальных участков гидролиза рестриктазами. Поэтому были разработаны разные стратегии введения чужеродных генов в состав Т-ДНК. В настоящее время для стабильной ядерной трансформации двудольных растений используется так называемая бинарная векторная система на основе A. tumefaciens.

Основные генно-инженерные манипуляции in vitro обычно проводятся в клетках стандартного и безопасного лабораторного штамма бактерии Е. coli.К12. Эта бактерия служит "хозяйкой" для многих плазмид (внехромосомных ДНК), с которыми проводятся генно-инженерные манипуляции. Бинарный вектор представляет собой относительно небольшую плазмиду, способную реплицироваться и в клетках Е. coli и в A. tumefaciens. Обязательными элементами бинарного вектора являются последовательности RB и LB, ограничивающие район Т-ДНК, содержащий ген селективного маркера (антибиотика), экспрессируемый в растениях, промоторы и сигналы полиаденилирования мРНК, между которыми по уникальным участкам гидролиза рестриктазами встраивают целевую кодирующую последовательность. Бинарный вектор, который исследователи часто используют в работе, представлен на Рис. 5.

Рис. 5. Структура бинарного вектора агробактериальной трансформации растений pBINplus/ARS. RB, LB — концевые повторы Т-ДНК плазмиды Ti; oriV, trfA (relaxosome protein RP)—генетические элементы плазмиды с широким кругом хозяев, обеспечивающие ее репликацию; nptIII — ген устойчивости к канамицину (белок аминогликозид 3' фосфотрансфераза), функционирующий в бактериях; Pubi3-UQ-nptII-Tubi— гибридный ген ubiquitin-NPTII, экспрессирующийся в растениях и обеспечивающий устойчивость к канамицину; Promotor P1 (ubi), T ubi— промотор и терминатор гена ubi, кодирующего убиквитин

old.nsuem.ru

Области применения генной инженерии растений

Иногда такими продуцентами важных лекарственных веществ являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующие растения превращают их в новые продуценты важных биологически активных веществ.

Многие растения содержат предшественников биосинтеза ценных биологических соединений, однако они не имеют ферментов для их превращений в эти соединения. Часто для метаболической инженерии достаточно переноса в клетку только одного гена. Примером такого типа метаболической инженерии является получение новых растений-продуцентов резвератрола, ценного лекарственного препарата широкого спектра действия, замедляющего старение. Резвератрол был обнаружен в винограде, где фермент стилбенсинтаза катализирует реакцию синтеза резвератрола из трех молекул малонил-СоА и одной молекулы 4-кумарил-СоА (рис. 2.15). Переносом гена стилбенсинтазы были получены другие растения, синтезирующие резвератрол.

Этот фермент участвует в конденсации двух молекул геранил-геранил дифосфата. Ген фитоен-синтетазы из нарцисса был введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса. Таким образом, получен «золотой рис», который может помочь 2 млрд чел., страдающих от дефицита витамина А, для них рис - основная пища. Получены трансгенные растения рапса, экспрессирующие ген фитоен-синтетазы, в семенах которых значительно повысилось содержание каротиноидов. Показана экспрессия этого же фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина.

Недавно получены трансгенные растения земляники с повышенным синтезом L-аскорбиновой кислоты. Эти растения отличались суперэкспрессией гена НАДФ-зависимой Д-галактуронат-редуктазы (GalUR). Созданы растения сои с повышенным в пять раз содержанием витамина Е в семенах. Получены растения арабидопсиса с повышенным содержанием фолатов за счет экспрессии в них бактериального гена ГТФ-циклогидролазы-1 (EcGCH).

Уже существует салат с увеличенным содержанием железа, обогащенная лизином кукуруза. Ждет своего запуска в практику сорт сои с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот (омега-3, омега-6 НЖК и др.), которые не синтезируются в организме человека, а попадают по пищевым цепям в основном через морепродукты из водорослей. Гены, встраиваемые в геном соевых бобов, были выделены из клеток водорослей (разработчик -компания Monsanto).

Разработаны в лабораториях и другие разнообразные трансгенные формы растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами.

Самый первый коммерческий успех получили растения, устойчивые к гербицидам, поскольку позволили очень успешно бороться с сорняками. Самыми распространенными являются трансгенные растения, устойчивые к глифосату (Раундап) - самому популярному гербициду, разлагающемуся в почве на нетоксичные составляющие и потому безопасному для окружающей среды. Ген был выделен из глифосат-устойчивого штамма E. coli.

Выведение растений, устойчивых к вредителям и болезням, поможет резко сократить применение химических средств защиты растений и уменьшить стоимость культивирования. Одними из первых в широкую практику вошли инсектицидные хлопок и кукуруза - так называемые Bt-сорта, которые были получены введением в них гена дельта-эндотоксина из Bacillus. thuringiensis (Bt или Cry-белок).

Bt-белок высокотоксичен для насекомых, но безопасен для других видов животных и человека. Он является протоксином, который расщепляется в кишечнике личинок насекомых, образуя активированный токсин.

Активированный токсин, в свою очередь, специфично связывается с рецепторами в средней кишке насекомых, что приводит к лизису клеток кишечного эпителия. Данный энтомотоксин - смертельный яд для ряда насекомых (в том числе и колорадского жука), но в то же время вполне безопасен для человека и животных, поскольку в организме млекопитающих нет ферментов для его расщепления и усвоения. Взаимодействие Bt-токсина с рецепторами насекомых строго специфично. В природе найдено большое количество штаммов B. thuringiensis, чьи токсины действуют на строго определенные виды насекомых.

Ранее препараты бактерий B. thuringiensis, содержащие Bt-белок, с успехом применяли для борьбы с насекомыми-вредителями, хотя использование таких препаратов достаточно дорого и не всегда эффективно. Введение гена протоксина в растения привело к тому, что Bt-растения перестали поедаться насекомыми. Этим путем был получен трансгенный картофель, устойчивый к колорадскому жуку.

Устойчивость к вирусам может обладать исключительной важностью для повышения сельскохозяйственной продуктивности. В настоящее время в различных странах мира проводят полевые испытания устойчивых к вирусам сортов батата (вирус SPFMV, sweet potato feathery mottle virus), кукурузы (MSV, maize streak virus) и африканской маниоки (мозаичный вирус). Возможно, эти культуры будут коммерциализованы в течение ближайших 3-5 лет.

Из-за сложности генома пшеницы, работа над созданием сортов, устойчивых к вирусу желтой карликовости ячменя (barley yellow-dwarf virus), продвигается очень медленно и до сих пор находится на стадии лабораторных экспериментов. Разработан также устойчивый к нематодам (корневым червям) ГМ-картофель.

Генно-инженерная биотехнология растений для фармакологии делает свои первые успешные практические шаги.

Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для получения различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние 20 лет множество ценных белков эффективно экпрессировано в растениях. Это белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Следует отметить перспективность получения ГМ-растений, синтезирующих новые формы антимикробных пептидов.

Растительные системы имеют все перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе. Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями, уже производятся западными компаниями или будут выпущены на рынок в ближайшие годы. Например, авидин, трипсин ив -глюкуронидаза, выделяемые из трансгенной кукурузы, производятся фирмой Sigma-Aldrich (США). В скором времени должны быть подготовлены к промышленному производству коллаген, липаза, лактоферрин, лизоцим, синтезируемые трансгенными растениями.

Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях. Выявленно, что при экспрессии различных антигенов в растениях сохраняется их структурная идентичность и иммуногенность. Антигены, синтезируемые растениями, вызывали иммунный ответ при введении, например, HBs-антиген, синтезируемый растениями картофеля, вызывал у мышей более сильный иммунный ответ, чем дрожжевой. В настоящее время более пятидесяти различных антигенов были экспрессированы в ГМ-растениях, для некоторых из них показана иммуногенность при оральном введении.

Интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу. В случае успеха исчезнет потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима при создании вакцин для парентерального введения. Антигены, экспрессируемые в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к клеткам слизистой оболочки кишечника, ответственным за мукозную систему иммунитета.

Таким образом, непрерывно разрабатываются все новые виды пищевых и технических растений с измененными свойствами - с улучшенным составом жиров, повышенным содержанием белков и витаминов, сладкие без сахара и накапливающие меньше вредных для здоровья нитратов, с повышенными декоративными свойствами. Опытные испытания проходят сотни пород деревьев, у которых часть ненужного человеку лигнина заменена полезной целлюлозой. При этом растут ГМ-деревья вдвое быстрее обычных. Трансгенные растения вырабатывают вакцины и лекарства, очищают почву от химического и радиоактивного загрязнения, синтезируют биодеградируемые полимеры для производства упаковки и белок паутины, из которого можно делать колготки и бронежилеты повышенной прочности.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

medbe.ru

Смотрите также

• 
  Вакцина против папилломы шейки матки
• 
  Вакцина от лихорадки wasteland 2
• 
  Открытие вакцины против полиомиелита принадлежит
• 
  Какую вакцину делают под лопатку
• 
  Wasteland 2 вакцина от лихорадки
• 
  Вакцина красного цвета rd 67
• 
  Где найти вакцину в амнезии
• 
  Вакцина кпк в украине 2017
• 
  Вакцина протейная из антигена сухая
• 
  Вакцина желтой лихорадки живая сухая
• 
  Привитые любовь страх и вакцины