Забыли пароль?
Регистрация

О компании
Доставка
Каталог товаров
Контакты

Задать вопрос
Как сделать заказ
Рекомендации
Партнёрам

Получить консультацию

штамм "бг" вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц. Вакцина ибб бг для птиц

Штамм "бг" вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц

ИББ птиц (болезнь Гамборо) - высококонтагиозная болезнь, характеризуется поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей. В основном ИББ поражает В-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. Важным средством борьбы против ИББ, причиняющим экономический ущерб за счет гибели 20 - 70% птиц при остром ее течении, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц, является своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. ИББ протекает остро с характерной клиникой заболевания и субклинически. Широкое распространение имеет субклиническая форма. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднения при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза и требует наличия специфических высокоактивных стандартных антигенов и сывороток. Штаммы вируса ИББ, предназначенные для производства антигена и иммунной сыворотки, должны быть свободными от контаминации и обладать высокой биологической и антигенной активностью. Технология производства антигена при ИББ предусматривает инактивацию вируса, поэтому штаммы должны быть чувствительными к воздействию инактивирующих препаратов и контролироваться на полноту инактивации. Существующие диагностикумы готовят на СПФ-цыплятах, СПФ-эмбрионах и в культуре клеток. В зарубежной практике известен ряд штаммов вируса ИББ, используемых для изготовления антигенов и сывороток к данной инфекции - штамм "SR-1" [4], штамм "1/PY". Указанные штаммы культивируются на СПФ-цыплятах (свободных от патогенных факторов) или в культуре клеток различного происхождения [1]. Однако размножение вируса в культуре клеток вызывает снижение его антигенной активности. Полученные образцы антигена и сыворотки с использованием штаммов обладают низкой активностью и не поддаются стандартизации. Кроме того, вышеуказанные штаммы непригодны для использования в качестве вакцинных. Известно использование высокоактивных вирулентных штаммов вируса ИББ птиц для приготовления диагностикумов. Известен штамм "cheville", используемый для производства антигенов и сывороток для лабораторной диагностики ИББ птиц [1]. Однако указанный штамм непригоден для изготовления вакцин. Известен также штамм "27/94" вируса ИББ птиц для получения диагностикумов. Штамм культивируется и титруется на коммерческих цыплятах 35 - 40-дневного возраста и куриных эмбрионах. Штамм вызывает характерную клиническую и патологоанатомическую картину заболевания через 48 - 72 ч c титром вируса 105,5 - 106,0 ЭИД50/мл, и активность сыворотки крови достигает в реакции нейтрализации 1:1024 и в реакции диффузионной преципитации 1:64. Вирус свободен от контаминации, специфичен и активен [1]. Недостатком данного штамма является его вирулентность, что всегда создает проблемы при соблюдении ветеринарно-санитарной безопасности. Вакцинные штаммы непригодны в большинстве случае для изготовления диагностикумов по причине их низкой антигенной активности. Известен штамм "52/70" вируса ИББ птиц [2]. Указанный штамм является вирулентным и пригоден для изготовления только инактивированной вакцины. Известен вакцинный штамм "КБК" вируса ИББ птиц, репродуцируемый в перевиваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГМ-70 и предназначенный для изготовления вакцин [2]. Недостатками данного штамма являются его культивирование в перевиваемой культуре ткани, что всегда является потенциальной опасностью для работающего персонала ввиду онкогенности используемых клеток, а также его низкая антигенная активность. Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "ВНИВИП" вируса ИББ птиц, предназначенный для изготовления вакцины. Указанный штамм представляет собой авирулентный генетически однородный вирусный материал, легкокультивируемый в культуре клеток куриных фибробластов и биологической активностью вируса 105,5 - 106,0 ТЦД50/мл [3]. Недостаток данного штамма состоит в том, что он обладает низкой антигенной активностью. Проблема создания эффективных средств вакцинопрофилактики ИББ в России встала очень остро с появлением целого ряда очагов заболевания в период с 1991 по 1995 гг. Применение отечественных и импортных биопрепаратов в очагах инфекции не обеспечило ожидаемого эффекта. Это объясняется тем, что их применению не предшествовало изучение антигенных свойств циркулирующих изолятов вируса, не определялись специфические антитела у птицы до и после вакцинации, а также уровень пассивного материнского иммунитета у цыплят. Известна вакцина против ИББ птиц на основе штамма "52/70" [2]. Недостаток этой вакцины состоит в том, что штамм "52/70" является вирулентным, поэтому он пригоден для изготовления только инактивированной вакцины. Известна также вакцина против ИББ птиц на основе штамма "КБК", адаптированного к перевиваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГМ-70 [2]. Недостатки данной вакцины состоят в том, что для репродукции вируса используют перевиваемую линию клеток серо-зеленой мартышки, которая еще недостаточно изучена в отношении онкогенного воздействия на занятый в производстве препарата персонал, а также не изучены последствия влияния на человеческий организм мяса птицы, иммунизированной данной вакциной. Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИББ птиц, включающая авирулентный генетически однородный вирусный материал из штамма "ВНИВИП" и стабилизатор, взятые в равном соотношении. Указанный штамм репродуцируется в культуре клеток куриных фибробластов с биологической активностью 105,5 - 106,0 ТЦД50/мл. В качестве стабилизатора используют обезжиренное молоко. Для профилактики ИББ птицу иммунизируют до 60-дневного возраста путем подачи вакцины с водой в дозе 103,0 - 104,0 ТЦД50/мл [3]. Недостаток данной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью. В задачу создания настоящих изобретений входило получение штамма вируса ИББ птиц, обладающих высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодного для производства как диагностикумов, так и живой и инактивированной вакцины, а также разработка на его основе живой и инактивированной вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью. Технический результат от использования предлагаемых изобретений заключается в повышении специфической антигенной и иммуногенной активности и безвредности средств специфической профилактики и диагностики. Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для использования в другом изобретении. Указанный технический результат достигнут созданием аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц. Штамм "БГ" является новым, ранее не известным. Исходный вирус для получения штамма "БГ" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров птицефабрики "Уральская" Оренбургской области в 1993 году. Производственный штамм "БГ" получен путем многократных последовательных пассажей на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур. Штамм "БГ" депонирован в Государственной коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 21.06.96 г. под регистрационным номером "БГ" 102 ДЕП. По сравнению с прототипом штамм "БГ" является безвредным и обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления живой (табл. A, 6, 7, 8, 9,), инактивированной (табл. 5) вакцины и диагностических препаратов (табл. 1, 2, 3, 4). Штамм "БГ" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические свойства. Штамм "БГ" вируса ИББ птиц относится к семейству Birnaviridae, роду Avibirnavirus, серотипу I, обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона экосаэдрическая, размер вириона - 58 - 60 нм. Капсид - Т13, оболочка отсутствует. Антигенные свойства. По своим антигенным свойствам штамм "БГ" относится к сероварианту 1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемаглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА - 1: 400-1: 10000 и более, при гипериммунизации - в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА > 1: 10000. При определении антигенного соответствия вакцинного штамма "БГ" с полевыми изолятами вируса ИББ было проведено сравнение вариабельной области VP237 полевых изолятов, выделенных в 1993 - 1996 гг. на территории РФ и странах СНГ и 7 образцов коммерческих живых вакцин. Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Tag-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный этитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятор вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигено отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5 - 8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "БГ". Биотехнологические характеристики. Штамм "БГ" проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, а также высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993 - 1996 гг. Штамм "БГ" предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живой и инактивированной вакцины и диагностических биопрепаратов. Штамм "БГ" репродуцируется в 10-суточных СПФ куриных эмбрионов при 37,7oC и влажности 55 - 64%. В течение 72 - 96 ч инкубирования вирус накапливается до 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл. Штамм "БГ" является стабильным и безвредным. Хемо- и генотоксономическая характеристика. Штамм "БГ" является РНК-содержащим вирусом с мол. мас. 2,16

106 Д. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирус имеет белковую оболочку, содержащую 5 видов белков (VP1 - VP5). Липиды отсутствуют. Белковая оболочка обнаруживает следующие ферменты: VP1 - РНК-зависимая РНК-полимераза; VP2 и VP3 - структурные белки; VP4 - протеаза; VP5 - не идентифицирован. Штамм "БГ" проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в VP2. Аминокислотные изменения в VP2 определяют антигенную вариабельность. Сегмент A нуклеиновой кислоты содержит 2 частично перекрывающие открытые рамки для считывания малого VP5 и большого полипротеинового предшественника белков VP2 и VP3. Сегмент B кодирует VP1. Физические свойства. Масса вириона - 55

106Д. Коэффициент седиментации - 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33 - 1,34 г/мл в градиенте CsCl. Устойчивость к внешним факторам. Штамм "БГ" устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, y-облучению и высыханию. Дополнительные признаки и свойства. Иммуногенная активность - 100%. Реактогенность отсутствует. Патогенность отсутствует. Вирулентность отсутствует. Онкогенность отсутствует. Контагиозность отсутствует. Стабильность аттенуации отмечена при проведении 5 пассажей на чувствительных цыплятах. По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентноспособности "новизна" и изобретательский уровень". Указанный технический результат достигнут также созданием вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупность признаков: 1) вакцина против ИББ птиц; 2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл, в концентрации 85 - 95 мас.%; 3) стабилизатор - 5 - 15 мас.%. В качестве стабилизатора можно использовать отдельно или в комбинации обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др. Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1) вакцина против ИББ птиц; 2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2, в концентрации 85 - 95 мас.%; 3) стабилизатор - 5 - 15 мас.%. По сравнению с прототипом существенным отличительным признаком изобретения является использование в качестве вируссодержащего материала аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10 - суточных СПФ-эмбрионах кур и титром биологической активности 5,25 - 65,0 lg ЭИД50/0,2 мл. По сравнению с прототипом вирусвакцина на основе аттенуированного штамма "БГ" обладает более высокой иммуногенной активностью, является безвредной и способна преодолеть материнские антитела против ИББ. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемой вакцине, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения. Пример 1. Приготовление диагностического антигена. СПФ-цыплятам 14-21-дневного возраста инокулируют штамм "БГ" (интроакулярно, интраназально или орально). Через 72 цыплят убивают, берут бурсы, замораживают. Затем бурсы мелко размельчают, растирают со стерильным стеклянным песком, смешивают с фосфатным буфером 1:1, дважды промораживают, центрифугируют 1 мин при 3000 об/мин, супернатант сливают, инактивируют и используют для работы. Результаты исследований по определению активности антигена ИББ в РДП представлены в табл. 1. Пример 2. Приготовление диагностической сыворотки. СПФ-цыплятам 14 - 21-дневного возраста инокулируют орально живую вакцину из штамма "БГ" вируса ИББ. Через 14 дней вводят внутримышечно инактивированный антиген, в качестве адъюванта используя масло, а через две недели цыплят обескровливают и получают генериммунную активную сыворотку и определяют ее активность в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в табл. 2. Пример 3. приготовление диагностической сыворотки. СПФ-цыплятам 14 - 21-дневного возраста вводят орально живую вакцину из штамма "БГ" вируса ИББ. Через 14 дней внутримышечно вводят инактивированный антиген, используя в качестве адъюванта гидрат окиси алюминия. Через 2 недели цыплят обескровливают, получают сыворотку и определяют ее активность в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в табл. 3. Пример 4. Приготовление диагностической сыворотки. СПФ-цыплятам 14 - 21-дневного возраста вводят орально живую вакцину из штамма "БГ" вируса ИББ. Через 14 дней инокулируют внутримышечно инактивированный антиген, в качестве адъюванта масло, через 10 дней инактивированный антиген вводят повторно и через 7 дней цыплят обескровливают, получают сыворотку и определяют ее активность. К исследованной сыворотке добавляют стабилизирующие добавки и ее подвергают лиофилизации. Лиофилизированную сыворотку используют для наборов ИФА и РДП. Результаты исследования полученной сыворотки представлены в табл. 4. Пример 5. Приготовление и испытание инактивированной вакцины. Инактивированную вакцину против ИББ птиц готовят из штамма "БГ" вируса, выращенного в развивающихся СПФ-эмбрионах кур. Вирус инактивируют азиридином, сорбируют на гидроокись алюминия с добавлением сапонина. Результаты исследований по определению иммуногенной активности инактивированной вакцины из штамма "БГ" представлены в табл. 5. Пример 6. Приготовление аттенуированной вакцины. На первом этапе готовят матровый материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц. Полученную вируссодержащую жидкость используют для массового зарaжения 10-суточныx СПФ-эмбрионов кур. Вирусный материал в количестве 0,2 мл инокулируют на хориоаллантоисные оболочки (ХАО) и инкубируют при 37,7oC 48 - 120 ч. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при -40oC, и полученное сырье используют для приготовления вакцины. Вируссодержащий материал размораживают измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют при 4oC в течение 45 мин, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер pH 7,5 и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Вируссодержащую надосадочную жидкость осторожно сливают в стерильных условиях, а затем добавляют стабилизатор, в качестве которого можно использовать (отдельно или в комбинации) обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др., расфасовывают во флаконы, промораживают при -60-(-80oC) и подвергают лиофилизации. Лиофилизованный материал закупоривают под вакуумом и подвергают исследованию на иммуногенность (на 14-дневных СПФ-цыплятах) и на безвредность (на 30-дневных СПФ-цыплятах). Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу розово-коричневого цвета в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде. При растворении в воде до исходного объема она превращается в стойкую однородную суспензию розово-коричневого цвета. Вакцину применяют в хозяйствах, где регистрируют клинические и патологоанатомические признаки проявления ИББ. Цыплят вакцинируют с 10 - 14-дневного возраста дважды с интервалом 10 - 14 дней в дозе 100 - 1000 ЭИД50/мл методом выпаивания. Иммунитет у птиц наступает через 14 - 21-й день после второй прививки и сохраняется в течение всего восприимчивого к ИББ периода. Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав в мас.% (см. табл. A). Полученная вакцина при титровании на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур имеет титр 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл. Пример 7. Испытание сухой аттенуированной вакцины. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур c титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл - 85 Стабилизатор - 15 Определение иммуногенной активности вакцины проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-крaтные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 14 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 6. Данные табл. 6 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 100%-ную защиту цыплят, выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц. Пример 8. Испытание сухой аттенуированной вакцины. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл - 90 Стабилизатор - 10 Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 14 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 7. Данные табл. 7 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 100%-ную защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц. Пример 9. Испытание сухой аттенуированной вакцины. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: Вирусодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл - 95 Стабилизатор - 5 Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 1-кратные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизированной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 14 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 8. Данные табл. 8 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 100%-ную защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц. Пример 10. Сравнительная оценка вирусвакцин против ИББ птиц. В опытах были использованы вакцины из штамма "Тавиар" (Италия), из штамма "Д-78" (Голландия), из штамма "Гумбораль СТ" (Франция), из штамма "ВНИВИП" (Россия) и из штамма "БГ" (Россия). Изучение эффективности указанных вакцин проводили на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста. Всем цыплятам инокулировали орально по одной дозе одной из указанных выше вакцин. Оценку эффективности вакцин проводили по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом 52/70 ИББ всех групп цыплят через 14 суток после их вакцинации. Результаты исследований приведены в табл. 9. Данные табл. 9 свидетельствуют о том, что при контрольном заражении вакцинированных цыплят вирулентным штаммом 52/70 ИББ в дозе 104 ТЦД50/мл 100% защиту обеспечивает только вакцина, приготовленная из штамма "БГ". Пример 11. Испытание сухой аттенуированной вакцины. В лабораторных экспериментах и в условиях птицехозяйств Российской Федерации проведена сравнительная оценка иммуногенности различных отечественных и импортных живых вакцин против ИББ и показано, что вирусвакцина сухая против ИББ из штамма "БГ" является более надежным и эффективным биопрепаратом по сравнению с импортными вакцинами. Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемых изобретений следующей совокупности условий: - штамм "БГ" вируса ИББ птиц и вакцина против ИББ птиц, воплощающие предлагаемые изобретения, предназначены для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной медицине и биотехнологии; - для предлагаемых изобретений в том виде, как они охарактеризованы в независимых пунктах формулы изобретения, подтверждена возможность их осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов; - штамм "БГ" вируса ИББ птиц и вакцина на его основе, полученные в соответствии с предлагаемыми изобретениями, обладают высокой специфической, иммуногенной и антигенной активностью, безвредностью и ареактогенностью. Следовательно, предлагаемая группа изобретений соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Источники информации 1. Авторское свидетельство СССР N 1761802, C 12 N 7/00, 22.11.90. 2. Патент РФ N 2054038, C 12 N 7/08, 01.06.93. 3. Авторское свидетельство СССР N 1824443, C 12 N 7/00, 19.03.91. 4. Авторское свидетельство СССР N 1668392, A 61 K 7/00, 16.09.89 5. Патент Австралии N 565768, A 61 K 39/12, 24.09.87. 6. Патент Австралии N 574190, C 12 N 15/33, 07.01.91. 7. Патент Австралии N 374885, A 61 K 39/12, 26.06.85. 8. Патент Австралии N 3825289, A 61 K 39/12, 21.07.88. 9. Патент РСТ N 85/02545, A 61 K 39/12, 20.06.85. 10. Патент РСТ N 86/00529, A 61 K 39/12, 30.01.86. 11. Патент РСТ N 91/04749, A 61 K 39/00, 18.04.91. 12. Патент РСТ N 91/04750, A 61 K 39/42, 18.04.91. 13. Патент РСТ N 91/16925, C 12 N 15/00, 14.11.91 14. Патент РСТ N 94/06475, A 61 K 39/42, 15.09.95. 15. Патент РСТ N 94/06904; A 61 K 39/12, 31.03.94. 16. Патент США N 4530831, A 61 K 39/12, 23.07.85. 17. Патент США N 5064646, A 61 K 39/12, 12.10.91. 18. Патент США N 4824668, A 61 K 35/76, 25.04.89. 19. Патент США N 5192539, A 61 K 39/12, 19.05.89. 20. Патент ЕПВ N 0352835, A 61 K 39/12, 31.01.90. 21. Патент Венгрии N 203780, C 12 N 7/00, 10.09.91. 22. Патент Венгрии N 203781, C 12 N 7/00, 30.09.91. 23. Патент ФРГ N 3604109, A 61 K 39/00, 14.08.86. 24. Патент ЧССР N 209379, A 61 K 39/12, 27.02.81 25. Патент Швейцарии N 560760, C 12 N 7/00, 09.09.71. 26. Патент Румынии N 100319, A 61 K 39/12, 29.10.90. 27. Патент Канады N 1232543, A 61 K 39/12, 09.02.88. 28. Алиев А. С. Специфическая профилактика инфекционного бурсита кур. Ветеринария. - 1991, 3, 3. 29. Гудзиев П.Х. Иммунологические свойства вакцинного штамма "СТ" и эффективность специфической профилактики бурсальной болезни птиц. - Тарту. Эстонская СХА, 1990, 21.

Формула изобретения

1. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни птиц Bursitis infectiosa gallinal cem. Birnaviridal, pog. Avibirnavirus, серотип ВГНКИ N "БГ" 102-ДЕП, для производства средств специфической профилактики и диагностики инфекционной бурсальной болезни птиц. 2. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала она содержит аттенуированный штамм вируса инфекционной бурсальной болезни птиц ВГНКИ N "БГ" 102-ДЕП, репродуцированный на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл при следующем соотношении компонентов, мас.%: Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса инфекционной бурсальной болезни птиц ВГНКИ N "БГ" 102-ДЕП, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл - 85 - 95 Стабилизатор - 5 - 15

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9

www.findpatent.ru

Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма “БГ”

Фармакологическая группа:

Иммунотропные средства. Вакцины живые.

«Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ» по основным характеристикам соответствует требованиям, изложенным в «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2013».

«Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ» зарегистрирована в РФ. Номер регистрационного удостоверения:12-1-20.13-1527 №ПВР-1-2.8/02126.

Назначение:

Вакцина предназначена для профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) у цыплят путем создания активного специфического иммунитета.

Состав:

Действующее вещество. Биологически активный аттенуированный вариант вируса ИББ (штмм «БГ»)

Таксономия штамма. Семейство: Birnaviridae; Род: Avibirnavirus; Серотип Ι.

Система культивирования вируса. Системой культивирования штамма «БГ» вируса ИББ являются развивающиеся эмбрионы кур международной категории SPF (Specific Pathogen Free).

Биологическая чистота вируса (исключение контаминантов). Все производственные генерации штамма «БГ» вируса ИББ (Original Virus, Master Seed и Working Seed) тестированы на контаминацию бактериальной микрофлорой и грибами по ГОСТ 28085, а также прошли контроль в ПЦР на исключение присутствия геномов посторонних вирусов и микоплазм.

Состав препарата. Вакцина представляет собой лиофилизованный гомогенат, состоящий из вируссодержащей ткани тела эмбрионов, хориоаллантоисной оболочки и экстраэмбриональной жидкости с добавлением сахарозы (5%) гидролизата лактальбумина (5%), и желатозы (0,5%).

Иммунуологические свойства:

Вакцина вызывает формирование активного иммунитета к возбудителю ИББ через 14-21 сутки после двукратного применения, который сохраняется в течение всего периода продуктивного использования птиц. Одна иммунизирующая доза вакцины содержит 10³ ЭИД50 вируса ИББ штамма «БГ». Вакцина безвредна, лечебными свойствами не обладает.

Применение:

Вирусвакцина предназначена для профилактики ИББ у цыплят в неблагополучных и угрожаемых птицеводческих хозяйствах различного направления выращивания.

Вакцинации подлежат цыплята в возрасте 7-21 суток. Вирусвакцину применяют двукратно методом выпаивания с интервалом 10-14 суток.

Конкретный срок первой иммунизации зависит от эпизоотической ситуации в хозяйстве и уровня трансовариальных антител.

Применение вакцины в уставленной дозировке для клинически здоровых птиц является безвредным и не влечет за собой существенных изменений в их состоянии.

Расфасовка, маркировка и упаковка:

Вакцина расфасована по 2-4 см³ в стеклянные флаконы соответствующей вместимости, в которых проведено ее лиофилизирование. Флаконы герметично закрыты резиновыми пробками, укрепленными металлическими колпачками. Флаконы с лиофилизированным материалом заполнены инертным газом (азотом) или вакуумированы.

Флаконы с вакциной размещены в коробки из полистирола с гнездами, обеспечивающие их сохранность при транспортировании.

Флаконы и коробки этикетированы в соответствии с Федеральным законом об обращении лекарственных средств (редакция от 25.12.2012 г).

Транспортирование, хранение и срок годности препарата:

Вакцину транспортируют всеми видами крытого транспорта в соответствии с ГОСТ 17786 и «Правилами перевозок скоропортящихся грузов и багажа», действующими на данном виде транспорта.

Вакцину хранят в организации-производителе, у потребителя и в торговых организациях в коробках изготовителя (и в транспортной таре) в сухом темном помещении, при температуре от 2ºС до 8ºС.

Срок годности вакцины 12 мес с даты выпуска. Датой выпуска считают дату подписания документа о качестве.

Гарантии изготовителя:

«Вирусвакцину против инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ» производят согласно регламенту, утвержденному в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Технические требования к препарату отражены в СТО 00495527-0081-2013.

Каждые 2 года препарат проходит государственный контроль на предмет получения сертификата качества.

Каждая серия вакцины и разбавителя проходит производственный контроль(ГОСТ Р 52684), результаты которого являются основанием для разрешения на реализацию препарата и закрепляются в соответствующем документе, характеризующем качество препарата (паспорте на серию вакцины).

Организация-производитель гарантирует соответствие «Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма «БГ» требованиям СТО при соблюдении условий транспортирования, хранения и применения.

Filling/ dosage:

Флакон, 1-5 тыс. доз

www.arriah.ru

Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Вакцина содержит вируссодержащий материал из авирулентного крупно-бляшечного штамма "КБК" с биологической активностью 5,5-6,5 lg ЭИД50/мл и стабилизатор. Вакцина обладает высокой иммуногенной активностью, безвредна. 10 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве вакцины против инфекционной бурсальной болезни (ИББ).

Инфекционная бурсальная болезнь - широко распространенная высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят преимущественно в возрасте 15-80 дней, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. За последние 10 лет ИББ получила широкое распространение и зарегистрирована практически в большинстве крупных птицеводческих хозяйствах России. Экономический ущерб от ИББ, обусловленный гибелью цыплят до 20-70% при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также вследствие возникновения вторичных инфекций, очень велик. В настоящее время общепризнанно, что единственно правильным и надежным направлением профилактики данной инфекции является применение вакцинных препаратов. Для специфической профилактики ИББ применяют живые и инактивированные вакцины. К преимуществам живых вакцин следует отнести низкую их себестоимость, высокие эксплуатационные свойства, способность формировать высокий уровень напряженности иммунитета на более длительный срок. Известна вакцина против ИББ птиц, включающая авирулентный генетически однородный вирусный материал из штамма "ВНИВИП" вируса ИББ птиц. Для профилактики заболевания птицу иммунизируют с суточного возраста, так как вакцина безвредна для птиц любого возраста [1]. Недостаток данной вакцины состоит в том, что она предназначена для профилактики заболевания в благополучных хозяйствах, а в условиях неблагополучных хозяйств, а также при наличии высокого уровня материнских антител эффективность ее применения крайне низка. Известна также вакцина против ИББ птиц на основе штамма "БГ", адаптированного к СПФ-эмбрионам кур с биологической активностью 5,25-6,0 lg ЭИД50/мл. Цыплят вакцинируют с 10-14-дневного возраста дважды с интервалом 10-14 дней в дозе 100-1000 ЭИД50/мл методом выпаивания. Вакцина способна преодолеть материнские антитела против ИББ [2]. Опыт ее применения в практике выявил недостаточность аттенуации этого штамма. Вакцина из штамма "БГ" негативно влияет на общую резистентность организма, снижение иммунной реактивности птицы на вакцины против других инфекций, а также оказывает отрицательное влияние на прирост живой массы птицы. По данным Скутаря И.Г. с соавторами в хозяйствах, где профилактика ИББ проводится с применением вакцины из штамма "БГ", на 5-6 сутки после иммунизации отмечаются выраженные клинические признаки заболевания и гибель до 5% птиц [3]. В исследованиях Reece R.L. et al. [4] установлено, что прямая корреляция между способностью вакцинного штамма преодолеть материнский иммунитет и вызвать атрофию фабрициевой сумки, т.е. проявление субклинического течения заболевания, сопровождающегося выраженной иммунодепрессией вакцинированной птицы. Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИББ птиц из штамма "Винтерфильд 84-ДЕП", исходным вирусом для которой использован штамм "Винтерфильд - 2512", выделенный от больной птицы в США в 1965 году. Штамм "Винтерфильд 84-ДЕП" репродуцируется как в культуре клеток ФЭК, так и на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 6,5-8 lg ТЦД50/мл и 5,00-6,00 lg ЭИД50/мл соответственно. Цыплят вакцинируют с 7-10-дневного возраста дважды с интервалом 10 дней методом выпаивания [5]. Недостаток данной вакцины состоит в ее низкой иммуногенной активности и нестабильности основных иммунобиологических свойств. Haffer К. [6] провел сравнительное изучение основных свойств вакцинных штаммов вируса ИББ из группы "Винтерфильд", используемых для производства вакцины ИББ в различных странах. Эти исследования показали, что все штаммы класса "Винтерфильд" за период их длительного применения в производстве прошли многократное (более 150) пассирование в разных условиях культивирования, что послужило причиной потери стабильности основных свойств этих штаммов (иммуногенность, антигенность, генетическая однородность). В итоге сама возможность производства вакцин из этих штаммов, отвечающих существующим стандартам, сомнительна. Целью изобретения является получение высокоиммуногенной, эффективной, безопасной вакцины, а также уменьшение средств при вакцинопрофилактике ИББ. Для достижения цели при производстве вакцины в качестве вакцинного штамма используют штамм "КБК", авирулентный крупнобляшечный клон, адаптированный к СПФ-эмбрионам кур 10-суточной инкубации с титром биологической активности 5,5-6,5 lg ЭИД50/мл. Для профилактики ИББ птицу иммунизируют подкожно с суточного возраста в возрасте 2,5-2,7 ЭИД50/мл. Ранее вакцинный штамм "КБК" вируса ИББ культивировали в культуре клеток БГМ-70 и был выделен клон, образующий в культуре клеток бляшки 4-5 мм в диаметре [7] . В дальнейшем была проведена планомерная адаптация выделенного клона к СПФ-эмбрионам кур путем проведения 50 последовательных пассажей. Степень адаптации вируса к СПФ-эмбрионам кур оценивали путем определения биологической активности вируссодержащего материала через 5-, 10-, 20-, 30-, 40- и 50 пассажей (табл. 1). Для получения вакцины готовили матровый материал из штамма "КБК" вируса ИББ птиц. Полученную вируссодержащую жидкость использовали для массового заражения 10-суточных СПФ-эмбрионов кур. Вирусный материал в объеме 0,2 мл вводили на хориоаллантоисную оболочку (ХАО) и зараженные СПФ-эмбрионы инкубировали при 37,7-38,0oС в течение 48-125 часов. Павшие эмбрионы гомогенизировали, трехкратно замораживали и размораживали с добавлением фосфатно-солевого буфера с рН 7,4-7,5 и центрифугировали в течение 30 минут при 5000 об/мин. Вируссодержащую надосадочную жидкость с биологической активностью не ниже 5,5-6,5 lg ЭИД50/мл осторожно сливали в стерильных условиях, а затем добавляли стабилизатор (обезжиренное молоко, пептон, лактозу, сахарозу) в соотношении 1:1 и подвергали лиофилизации. Лиофилизированная вакцина хранится при температуре 4-8oС в течение от 1 года до 1,5 лет. Пример 1. Определение оптимальной иммунизирующей дозы вакцины из штамма "КБК" Опыты по изучению оптимальной иммунизирующей дозы вакцины из штамма "КБК" провели на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста с использованием вируса 40-го пассажа с активностью вируса 6,0 lg ЭИД50/мл. Предварительно были приготовлены десятикратные разведения вируса и каждым его разведением были вакцинированы по 10 СПФ-цыплят. Вакцину выпаивали с водой. В контроле были использованы 10 не вакцинированных СПФ-цыплят. Контрольное заражение цыплят во всех группах проводили вирулентным штаммом "52/70-М" вируса ИББ в дозе 100 ИД50/мл через 21 сут после прививки. Опыты провели в трех повторностях. Протоколы опытов по проверке иммуногенной активности вакцинного штамма "КБК" приведены в табл.2. Результаты опытов свидетельствуют о том, что вакцинация СПФ-цыплят вирусом КБК в дозе 2,5 lg ЭИД50/мл методом выпаивания обеспечивает 100% иммунитет. Однако, учитывая, что для вакцинации цыплят с пассивным иммунитетом требуется некий "запас" вируса, в качестве иммунизирующей дозы была выбрана 2,5 lg ЭИД50/мл. Пример 2. Определение безвредности вакцины из штамма "КБК" Безвредность вакцинного штамма "КБК" проверяли на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста. Для этого 15 цыплятам ввели перорально вирус в дозе 3,5 lg ЭИД50/мл. По истечении срока наблюдения (15 дней) цыплята опытной и контрольной групп были убиты с целью выявления патологоанатомических изменений, свойственных ИББ. Во всех внутренних органах и фабрициевой сумке патологоанатомические изменения не выявлены. Сохранность структуры фабрициевой сумки была подтверждена и при гистологическом исследовании. Пример 3. Иммуногенная активность вакцины из штамма "КБК" на уровне разных пассажей на СПФ-эмбрионах кур Для оценки иммуногенной активности на СПФ-цыплятах 14-суточного возраста использовали вирус 10-го, 30-го, 40-го и 50-го пассажей. Установлено, что штамм "КБК" всех уровней пассажа при однократном применении с водой в дозе 2,0 lg ЭИД50/мл обеспечивает 100% защиту от контрольного заражения вирулентным штаммом через 21 день после вакцинации, что свидетельствует о стабильности его иммуногенных свойств (табл.3). Пример 4. Изучение сроков выработки и продолжительности иммунитета при подкожном введении штамма "КБК" Срок выработки и продолжительность поствакцинального иммунитета изучали на цыплятах, выведенных из СПФ-яиц. Для этой цели цыплят вакцинировали однократно подкожно штаммом "КБК" вируса ИББ в возрасте 14 дней в дозе 2,5 lg ЭИД50/мл. О состоянии иммунного статуса цыплят судили по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом "52/70-М" вируса ИББ, а также данным серологических исследований сыворотки крови в РДП и РН через 7, 14, 21, 28 и 42 дня (срок наблюдения) после иммунизации (табл.4). Установлено, что через 14 дней после вакцинации в РДП выявлены антитела в сыворотке крови 70% цыплят, а во все последующие сроки исследования - в 100% случаев. Индекс нейтрализации составил через 14 дней 2,8 lg, достигал максимального значения к 28 дням после иммунизации и сохранялся на этом уровне до конца опыта. При контрольном заражении вирулентным штаммом вируса ИББ через 14, 21, 28, 42 дня сохранность цыплят составила 100%. Не были отмечены также клинические и патологоанатомические признаки, свойственные инфекционной бурсальной болезни, тогда как в контрольных группах в 100% случаев имело место клиническое проявление заболевания и гибель цыплят от ИББ. Полученные данные свидетельствуют о высокой иммуногенности вируса "КБК". Пример 5. Проверка штамма "КБК" на реверсибельность. Проверку вакцинного штамма вируса ИББ на реверсибельность проводили 8-ю последовательными пассажами на СПФ-цыплятах 21-суточного возраста (по 10 голов на каждый пассаж). Для этого СПФ-цыплятам перорально вводили 0,5 мл вакцинного штамма в дозе 4,5 lg ЭИД50/мл. В опыте использовали вирус 40-го пассажа с активностью 5,5 lg ЭИД50/мл. На 4-е сутки после введения вакцинного штамма половину цыплят убивали и отбирали фабрициевы сумки, а за остальными вели клинические наблюдения в течение 15 сут, после чего патматериал от них исследовали гистологически, а сыворотки проверяли в РДП с антигеном вируса ИББ. Второй и последующие 6 пассажей проводили по той же схеме с той лишь разницей, что в качестве вируссодержащего материала брали гомогенат фабрициевых сумок цыплят предыдущего пассажа в разведении 1:10. Одновременно патматериал каждого пассажа исследовали гистологически. Результат этой серии опытов приведен в табл.5. Проведенные исследования показали, что при 8-кратном пассировании на СПФ-цыплятах вакцинный штамм не вызывал клинику и паткартину заболевания у подопытной птицы, т.е. пассирование вируса не привело к усилению его вирулентности. Пример 6. Проверка штамма "КБК" на иммунодепрессивную активность Вакцинный штамм "КБК" с целью проверки на иммунодепрессивную активность вводили подкожно суточным СПФ-цыплятам в рекомендуемой для иммунизации дозе 2,5 lg ЭИД50/мл. В качестве контроля служили не вакцинированные, а также СПФ-цыплята, зараженные вирулентным вирусом "52/70-М" (по 40 цыплят в группе). В возрасте 14 дней цыплят опытной и контрольной групп (20 голов) вакцинировали против Ньюкаслской болезни вакциной из штамма "Ла-Сота" согласно инструкции по ее применению. Вакцина была изготовлена 17.09.2000 г. на Курской биофабрике, серия 7, титр вируса 1010 ЭИД50/мл. Срок годности 12 мес. Аналогичные опыты с использованием вакцинного и вирулентного штаммов вируса ИББ были проведены на суточных цыплятах с пассивными антителами. Результаты, полученные в ходе этих исследования, представлены в табл.6. Из данных, приведенных в табл.6, следует, что средний титр антигемагглютининов в группе, где цыплятам ввели вакцинный штамм, составил 7,3 log2, что несколько ниже по сравнению с показателями интактных цыплят. Однако имеющаяся разница статистически недостоверна. Введение суточным СПФ-цыплятам вирулентного штамма вызывало значительное снижение иммунной реакции организма на последующее введение вакцины "Ла-Сота". Так, титр антигемагглютининов в РЗГА у цыплят после переболевания ИББ составил - 2,4 log2 при 8,6 log2 у интактных цыплят. Заражение цыплят с пассивным иммунитетом вирулентным штаммом ИББ, как и введение вакцинного штамма вируса, не оказывало существенного иммунодепрессивного влияния и это дает основание предположить, что пассивные антитела к вирусу ИББ предупреждают не только клиническое проявление заболевания, но и предохраняют птицу от иммунодепрессивного влияния вируса ИББ. Пример 7. Сравнительная оценка иммуногенности вакцинного штамма "КБК" и вакцины производства фирмы "ТАД" Следующим этапом нашей работы явилось изучение иммуногенности данного штамма в сравнении с вакциной фирмы "TAD" (Германия). В опытах использовали вакцинный штамм вируса ИББ, который прошел 50 пассажей на СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,75 lg ЭИД50/мл. Для контрольного заражения использовали вирулентный штамм "52/70-М" вируса ИББ в дозе 100 ИД50/мл. Вакцину фирмы "TAD" применяли согласно инструкции по ее применению. Было проведено два эксперимента (табл.7). В первом эксперименте СПФ-цыплята в одной группе были иммунизированы аттенуированным штаммом этого вируса однократно подкожно в дозе 2,5 lg ЭИД50/мл. Цыплята во второй группе были привиты зарубежной вакциной. Контролем служили не привитые цыплята, содержащиеся в изолированных боксах. Контрольное заражение опытных и контрольной групп цыплят проводили в 28-суточном возрасте. За цыплятами наблюдали в течение 10 сут после контрольного заражения. Как видно из табл. 13, однократная подкожная иммунизация аттенуированным штаммом "КБК" вируса ИББ, как и вакцинация вакциной фирмы "TAD", обеспечили 100% сохранность при контрольном заражении СПФ-цыплят и предотвратили клиническое проявление заболевания. В контроле заболеваемость цыплят составила 100%, а летальность -13,3%. Пример 8. Эффективность вакцины из штамма "КБК" при наличии материнского иммунитета Для изучения влияния материнских антител на формирование поствакцинального иммунитета провели опыт на цыплятах в возрасте 14, 21 и 28 сут, имеющих материнский иммунитет. Одна группа цыплят была иммунизирована двукратно в дозе 2,5 lg ЭИД50/мл в возрасте 14 и 35 сут. Контрольное заражение цыплят из всех групп проводили вирулентным штаммом "52/70-М" вируса ИББ в дозе 100 ИД50/мл через 21 день после вакцинации. Опыт проводили в сравнении с коммерческой вакциной производства фирмы "TAD". Результаты этих исследований приведены в табл.8. Из данных таблицы следует, что иммунизация цыплят разного возраста вакцинным штаммом "КБК" в одинаковой дозе обеспечивает различный процент защиты. Наибольший иммунологический эффект (95%) вакцинный штамм обеспечивает при иммунизации цыплят в возрасте 28 сут. Введение этой же дозы вакцины цыплятам в возрасте 14 и 21 сут создает иммунитет у 75 и 80% птицы соответственно. Эффективность двукратной вакцинации цыплят в возрасте 14 и 35 сут составила 100%. Пример 9. Эффективность применения вакцины из штамма "КБК" в зависимости от способа введения Оценку эффективности различных методов вакцинации против ИББ проводили на СПФ-цыплятах в возрасте 5-6 сут. Цыплятам первой группы вакцину вводили интраназально, второй - перорально, третью иммунизировали окулярно, четвертую - подкожным методом в область верхней трети шеи, а пятую группу прививали внутримышечно. Контролем служили не вакцинированные цыплята. Напряженность иммунитета против ИББ определяли по уровню вируспреципитирующих антител в сыворотке крови через 21 сут после иммунизации, а также по устойчивости привитой птицы к заражению вирулентным вирусом. Данные этих опытов приведены в табл.9. Приведенные в таблице данные свидетельствуют, что при всех способах введения вируса СПФ-цыплятам формируется достаточно высокий поствакцинальный иммунитет, что еще раз подтверждает эффективность предлагаемого штамма. На основании положительных результатов опытов по оценке иммуногенной активности вакцины из штамма "КБК" в лабораторных условиях нами проведено испытание препарата в производственных условиях ЗАО ППЗ "Большевик". Данные этого опыта приведены в табл. 10. На основании результатов серологических исследований в РДП и ИФА сывороток крови цыплят, вакцинированных опытными сериями вакцины из штамма "КБК", следует заключить: применение вакцины вызывает активную сероконверсию у привитой птицы. Об эффективности препарата также можно судить по результатам биопробы, где привитая птица имела 90-100% устойчивость при контрольном заражении. В настоящее время эпизоотическая ситуация по болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни в большинстве птицеводческих хозяйств остается сложной в связи с циркуляцией высокопатогенных штаммов возбудителей этих инфекций. Эффективность мер специфической профилактики против БМ и ИББ в значительной мере зависит от уровня формирования активного иммунитета к моменту контакта птицы с полевым вирусом. Степень такого риска в неблагополучных хозяйствах достаточно высока из-за большой концентрации возбудителей данных инфекций и их устойчивости во внешней среде. При этом у привитых цыплят формируется напряженный иммунитет против обеих инфекций. Нами проведен производственный опыт по изучению антигенной совместимости вакцинного штамма "КБК" вируса ИББ и полиштаммной вакцины болезни Марека на суточных цыплятах мясных пород. Всего было вакцинировано 450 тыс. цыплят. Вакцинацию цыплят проводили методом выпаивания двукратно в возрасте 7 и 17 дней (150 тыс. голов) путем подкожного однократного введения 150 тыс. голов и одновременно с вакцинацией против болезни Марека 150 тыс. голов. При одновременном способе вакцинации вакцины разводились в разбавителе вакцины болезни Марека в одном флаконе перед прививкой. Об эффективности вакцинации судили по результатам исследований сыворотки крови на наличие специфических антител к вирусу ИББ в РДП и ИФА, благополучию хозяйства по ИББ, продуктивности и сохранности молодняка, а также по уровню поствакцинального иммунитета после иммунизации цыплят вакциной из штамма "Ла-Сота", а также по количеству выявленных случаев болезни Марека при патологоанатомическом вскрытии птиц до 180-дневного возраста. Опыты показали, независимо от способа применения вакцины из штамма "КБК" признаков, характерных для инфекционной бурсальной болезни, выявлено не было. При двукратной вакцинации методом выпаивания положительная реакция на РДП по разным партиям птиц составляла от 80 до 95% в возрасте 35 дней. При однократном подкожном применении вакцины цыплята в суточном возрасте имели положительные результаты РДП в 100% случаев уже в возрасте 25 дней. При одновременной вакцинации против болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни антитела к вирусу ИББ в РДП выявлялись в 100% случаев в возрасте 25 дней. Титры антител в ИФА были одинаковы как при моновакцинации против ИББ, так и при одновременном методе иммунизации (среднегеометрический титр в ИФА - 2214, процент корреляции - 25-27). Количество случаев болезни Марека патологоанатомически зарегистрировано от 200 до 220 на 100 тыс. птиц в течение 180 дней содержания, что на 20-35 случаев ниже, чем при вакцинации птицы только вакциной против болезни Марека. Применение вакцины против ИББ не оказало негативного влияния на уровень напряженности иммунитета против болезни Ньюкасла. Титр антител в РЗГА к вирусу болезни Ньюкасла после однократной вакцинации через 15 дней составлял от 1: 16 до 1:64 и в единичных случаях 1:8 и 1:128 (при интраназальной вакцинации). Процент группового иммунитета от 92 до 98. Одновременный способ иммунизации против ИББ и болезни Марека по нашему мнению наиболее перспективный (при наличии пассивного иммунитета не более 30% по нашим наблюдениям), так как обеспечивает надежную защиту против ИББ и позволяет снизить затраты на вакцинации минимум в 2 раза. Процент сохранности птицы подопытных группах за период наблюдения составил 96,7%, суточный прирост массы тела в течение 36 дней (до постановки птицы на ограниченное кормление) 38-39,5 г. ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ 1. Авторское свидетельство СССР 1824443; МПК 5 С 12 N 7/00, А 61 К 39/12 30.06.93 г. 2. Патент РФ 2127602, МПК6 А 61 К 39/12, С 12 N 7/006 20.03.99 г. 3. Скутарь И.Г. с соавт. Профилактика инфекционных болезней птиц в условиях Республики Молдовы. // Ветеринария. - 1997. - 2. - с. 12-13. 4. Reece R.L., Gould J.A., Hindmarsh M. Studies on a vaccine against infectious bursal disease/ // Australian veterinary journal, 1982, Vol. 59, 1, p. 27-29. 5. Патент РФ 2127604, МПК6 6 А 61 К 39/12, С 12 N 7/00, 20.03.99 г. 6. Haffer K. Field test studies of the 2512 strain of infectious bursal disease. // Avian Dis, 1982, Vol. 26, 4, p. 847-851. 7. Патент РФ 2054038, МПК6 С 12 N 7/00, С 12 R 1/92, 10.02.96 г.

Формула изобретения

Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, включающая вируссодержащий материал из авирулентного штамма, адаптированного к СПФ-эмбрионам кур 10-суточной инкубации, и стабилизатора, используемого в равном соотношении, отличающаяся тем, что в качестве вакцинного штамма используется крупнобляшечный штамм "КБК" с биологической активностью 5,5-6,5 lg ЭИД50/мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10

www.findpatent.ru

Штамм "бг" вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средства для специфической профилактики и диагностики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. ИББ птиц (болезнь Гамборо) - высококонтагиозная болезнь, характеризуется поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей. В основном ИББ поражает В-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. Важным средством борьбы против ИББ, причиняющим экономический ущерб за счет гибели 20 - 70% птиц при остром ее течении, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц, является своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. ИББ протекает остро с характерной клиникой заболевания и субклинически. Широкое распространение имеет субклиническая форма. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднения при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза и требует наличия специфических высокоактивных стандартных антигенов и сывороток. Штаммы вируса ИББ, предназначенные для производства антигена и иммунной сыворотки, должны быть свободными от контаминации и обладать высокой биологической и антигенной активностью. Технология производства антигена при ИББ предусматривает инактивацию вируса, поэтому штаммы должны быть чувствительными к воздействию инактивирующих препаратов и контролироваться на полноту инактивации. Существующие диагностикумы готовят на СПФ-цыплятах, СПФ-эмбрионах и в культуре клеток. В зарубежной практике известен ряд штаммов вируса ИББ, используемых для изготовления антигенов и сывороток к данной инфекции - штамм "SR-1" [4], штамм "1/PY". Указанные штаммы культивируются на СПФ-цыплятах (свободных от патогенных факторов) или в культуре клеток различного происхождения [1]. Однако размножение вируса в культуре клеток вызывает снижение его антигенной активности. Полученные образцы антигена и сыворотки с использованием штаммов обладают низкой активностью и не поддаются стандартизации. Кроме того, вышеуказанные штаммы непригодны для использования в качестве вакцинных. Известно использование высокоактивных вирулентных штаммов вируса ИББ птиц для приготовления диагностикумов. Известен штамм "cheville", используемый для производства антигенов и сывороток для лабораторной диагностики ИББ птиц [1]. Однако указанный штамм непригоден для изготовления вакцин. Известен также штамм "27/94" вируса ИББ птиц для получения диагностикумов. Штамм культивируется и титруется на коммерческих цыплятах 35 - 40-дневного возраста и куриных эмбрионах. Штамм вызывает характерную клиническую и патологоанатомическую картину заболевания через 48 - 72 ч c титром вируса 105,5 - 106,0 ЭИД50/мл, и активность сыворотки крови достигает в реакции нейтрализации 1:1024 и в реакции диффузионной преципитации 1:64. Вирус свободен от контаминации, специфичен и активен [1]. Недостатком данного штамма является его вирулентность, что всегда создает проблемы при соблюдении ветеринарно-санитарной безопасности. Вакцинные штаммы непригодны в большинстве случае для изготовления диагностикумов по причине их низкой антигенной активности. Известен штамм "52/70" вируса ИББ птиц [2]. Указанный штамм является вирулентным и пригоден для изготовления только инактивированной вакцины. Известен вакцинный штамм "КБК" вируса ИББ птиц, репродуцируемый в перевиваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГМ-70 и предназначенный для изготовления вакцин [2]. Недостатками данного штамма являются его культивирование в перевиваемой культуре ткани, что всегда является потенциальной опасностью для работающего персонала ввиду онкогенности используемых клеток, а также его низкая антигенная активность. Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "ВНИВИП" вируса ИББ птиц, предназначенный для изготовления вакцины. Указанный штамм представляет собой авирулентный генетически однородный вирусный материал, легкокультивируемый в культуре клеток куриных фибробластов и биологической активностью вируса 105,5 - 106,0 ТЦД50/мл [3]. Недостаток данного штамма состоит в том, что он обладает низкой антигенной активностью. Проблема создания эффективных средств вакцинопрофилактики ИББ в России встала очень остро с появлением целого ряда очагов заболевания в период с 1991 по 1995 гг. Применение отечественных и импортных биопрепаратов в очагах инфекции не обеспечило ожидаемого эффекта. Это объясняется тем, что их применению не предшествовало изучение антигенных свойств циркулирующих изолятов вируса, не определялись специфические антитела у птицы до и после вакцинации, а также уровень пассивного материнского иммунитета у цыплят. Известна вакцина против ИББ птиц на основе штамма "52/70" [2]. Недостаток этой вакцины состоит в том, что штамм "52/70" является вирулентным, поэтому он пригоден для изготовления только инактивированной вакцины. Известна также вакцина против ИББ птиц на основе штамма "КБК", адаптированного к перевиваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГМ-70 [2]. Недостатки данной вакцины состоят в том, что для репродукции вируса используют перевиваемую линию клеток серо-зеленой мартышки, которая еще недостаточно изучена в отношении онкогенного воздействия на занятый в производстве препарата персонал, а также не изучены последствия влияния на человеческий организм мяса птицы, иммунизированной данной вакциной. Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИББ птиц, включающая авирулентный генетически однородный вирусный материал из штамма "ВНИВИП" и стабилизатор, взятые в равном соотношении. Указанный штамм репродуцируется в культуре клеток куриных фибробластов с биологической активностью 105,5 - 106,0 ТЦД50/мл. В качестве стабилизатора используют обезжиренное молоко. Для профилактики ИББ птицу иммунизируют до 60-дневного возраста путем подачи вакцины с водой в дозе 103,0 - 104,0 ТЦД50/мл [3]. Недостаток данной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью. В задачу создания настоящих изобретений входило получение штамма вируса ИББ птиц, обладающих высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодного для производства как диагностикумов, так и живой и инактивированной вакцины, а также разработка на его основе живой и инактивированной вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью. Технический результат от использования предлагаемых изобретений заключается в повышении специфической антигенной и иммуногенной активности и безвредности средств специфической профилактики и диагностики. Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для использования в другом изобретении. Указанный технический результат достигнут созданием аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц. Штамм "БГ" является новым, ранее не известным. Исходный вирус для получения штамма "БГ" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров птицефабрики "Уральская" Оренбургской области в 1993 году. Производственный штамм "БГ" получен путем многократных последовательных пассажей на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур. Штамм "БГ" депонирован в Государственной коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 21.06.96 г. под регистрационным номером "БГ" 102 ДЕП. По сравнению с прототипом штамм "БГ" является безвредным и обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления живой (табл. A, 6, 7, 8, 9,), инактивированной (табл. 5) вакцины и диагностических препаратов (табл. 1, 2, 3, 4). Штамм "БГ" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические свойства. Штамм "БГ" вируса ИББ птиц относится к семейству Birnaviridae, роду Avibirnavirus, серотипу I, обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона экосаэдрическая, размер вириона - 58 - 60 нм. Капсид - Т13, оболочка отсутствует. Антигенные свойства. По своим антигенным свойствам штамм "БГ" относится к сероварианту 1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемаглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА - 1: 400-1: 10000 и более, при гипериммунизации - в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА > 1: 10000. При определении антигенного соответствия вакцинного штамма "БГ" с полевыми изолятами вируса ИББ было проведено сравнение вариабельной области VP237 полевых изолятов, выделенных в 1993 - 1996 гг. на территории РФ и странах СНГ и 7 образцов коммерческих живых вакцин. Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Tag-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный этитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятор вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигено отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5 - 8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "БГ". Биотехнологические характеристики. Штамм "БГ" проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, а также высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993 - 1996 гг. Штамм "БГ" предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живой и инактивированной вакцины и диагностических биопрепаратов. Штамм "БГ" репродуцируется в 10-суточных СПФ куриных эмбрионов при 37,7oC и влажности 55 - 64%. В течение 72 - 96 ч инкубирования вирус накапливается до 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл. Штамм "БГ" является стабильным и безвредным. Хемо- и генотоксономическая характеристика. Штамм "БГ" является РНК-содержащим вирусом с мол. мас. 2,16 · 106 Д. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирус имеет белковую оболочку, содержащую 5 видов белков (VP1 - VP5). Липиды отсутствуют. Белковая оболочка обнаруживает следующие ферменты:VP1 - РНК-зависимая РНК-полимераза;VP2 и VP3 - структурные белки;VP4 - протеаза;VP5 - не идентифицирован. Штамм "БГ" проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в VP2. Аминокислотные изменения в VP2 определяют антигенную вариабельность. Сегмент A нуклеиновой кислоты содержит 2 частично перекрывающие открытые рамки для считывания малого VP5 и большого полипротеинового предшественника белков VP2 и VP3. Сегмент B кодирует VP1. Физические свойства. Масса вириона - 55 · 106Д. Коэффициент седиментации - 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33 - 1,34 г/мл в градиенте CsCl. Устойчивость к внешним факторам. Штамм "БГ" устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, y-облучению и высыханию. Дополнительные признаки и свойства. Иммуногенная активность - 100%. Реактогенность отсутствует. Патогенность отсутствует. Вирулентность отсутствует. Онкогенность отсутствует. Контагиозность отсутствует. Стабильность аттенуации отмечена при проведении 5 пассажей на чувствительных цыплятах. По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентноспособности "новизна" и изобретательский уровень". Указанный технический результат достигнут также созданием вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупность признаков:1) вакцина против ИББ птиц;2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл, в концентрации 85 - 95 мас.%;3) стабилизатор - 5 - 15 мас.%. В качестве стабилизатора можно использовать отдельно или в комбинации обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др. Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:1) вакцина против ИББ птиц;2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2, в концентрации 85 - 95 мас.%;3) стабилизатор - 5 - 15 мас.%. По сравнению с прототипом существенным отличительным признаком изобретения является использование в качестве вируссодержащего материала аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10 - суточных СПФ-эмбрионах кур и титром биологической активности 5,25 - 65,0 lg ЭИД50/0,2 мл. По сравнению с прототипом вирусвакцина на основе аттенуированного штамма "БГ" обладает более высокой иммуногенной активностью, является безвредной и способна преодолеть материнские антитела против ИББ. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемой вакцине, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения. Пример 1. Приготовление диагностического антигена. СПФ-цыплятам 14-21-дневного возраста инокулируют штамм "БГ" (интроакулярно, интраназально или орально). Через 72 цыплят убивают, берут бурсы, замораживают. Затем бурсы мелко размельчают, растирают со стерильным стеклянным песком, смешивают с фосфатным буфером 1:1, дважды промораживают, центрифугируют 1 мин при 3000 об/мин, супернатант сливают, инактивируют и используют для работы. Результаты исследований по определению активности антигена ИББ в РДП представлены в табл. 1. Пример 2. Приготовление диагностической сыворотки. СПФ-цыплятам 14 - 21-дневного возраста инокулируют орально живую вакцину из штамма "БГ" вируса ИББ. Через 14 дней вводят внутримышечно инактивированный антиген, в качестве адъюванта используя масло, а через две недели цыплят обескровливают и получают генериммунную активную сыворотку и определяют ее активность в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в табл. 2. Пример 3. приготовление диагностической сыворотки. СПФ-цыплятам 14 - 21-дневного возраста вводят орально живую вакцину из штамма "БГ" вируса ИББ. Через 14 дней внутримышечно вводят инактивированный антиген, используя в качестве адъюванта гидрат окиси алюминия. Через 2 недели цыплят обескровливают, получают сыворотку и определяют ее активность в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в табл. 3. Пример 4. Приготовление диагностической сыворотки. СПФ-цыплятам 14 - 21-дневного возраста вводят орально живую вакцину из штамма "БГ" вируса ИББ. Через 14 дней инокулируют внутримышечно инактивированный антиген, в качестве адъюванта масло, через 10 дней инактивированный антиген вводят повторно и через 7 дней цыплят обескровливают, получают сыворотку и определяют ее активность. К исследованной сыворотке добавляют стабилизирующие добавки и ее подвергают лиофилизации. Лиофилизированную сыворотку используют для наборов ИФА и РДП. Результаты исследования полученной сыворотки представлены в табл. 4. Пример 5. Приготовление и испытание инактивированной вакцины. Инактивированную вакцину против ИББ птиц готовят из штамма "БГ" вируса, выращенного в развивающихся СПФ-эмбрионах кур. Вирус инактивируют азиридином, сорбируют на гидроокись алюминия с добавлением сапонина. Результаты исследований по определению иммуногенной активности инактивированной вакцины из штамма "БГ" представлены в табл. 5. Пример 6. Приготовление аттенуированной вакцины. На первом этапе готовят матровый материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц. Полученную вируссодержащую жидкость используют для массового зарaжения 10-суточныx СПФ-эмбрионов кур. Вирусный материал в количестве 0,2 мл инокулируют на хориоаллантоисные оболочки (ХАО) и инкубируют при 37,7oC 48 - 120 ч. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при -40oC, и полученное сырье используют для приготовления вакцины. Вируссодержащий материал размораживают измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют при 4oC в течение 45 мин, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер pH 7,5 и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Вируссодержащую надосадочную жидкость осторожно сливают в стерильных условиях, а затем добавляют стабилизатор, в качестве которого можно использовать (отдельно или в комбинации) обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др., расфасовывают во флаконы, промораживают при -60-(-80oC) и подвергают лиофилизации. Лиофилизованный материал закупоривают под вакуумом и подвергают исследованию на иммуногенность (на 14-дневных СПФ-цыплятах) и на безвредность (на 30-дневных СПФ-цыплятах). Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу розово-коричневого цвета в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде. При растворении в воде до исходного объема она превращается в стойкую однородную суспензию розово-коричневого цвета. Вакцину применяют в хозяйствах, где регистрируют клинические и патологоанатомические признаки проявления ИББ. Цыплят вакцинируют с 10 - 14-дневного возраста дважды с интервалом 10 - 14 дней в дозе 100 - 1000 ЭИД50/мл методом выпаивания. Иммунитет у птиц наступает через 14 - 21-й день после второй прививки и сохраняется в течение всего восприимчивого к ИББ периода. Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав в мас.% (см. табл. A). Полученная вакцина при титровании на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур имеет титр 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл. Пример 7. Испытание сухой аттенуированной вакцины. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%:Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур c титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл - 85Стабилизатор - 15Определение иммуногенной активности вакцины проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-крaтные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 14 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 6. Данные табл. 6 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 100%-ную защиту цыплят, выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц. Пример 8. Испытание сухой аттенуированной вакцины. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%:Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл - 90Стабилизатор - 10Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 14 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 7. Данные табл. 7 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 100%-ную защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц. Пример 9. Испытание сухой аттенуированной вакцины. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%:Вирусодержащий материал из аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл - 95Стабилизатор - 5Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 1-кратные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизированной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 14 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 8. Данные табл. 8 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 100%-ную защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц. Пример 10. Сравнительная оценка вирусвакцин против ИББ птиц. В опытах были использованы вакцины из штамма "Тавиар" (Италия), из штамма "Д-78" (Голландия), из штамма "Гумбораль СТ" (Франция), из штамма "ВНИВИП" (Россия) и из штамма "БГ" (Россия). Изучение эффективности указанных вакцин проводили на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста. Всем цыплятам инокулировали орально по одной дозе одной из указанных выше вакцин. Оценку эффективности вакцин проводили по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом 52/70 ИББ всех групп цыплят через 14 суток после их вакцинации. Результаты исследований приведены в табл. 9. Данные табл. 9 свидетельствуют о том, что при контрольном заражении вакцинированных цыплят вирулентным штаммом 52/70 ИББ в дозе 104 ТЦД50/мл 100% защиту обеспечивает только вакцина, приготовленная из штамма "БГ". Пример 11. Испытание сухой аттенуированной вакцины. В лабораторных экспериментах и в условиях птицехозяйств Российской Федерации проведена сравнительная оценка иммуногенности различных отечественных и импортных живых вакцин против ИББ и показано, что вирусвакцина сухая против ИББ из штамма "БГ" является более надежным и эффективным биопрепаратом по сравнению с импортными вакцинами. Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемых изобретений следующей совокупности условий:- штамм "БГ" вируса ИББ птиц и вакцина против ИББ птиц, воплощающие предлагаемые изобретения, предназначены для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной медицине и биотехнологии;- для предлагаемых изобретений в том виде, как они охарактеризованы в независимых пунктах формулы изобретения, подтверждена возможность их осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;- штамм "БГ" вируса ИББ птиц и вакцина на его основе, полученные в соответствии с предлагаемыми изобретениями, обладают высокой специфической, иммуногенной и антигенной активностью, безвредностью и ареактогенностью. Следовательно, предлагаемая группа изобретений соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Источники информации1. Авторское свидетельство СССР N 1761802, C 12 N 7/00, 22.11.90. 2. Патент РФ N 2054038, C 12 N 7/08, 01.06.93. 3. Авторское свидетельство СССР N 1824443, C 12 N 7/00, 19.03.91. 4. Авторское свидетельство СССР N 1668392, A 61 K 7/00, 16.09.895. Патент Австралии N 565768, A 61 K 39/12, 24.09.87. 6. Патент Австралии N 574190, C 12 N 15/33, 07.01.91. 7. Патент Австралии N 374885, A 61 K 39/12, 26.06.85. 8. Патент Австралии N 3825289, A 61 K 39/12, 21.07.88. 9. Патент РСТ N 85/02545, A 61 K 39/12, 20.06.85. 10. Патент РСТ N 86/00529, A 61 K 39/12, 30.01.86. 11. Патент РСТ N 91/04749, A 61 K 39/00, 18.04.91. 12. Патент РСТ N 91/04750, A 61 K 39/42, 18.04.91. 13. Патент РСТ N 91/16925, C 12 N 15/00, 14.11.9114. Патент РСТ N 94/06475, A 61 K 39/42, 15.09.95. 15. Патент РСТ N 94/06904; A 61 K 39/12, 31.03.94. 16. Патент США N 4530831, A 61 K 39/12, 23.07.85. 17. Патент США N 5064646, A 61 K 39/12, 12.10.91. 18. Патент США N 4824668, A 61 K 35/76, 25.04.89. 19. Патент США N 5192539, A 61 K 39/12, 19.05.89. 20. Патент ЕПВ N 0352835, A 61 K 39/12, 31.01.90. 21. Патент Венгрии N 203780, C 12 N 7/00, 10.09.91. 22. Патент Венгрии N 203781, C 12 N 7/00, 30.09.91. 23. Патент ФРГ N 3604109, A 61 K 39/00, 14.08.86. 24. Патент ЧССР N 209379, A 61 K 39/12, 27.02.8125. Патент Швейцарии N 560760, C 12 N 7/00, 09.09.71. 26. Патент Румынии N 100319, A 61 K 39/12, 29.10.90. 27. Патент Канады N 1232543, A 61 K 39/12, 09.02.88. 28. Алиев А. С. Специфическая профилактика инфекционного бурсита кур. Ветеринария. - 1991, 3, 3. 29. Гудзиев П.Х. Иммунологические свойства вакцинного штамма "СТ" и эффективность специфической профилактики бурсальной болезни птиц. - Тарту. Эстонская СХА, 1990, 21.

Формула изобретения

1. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни птиц Bursitis infectiosa gallinal cem. Birnaviridal, pog. Avibirnavirus, серотип ВГНКИ N "БГ" 102-ДЕП, для производства средств специфической профилактики и диагностики инфекционной бурсальной болезни птиц. 2. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала она содержит аттенуированный штамм вируса инфекционной бурсальной болезни птиц ВГНКИ N "БГ" 102-ДЕП, репродуцированный на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл при следующем соотношении компонентов, мас.%:Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса инфекционной бурсальной болезни птиц ВГНКИ N "БГ" 102-ДЕП, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл - 85 - 95Стабилизатор - 5 - 15

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2002

(73) Патентообладатель:

ЗАО "Венд-2000" (RU)

Договор № 15003 зарегистрирован 30.08.2002

Извещение опубликовано: 10.11.2002

bankpatentov.ru

инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц - патент РФ 2127603

Изобретение предназначено для специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. Инактивированная вакцина против ИББ птиц содержит антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, инактивант димер этиленимина, адъюванты гидроокись алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Штамм "БГ" депонирован в коллекции ВГНКИ под регистрационным номером "БГ" 102 ДЕП". Штамм "БГ" репродуцируется на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД 50/0,2 мл. Вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь. Вакцину применяют клинически здоровой птице в возрасте 110 - 120 суток однократно. Препарат вводят в объеме 0,5 см3 внутримышечно. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ птиц "родительской" стали и обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 15-25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевого вирулентного вируса ИББ в ранний период жизни. Технический результат - повышение иммуногенной активности и безвредности вакцины. 4 з.п.ф-лы, 4 табл. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. ИББ птиц (болезнь Гамборо) - это вирусное высококонтагиозное заболевание, характеризующееся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей. В основном ИББ поражает B-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. Важным средством борьбы против ИББ, причиняющей экономический ущерб за счет гибели 20 - 70% птиц при остром ее течении, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц, является его вакцинопрофилактика. Специфическая профилактика ИББ проводится с помощью живых и инактивированных вакцин. Хотя преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты при употреблении не вызывает сомнения, но иммунная реакция у птиц при их введении на всегда стабильна и в ряде случае вызывает осложнения после вакцинации. Кроме того, при ИББ введение живых вакцин взрослой птице не формирует напряженный иммунитет. Для его создания и сохранения на длительный период у кур-несушек с помощью живых вакцин необходимо ревакцинировать птицу через каждые 2 - 3 месяца в 3 - 10-кратной дозе, что связано с возрастными особенностями птицы. Следует учесть также, что подобная передозировка живых вакцин, если она даже для взрослой птицы небезопасна, то с эпизоотической точки зрения в хозяйствах, где на одной площадке выращивают птицу разного возраста, не может быть оправдана. В связи с этим проблема создания инактивированной вакцины против ИББ птиц является актуальной. В настоящее время для производства живой вакцин против ИББ предложен аттенуированный штамм "ВНИВИП". Указанный штамм репродуцируется в первичной культуре фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с биологической активностью 5,5 - 6,0 lg ТЦД50/мл и используется для специфической профилактики ИББ в живом виде с питьевой водой на молодняке птиц до 60-дневного возраста (1). Недостатком данного штамма является то, что после инактивации его антигенная активность значительно снижается, что не позволяет использовать штамм "ВНИВИП" в качестве антигена при изготовлении инактивированной вакцины проти ИББ. В зарубежной практике при изготовлении инактивированной вакцины широкого используют вирулентные штаммы вируса ИББ птиц. Известна инактивированная вакцина против ИББ птиц, включающая эффективное количество антигенного материала из штамма BIA 52/70 вируса ИББ птиц, репродуцированного в ткани фабрициевых сумок 30-40-дневных цыплят,

инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, патент № 2127603

- -пропиолактон в качестве инактиванта и масляный адъювант (2). Недостаток данной вакцины состоит в ее высокой себестоимости в связи с тем, что для культивирования данного штамма требуются чувствительные цыплята 30-40-дневного возраста, у которых вес фабрициевой сумки не меньше 1,5 - 2,5 г, поэтому выход вирусной массы ограничен. Данная вакцина непригодна для крупномасштабного производства. Известна также инактивированная вакцина против ИББ птиц, включающая эффективное количество антигенного материала из штамма BIA 52/70, репродуцированного в ткани фабрициевых сумок СПФ-цыплят 30-40-дневного возраста, формалин в качестве инактиванта и масляный адъювант. Формалин вносят до концентрации 3% (3). Недостатками такой вакцины являются ее высокая себестоимость и непригодность для крупномасштабного производства. Известна также инактивированная вакцина против ИББ птиц, включающая эффективное количество антигенного материала из штамма BIA 52/70 вируса ИББ птиц, репродуцированного на аллантоисных мембранах куриных эмбрионов, формалин в качестве инактиванта и масляный адъювант. Формалин вносят до концентрации 0,1% (4). Недостаток данной вакцины состоит в том, что для приготовления вируссодержащего материала используют вирулентный штамм, который всегда создает проблемы при соблюдении ветеринарно-санитарной безопасности. Известна также инактивированная вакцина против ИББ птиц, включающая эффективное количество антигенного материала из штамма GP/82, NCAIM N V(P)-001033, вируса ИББ птиц, репродуцированного в культуре клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур, инактивант и адъювант. В качестве инактиванта используют формулин, инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, патент № 2127603

- -пропиолактон, этиленимин или его производные, а в качестве адъюванта - ГОА или масляную эмульсию (5). Недостаток этой вакцины состоит в том, что она обладает также слабой иммуногенной активностью. Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИББ птиц, включающая эффективное количество антигенного материала из штамма Д78, АТСС N VR-2041, вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,5 lg ТЦД50/мл, инактивант и адъювант. В качестве инактиванта используют формалин,

- пропиолактон, этиленимин или его производные. В частности, формалин вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,4%. В качестве адъюванта используют гидроокись алюминия (ГОА) или масляный адъювант (6). Недостаток данной вакцины состоит в том, что она обладает слабой иммугоненной активностью. В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной вакцины против ИББ птиц на основе нового штамма "БГ" вируса ИББ птиц, обладающего высокой иммуногенностью и безвредностью в нативном виде и после инактивации. Технический результат от использования изобретения заключается в повышении иммуногенной активности и безвредности предлагаемой вакцины. Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков: 1) инактивированная вакцина против ИББ птиц; 2) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц; 3) штамм "БГ" репродуцирован на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл; 4) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц взят в эффективном количестве; 5) димер этиленимина (ДЭИ) в качестве инактиванта; 6) гидроокись алюминия (ГАО) в качестве адъюванта; 7) из адъювантов вакцина содержит дополнительно сапонин; 8) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин взяты в соотношении, мас.%: антигенный материал - 60 - 80 ДЭИ - 0,1 - 0,3 ГОА - 17,7 - 39,4 10% раствор сапонина - 0,5 - 2,0 Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1) инактивированная вакцина против ИББ птиц; 2) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц; 3) штамм "БГ" вируса ИББ птиц репродуцирован на 10-суточных СПФ-эмбрионных кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл; 4) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц взят в эффективном количестве; 5) инактивант; 6) адъювант. Предлагаемое изобретения характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения: 1) из инактивантов вакцина содержит ДЭИ; 2) из адъювантов вакцина содержит ГОА; 3) из адъювантов вакцина содержит дополнительно сапонин; 4) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин взяты в соотношении, мас.%: антигенный материал - 60 - 80 ДЭИ - 0,1 - 0,3 ГОА - 17,7 - 39,4 10% раствор сапонина - 0,5 - 2,0 Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются 1) инактивированная вакцина против ИББ птиц; 2) антигенный материал из штамма вируса ИББ птиц; 3) инактивант; 4) адъювант. По сравнению с вакциной-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются: 1) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц; 2) штамм "БГ" репродуцирован на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/2,0 мл; 3) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц взят в эффективном количестве. Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения 1) из инактивантов вакцина содержит ДЭИ; 2) из адъювантов вакцина содержит ГОА; 3) из адъювантов вакцина содержит дополнительно сапонин; 4) антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин взяты в соотношении, мас.%: антигенный материал - 60 - 80 ДЭИ - 0,1 - 0,3 ГОА - 17,7 - 39,4 10% раствор сапонина - 0,5 - 2,0 По сравнению с прототипом инактивированная вакцина на основе штамма "БГ" обладает более высокой иммуногенной активностью и является безвредной. Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины можно объяснить использованием в ее составе антигенного материала из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, обладающего по сравнению со штаммом Д78 более высокой иммуногенной активностью и безвредностью в нативном виде и после инактивации. Штаммы "БГ" является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма "БГ" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров птицефабрики "Уральская" Оренбургской области в 1993 году. Производственный штамм "БГ" получен путем многократных последовательных пассажей на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур. Штамм "БГ" депонирования в Государственной коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 21.06.96 г. под регистрационным номером "БГ 102 ДЕП". Штамм является безвредным и обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины. Штамм "БГ" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические свойства Штамм "БГ" вируса ИББ птиц (Bursitis infectisa gallinae) относится к семейству Birnaviridae, роду Avibirnavirus, серотипу 1, обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона экосаэдрическая, размер вириона - 58 - 60 нм. Капсид -Т13. Оболочка отсутствует. Антигенные свойства По своим антигенным свойствам штамм "БГ" относится к сероварианту I. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:1-1:64, в ИФА - 1:400-1:10000 и более, при гипериммунизации - в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА > 1:10000. При определении антигенного соответствия вакцинного штамма "БГ" с полевыми изолятами вируса ИББ было проведено сравнение вариабельной области VP2 37 полевых изолятов, выделенных в 1993 - 1996 гг. на территории РФ и странах СНГ, и 7 образцов коммерческих живых вакцин. Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Tag-ДНЦ-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный эпитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятор вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5 - 8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "БГ". Биотехнологические характеристики Штамм "БГ" проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, а также высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятор (30), выделенных на территории РФ в 1993 - 1996 гг.. Штамм "БГ" предназначен для использования в качестве сырья для изготовления как живой, так и инактивированной вакцины, а также диагностических биопрепаратов. Штамм "БГ" репродуцируется в 10-суточных СПФ-эмбрионах кур при 37,7oC и влажности 55 - 64%. В течение 72 - 96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл. Штамм "БГ" является стабильным и безвредным. Хемо- и генотаксономическая характеристика Штамм "БГ" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 2,16 инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, патент № 2127603

106Д. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (A и B). Вирус имеет белковую оболочку, содержащую 5 видов белков (VP1-VP5). Белковая оболочка обнаруживает следующие ферменты: VP1-РНК - зависимая РНК-полимераза; инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, патент № 2127603

структурные белки; VP4 - протеаза; VP5 - не идентифицирован. Штамм "БГ" проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в VP2. Аминокислотные изменения в VP2 определяют антигенную вариабельность. Сегмент A нуклеиновой кислоты содержит 2 частично перекрывающие открытые рамки для считывания малого VP5 и большого полипротеинового предшественника белков VP2 и VP3. Сегмент B кодирует VP1. Физические свойства Масса вириона - 55 инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, патент № 2127603

106Д. Коэффициент седиментации - 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33 - 1,34 г/мл в градиенте CsCl. Устойчивость к внешним факторам Штамм "БГ" устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению,

- -облучению и высыханию. Дополнительные признаки и свойства Иммуногенная активность - 100%. Реактогенность отсутствует. Патогенность отсутствует. Вирулентность отсутствует. Онкогенность отсутствует. Контагиозность отсутствует. Стабильность аттенуации отмечена при проведении 5 пассажей на чувствительных цыплятах. Проведенный заявителем анализ техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемой вакцине, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемой вакцины), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемой вакцины преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". Пример 1. Для получения вакцины из штамма "БГ" матровым вирусом заражают в объеме 0,2 мл хорошо развитые 10-дневные СПФ-эмбрионы кур на хориоаллантоисную оболочку в области искусственной пуги. Зараженные куриные эмбрионы инкубируют при 37,5oC и относительной влажности 60 - 70%. Полученный вируссодержащий материал подвергают размолу на коллоидной мельнице в течение 1- 12 минут. После этого вируссодержащую массу смешивают с фосфатным буфером, получая в результате 10% вируссодержащую суспензию. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей известным образом. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор. Для инактивации вируса используют ДЭИ. Предварительно готовят 10% раствор ДЭИ на деминерализованной воде, pH 7,9 - 8,0. Затем в подогретую до 27oC вируссодержащую суспензию вносят 10% раствор ДЭИ до концентрации 0,1%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживает при 27oC в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2 - 8oC. В качестве адъюванта-сорбента в вакцине используют стерильный 3 - 4% коллоидный раствор ГОА. pH ГОА устанавливают в пределах 7,5 - 7,6 и охлаждают до 2 - 8oC. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют ГОА до концентрации 1%. Затем к смеси дополнительно добавляют 10% раствор адъюванта сапонина из расчета 0,5 мг на дозу вакцины, доводя концентрацию сапонина в композиции до 0,5 - 2%. После перемешивания смеси в течение часа определяют pH препарата и при необходимости доводят его значение до 7,4 - 7,6. Полученную вакцину контролируют на авирулентность и стерильность и фасуют в стерильные флаконы. Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 280859-89 (ст. СЭВ 6280 - 88). Авирулентность препарата определяют методом трехкратных "слепых" пассажей вакцины на развивающихся СПФ-эмбрионах 9-11-суточного возраста. Полученная вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь. Вакцину применяют клинически здоровой птице для создания высокого уровня иммунитета. Птиц вакцинируют в возрасте 110 - 120 суток однократно. Препарат в объеме 0,5 см3 вводят внутримышечно. Иммунитет у привитой птицы наступает на 14 - 21 сутки после вакцинации и сохраняется до 12 месяцев. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ птиц "родительской стаи" и обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 15 - 25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевого вирулентного вируса ИББ в ранний период жизни. Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав, мас.%, приведенный в табл.1. Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата. Пример 2. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл - 60,0 ДЭИ - 0,1 ГОА - 39,4 10% раствор сапонина - 0,5 Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 30-дневного возраста, свободных от антител в вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 день у птиц брали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 1. Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц, приготовленной из антигенного материала штамма "БГ". Пример 3. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл - 70,0 ДЭИ - 0,2 ГОА - 28,8 10% раствор сапонина - 1,0 Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице N 2. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма "БГ". Пример 4. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: антигенный материал из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл - 80,0 ДЭИ - 0,3 ГОА - 17,7 10% раствор сапонина - 2,0 Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 30-дневного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 день у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 3. Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины птиц из штамма "БГ" вируса ИББ птиц. Пример 5. Провели сравнительную оценку иммуногенной активности предлагаемой вакцины и вакцины-прототипа. Иммуногенную активность вакцин определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител против вируса ИББ. Вакцины вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки крови и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице 4. Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что по имуногенной активности жидкая сорбированная инактивированная вакцина против ИББ, изготовления из аттенуированного штамма "БГ" (Россия), значительно превосходит эмульсионную вакцину против ИББ, изготовленную в Голландии, и обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 15 - 25-дневного возраста, что позволяет защитить его от заболевания ИББ в ранний период жизни. Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий: инактивированная вакцина против ИББ птиц, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной медицине и биотехнологии; для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов; инактивированная вакцина против ИББ птиц, приготовленная из штамма "БГ" в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и является безвредной. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Источники информации 1. Авт. свид. СССР N 1824443; МПК5 C 12 N 7/00, A 61 K 39/12; 30.06.93 г. 2. Wyeth P.J. The veterinary Record, 1979, 104, 188 - 193. 3. Пат. Румынии N 100319, A 61 K 39/12, 29.10.90 г. 4. Lucia B.e.a. Avian Diseases, 1979, 23, 2, 466 - 478. 5. Пат. Венгрии N 203781; C 12 N 7/00, A 61 K 39/12; 28.08.90 г. 6. Пат США N 4530831; A 61 K 39/12, C 12 N 7/00; 23.07.85 г. (прототип). 7. ГОСТ 280856 - 89.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, включающая антигенный материал из штамма вируса инфекционной бурсальной болезни птиц, инактивант и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигенного материала вакцина содержит штамм "БГ" 102 ДЕП" (коллекция микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов) вируса инфекционной бурсальной болезни птиц, репродуцированный на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл и взятый в эффективном количестве. 2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из инактивантов она содержит димер этиленимина. 3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит гидроокись алюминия. 4. Вакцина по пп.1 - 3, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит дополнительно сапонин. 5. Вакцина по пп.1 - 4, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма "БГ" 102 ДЕП" вируса инфекционной бурсальной болезни птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2 мл, димер этиленимина, гидроокись алюминия и 10%-ный раствор сапонина в соотношении, мас.%: Антигенный материал - 60 - 80 Димер этиленимина - 0,1 - 0,3 Гидроокись алюминия - 17,7 - 39,4 10%-ный раствор сапонина - 0,5 - 2,0

www.freepatent.ru

штамм "бг" вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц - патент РФ 2127602

Изобретение предназначено для специфической профилактики и диагностики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. Получен новый аттенуированный штамм "БГ" вируса ИББ птиц для изготовления средств специфической профилактики и диагностики. Штамм "БГ" депонирован в коллекции ВГНКИ под регистрационным номером "БГ" 102-ДЕП. Вакцина против ИББ птиц содержит вирусный материал из штамма "БГ" и стабилизатор в соотношении (маc.%) 85-95/5-15. Штамм "БГ" репродуцируется на 10-cуточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,25 - 6,0lg ЭИД50/0,2 мл. В качестве стабилизатора используют (отдельно или в комбинации) обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др. Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу розово-коричневого цвета в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде. Цыплят вакцинируют с 10-14-дневного возраста дважды с интервалом 10 - 14 дней в дозе 100 - 1000 ЭИД50 мл методом выпаивания. Иммунитет птиц наступает через 14 - 21-й день после второй прививки и сохраняется в течение всего восприимчивого периода. Технический результат: повышение специфической, иммуногенной и антигенной активности и безвредности средств специфической профилактики и диагностики. 2 c.п. ф-лы, 10 табл. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средства для специфической профилактики и диагностики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. ИББ птиц (болезнь Гамборо) - высококонтагиозная болезнь, характеризуется поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей. В основном ИББ поражает В-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. Важным средством борьбы против ИББ, причиняющим экономический ущерб за счет гибели 20 - 70% птиц при остром ее течении, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц, является своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. ИББ протекает остро с характерной клиникой заболевания и субклинически. Широкое распространение имеет субклиническая форма. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднения при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза и требует наличия специфических высокоактивных стандартных антигенов и сывороток. Штаммы вируса ИББ, предназначенные для производства антигена и иммунной сыворотки, должны быть свободными от контаминации и обладать высокой биологической и антигенной активностью. Технология производства антигена при ИББ предусматривает инактивацию вируса, поэтому штаммы должны быть чувствительными к воздействию инактивирующих препаратов и контролироваться на полноту инактивации. Существующие диагностикумы готовят на СПФ-цыплятах, СПФ-эмбрионах и в культуре клеток. В зарубежной практике известен ряд штаммов вируса ИББ, используемых для изготовления антигенов и сывороток к данной инфекции - штамм "SR-1" [4], штамм "1/PY". Указанные штаммы культивируются на СПФ-цыплятах (свободных от патогенных факторов) или в культуре клеток различного происхождения [1]. Однако размножение вируса в культуре клеток вызывает снижение его антигенной активности. Полученные образцы антигена и сыворотки с использованием штаммов обладают низкой активностью и не поддаются стандартизации. Кроме того, вышеуказанные штаммы непригодны для использования в качестве вакцинных. Известно использование высокоактивных вирулентных штаммов вируса ИББ птиц для приготовления диагностикумов. Известен штамм "cheville", используемый для производства антигенов и сывороток для лабораторной диагностики ИББ птиц [1]. Однако указанный штамм непригоден для изготовления вакцин. Известен также штамм "27/94" вируса ИББ птиц для получения диагностикумов. Штамм культивируется и титруется на коммерческих цыплятах 35 - 40-дневного возраста и куриных эмбрионах. Штамм вызывает характерную клиническую и патологоанатомическую картину заболевания через 48 - 72 ч c титром вируса 105,5 - 106,0 ЭИД50/мл, и активность сыворотки крови достигает в реакции нейтрализации 1:1024 и в реакции диффузионной преципитации 1:64. Вирус свободен от контаминации, специфичен и активен [1]. Недостатком данного штамма является его вирулентность, что всегда создает проблемы при соблюдении ветеринарно-санитарной безопасности. Вакцинные штаммы непригодны в большинстве случае для изготовления диагностикумов по причине их низкой антигенной активности. Известен штамм "52/70" вируса ИББ птиц [2]. Указанный штамм является вирулентным и пригоден для изготовления только инактивированной вакцины. Известен вакцинный штамм "КБК" вируса ИББ птиц, репродуцируемый в перевиваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГМ-70 и предназначенный для изготовления вакцин [2]. Недостатками данного штамма являются его культивирование в перевиваемой культуре ткани, что всегда является потенциальной опасностью для работающего персонала ввиду онкогенности используемых клеток, а также его низкая антигенная активность. Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "ВНИВИП" вируса ИББ птиц, предназначенный для изготовления вакцины. Указанный штамм представляет собой авирулентный генетически однородный вирусный материал, легкокультивируемый в культуре клеток куриных фибробластов и биологической активностью вируса 105,5 - 106,0 ТЦД50/мл [3]. Недостаток данного штамма состоит в том, что он обладает низкой антигенной активностью. Проблема создания эффективных средств вакцинопрофилактики ИББ в России встала очень остро с появлением целого ряда очагов заболевания в период с 1991 по 1995 гг. Применение отечественных и импортных биопрепаратов в очагах инфекции не обеспечило ожидаемого эффекта. Это объясняется тем, что их применению не предшествовало изучение антигенных свойств циркулирующих изолятов вируса, не определялись специфические антитела у птицы до и после вакцинации, а также уровень пассивного материнского иммунитета у цыплят. Известна вакцина против ИББ птиц на основе штамма "52/70" [2]. Недостаток этой вакцины состоит в том, что штамм "52/70" является вирулентным, поэтому он пригоден для изготовления только инактивированной вакцины. Известна также вакцина против ИББ птиц на основе штамма "КБК", адаптированного к перевиваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГМ-70 [2]. Недостатки данной вакцины состоят в том, что для репродукции вируса используют перевиваемую линию клеток серо-зеленой мартышки, которая еще недостаточно изучена в отношении онкогенного воздействия на занятый в производстве препарата персонал, а также не изучены последствия влияния на человеческий организм мяса птицы, иммунизированной данной вакциной. Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИББ птиц, включающая авирулентный генетически однородный вирусный материал из штамма "ВНИВИП" и стабилизатор, взятые в равном соотношении. Указанный штамм репродуцируется в культуре клеток куриных фибробластов с биологической активностью 105,5 - 106,0 ТЦД50/мл. В качестве стабилизатора используют обезжиренное молоко. Для профилактики ИББ птицу иммунизируют до 60-дневного возраста путем подачи вакцины с водой в дозе 103,0 - 104,0 ТЦД50/мл [3]. Недостаток данной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью. В задачу создания настоящих изобретений входило получение штамма вируса ИББ птиц, обладающих высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодного для производства как диагностикумов, так и живой и инактивированной вакцины, а также разработка на его основе живой и инактивированной вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью. Технический результат от использования предлагаемых изобретений заключается в повышении специфической антигенной и иммуногенной активности и безвредности средств специфической профилактики и диагностики. Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для использования в другом изобретении. Указанный технический результат достигнут созданием аттенуированного штамма "БГ" вируса ИББ птиц. Штамм "БГ" является новым, ранее не известным. Исходный вирус для получения штамма "БГ" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров птицефабрики "Уральская" Оренбургской области в 1993 году. Производственный штамм "БГ" получен путем многократных последовательных пассажей на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур. Штамм "БГ" депонирован в Государственной коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 21.06.96 г. под регистрационным номером "БГ" 102 ДЕП. По сравнению с прототипом штамм "БГ" является безвредным и обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления живой (табл. A, 6, 7, 8, 9,), инактивированной (табл. 5) вакцины и диагностических препаратов (табл. 1, 2, 3, 4). Штамм "БГ" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические свойства. Штамм "БГ" вируса ИББ птиц относится к семейству Birnaviridae, роду Avibirnavirus, серотипу I, обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона экосаэдрическая, размер вириона - 58 - 60 нм. Капсид - Т13, оболочка отсутствует. Антигенные свойства. По своим антигенным свойствам штамм "БГ" относится к сероварианту 1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемаглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА - 1: 400-1: 10000 и более, при гипериммунизации - в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА > 1: 10000. При определении антигенного соответствия вакцинного штамма "БГ" с полевыми изолятами вируса ИББ было проведено сравнение вариабельной области VP237 полевых изолятов, выделенных в 1993 - 1996 гг. на территории РФ и странах СНГ и 7 образцов коммерческих живых вакцин. Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Tag-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный этитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятор вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигено отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5 - 8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "БГ". Биотехнологические характеристики. Штамм "БГ" проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, а также высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993 - 1996 гг. Штамм "БГ" предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живой и инактивированной вакцины и диагностических биопрепаратов. Штамм "БГ" репродуцируется в 10-суточных СПФ куриных эмбрионов при 37,7oC и влажности 55 - 64%. В течение 72 - 96 ч инкубирования вирус накапливается до 5,25 - 6,0 lg ЭИД50/0,2мл. Штамм "БГ" является стабильным и безвредным. Хемо- и генотоксономическая характеристика. Штамм "БГ" является РНК-содержащим вирусом с мол. мас. 2,16

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

www.freepatent.ru

Смотрите также

г.Самара, ул. Димитрова 131
[email protected]