 |
|
|
|||||||||
|
Иммуногенность новой гриппозной вакцины. Титр вакциныКритерии оценки эффективности вакцинацииКРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИНАЦИИ Н.И. БрикоМосковская медицинская академия им. И.М. Сеченова Сегодня является бесспорным тот факт, что вакцинопрофилактика это наиболее мощный метод борьбы с инфекционной патологией. Вместе с тем, вакцинация относится к числу мероприятий, требующих значительных материальных затрат, поскольку предусматривает охват прививками широкие слои населения. В связи с этим важно иметь правильное представление об эффективности иммунизации. Вакцинопрофилактика как мероприятие оценивается по 3 группам критериев: показатели документированной привитости (охват прививками), уровень иммунологической или клинической эффективности (efficacy) и эпидемиологическая или полевая эффективность (effectiveness). Показатели охвата прививками позволяют косвенно оценить возможное состояние популяционного иммунитета. Объективными критериями качества вакцинного препарата, а также состояния защищенности коллектива против того или иного инфекционного заболевания являются показатели иммунологической (клинической) и эпидемиологической (полевой) эффективности. Иммунологическая эффективность отвечает на вопрос «работает ли вакцина?», в то время как эпидемиологическая – «защищает ли прививка людей?» [3,5]. Иными словами, иммунологическая эффективность вакцины и эффективность иммунизации как профилактического мероприятия – разные понятия. Если под иммунологической эффективностью вакцины принято понимать способность препарата вызывать иммунный ответ у привитого, то эффективность иммунизации – различия в заболеваемости в группе привитых и непривитых лиц [1,2]. Сбор сведений о привитости осуществляется на уровне педиатрического участка по данным журналов профилактических прививок (ф.064-У), карт профилактических прививок (ф.063-у), истории развития ребенка (ф.112-у), сертификата о профилактических прививках (ф.156-у). Эта информация передается в территориальные центры Госсанэпиднадзора, последние анализируют ее по территориям и передают в соответствующие ведомства. Оценка привитости проводится на основании изучения величины охвата прививками лиц декретированного возраста в соответствии с действующим календарем профилактических прививок, введенным Приказом МЗ РФ №375 от 18.12.97. Нормативными показателями охвата прививками в возрастных группах детей до 3-х лет следует считать 95,0%, в старших возрастных группах – 97-98%. Опыт борьбы с оспой показал, что 80-90% охват прививками недостаточен для ликвидации инфекции. Оспу удалось ликвидировать лишь при охвате 99% населения прививками. Это обстоятельство важно учитывать при решении задачи ликвидации других инфекций. Оценка иммунологической эффективности осуществляется выборочно среди различных групп населения и прицельно в индикаторных группах населения (получающих в соответствии с возрастом прививки), а также в группах риска (детские интернаты, дома ребенка и др.). Основные требования к иммунологическим исследованиям сводятся к следующему: 1) короткий промежуток времени, в течение которого исследуются все испытуемые сыворотки; 2) стандартность используемых диагностических препаратов; 3) высокая чувствительность иммунологического теста [2]. Выбор теста для оценки иммунологической эффективности вакцины зависит от характера иммунитета при данной инфекции. Например, для таких инфекций как столбняк, дифтерия, корь, паротит критерием эффективности вакцины является определение уровня циркулирующих специфических антител, а для туберкулеза, туляремии и бруцеллеза и др. – клеточные реакции (например, кожные реакции замедленной гиперчувствительности). К сожалению, для большинства инфекций, при которых основой защиты является клеточное звено иммунитета, уровни иммунных клеточных реакций не установлены. Изучение иммунологической эффективности вакцин проводится путем сопоставления титров специфических антител в сыворотке крови привитых до и в разные сроки после иммунизации, а также путем сравнения этих результатов с определяемыми уровнями антител, полученными в те же сроки при обследовании лиц, которым вводили плацебо или препарат сравнения. Плацебо помещают в точно такие же ампулы или флаконы, в которых содержится изучаемая вакцина. Первые сыворотки собираются непосредственно перед вакцинацией, последующие – обычно через месяц после введения препарата. При однократной вакцинации одновременному исследованию подлежат парные сыворотки крови. При двукратной – тройные сыворотки и т.д. Очень важно, чтобы сыворотки, собранные в разные сроки, титровались одновременно. В случае хранения сывороток, взятых в более ранние сроки, может произойти снижение их активности, в результате чего показатели иммуногенности будут искусственно завышены. Сыворотки следует хранить в замороженном состоянии, причем замораживанию должны быть подвергнуты все образцы как ранее собранных сывороток, так и свежих. В этом случае если и наблюдается снижение активности сывороток, то данный факт имеет равное значение для сывороток, полученных в разные сроки. Необходимость проведения подобных исследований определена неоднозначностью понятий «привит» и «защищен». Имеющийся опыт свидетельствует, что эти понятия далеко не всегда совпадают (рядом авторов это отмечено при дифтерии, кори и эпидемическом паротите). Иммунологическая активность вакцин может отражать ее профилактическую эффективность в том случае, если известен защитный уровень иммунологических показателей при данной инфекции. Защитный уровень антител устанавливается заранее на основании результатов опытов с однонаправленным препаратом. Для каждой инфекции определяется защитный титр антител (для кори, паротита и гриппа он равен 1:10, столбняка 1:20, дифтерии 1:40 в РПГА; для коклюша 0,03 МЕ/мл, гепатита В 0,01 МЕ/мл в иммуноферментной реакции и т.д.). Для инфекций, при которых не установлен защитный уровень антител, приходится проводить испытания профилактической эффективности вакцин по показателям заболеваемости данной инфекцией. Наиболее объективную оценку иммунологической эффективности вакцин можно получить при вакцинации серонегативных к специфическим антигенам людей. Из таких лиц формируют опытную и контрольную группы. Оценку иммуногенности вакцинного препарата осуществляют на основе определения разницы в числе лиц имеющих антитела в этих двух группах. Коэффициент иммунологической эффективности определяют по следующей формуле:
КЭ - коэффициент иммунологической эффективности; А – число привитых испытуемым препаратом, у которых исследовали парные сыворотки крови;Б – то же в контрольной группе лиц; а – число привитых с возникшим иммунологическим сдвигом;б – то же в контрольной группе. Сформировать группы лиц, у которых не определялись бы антитела к широко распространенным возбудителям (грипп, гепатит А и др.) подчас бывает довольно сложно. В таких случаях нередко эффективность препаратов оценивают по нарастанию титров специфических антител до и после вакцинации как в основной, так и в контрольной группе. Иммунологические сдвиги, возникающие при вакцинации, оцениваются также по проценту сероконверсии. Вакцина считается высоко эффективной, если процент сероконверсии составляет 90% и выше. Кроме того, важное значение имеет длительность поствакцинального протективного иммунитета, которая после введения, например, вакцины против желтой лихорадки составляет 10-15 лет, брюшного тифа (вакцины Вианвак и Тифим Ви) – 3 года, гепатита В не менее 7-10 лет. Опубликованы результаты исследований о сохранении антител к вирусу краснухи от 9 до 21 г. после прививки, причем серонегативность обнаруживалась только у 1% привитых вакциной Рудивакс [7]. Для оценки и слежения за уровнем популяционного иммунитета проводится плановый серологический (иммунологический) контроль. Он позволяет выявить группы людей, наиболее подверженных риску заболевания, оценить степень защищенности лиц, привитых с нарушением схемы иммунизации или не имеющих документов о вакцинации, дать оценку и составить прогноз изменения эпидемиологической ситуации на конкретной территории. Отбор лиц для обследования в целях изучения иммуноструктуры проводится на основе кластерной выборки, рекомендованной ВОЗ. Экстренный серологический контроль проводится в очагах инфекционных заболеваний с целью выявления неиммунных лиц, которые контактировали с источником инфекции и подлежат срочной активной или пассивной иммунизации. Он также показан для лиц с неясным прививочным анамнезом, при оценке вакцинального процесса у детей из групп риска, привитых щадящими методами, а также при развитии поствакцинальных осложнений. Результат оценки иммунологической (клинической) эффективности вакцин может дать представление, является ли вакцина иммуногенной и защищает ли она тех, кто привит. В то же время исследования относительной иммуногенности не могут дать ответ, какая из схем вакцинации обеспечивает лучшую защиту, и результаты испытаний клинической эффективности будут трудны для экстраполирования на условия рутинного применения вакцины в популяции. Таким образом, хотя исследования иммунологической эффективности вакцин необходимы, они часто не могут дать четкий ответ о выгоде, связанной с вакцинацией. Для оценки эпидемиологической эффективности используются как «когортные» исследования, так и метод «случай-контроль». Сроки наблюдения в контролируемом эпидемиологическом опыте должны быть достаточными для определения длительности иммунитета, формирующегося у привитых изучаемой вакциной. При наличии соответствующей документации защитный эффект вакцинации может быть оценен и ретроспективно, т.е. на основе уже имеющейся информации о заболеваемости привитых и непривитых лиц. Метод «случай-контроль» используется при оценке эффективности вакцинации в группах лиц (на определенных территориях), где зарегистрированы случаи соответствующих заболеваний. Каждый случай (или выборка) заболеваний сравнивается индивидуально по признаку вакцинации с соответствующими случаями незаболевания у лиц идентичных по возрасту, полу, условиям проживания и т.д. Среди исследований эпидемиологической (полевой) эффективности ретроспективный вид анализа наиболее распространен. Один из простых подходов, разработанных в середине 1980-х является скрининговый метод, широко применяющийся в оценочных программах вакцинации не только в развивающихся, но и в развитых странах. Скрининг-исследование требует только два типа данных контроля относительно каждой популяции: соотношение прошедших вакцинацию (PPV) и соотношение пациентов, которые были привиты, но заболели (PCV). Эффективность вакцинации рассчитывается с использованием алгебраического производного классического уравнения VE = 1 – относительный риск (5). Была разработана простая номограмма, позволяющая скрининг-исследованию быть легко применимым. Скрининг имеет два важных ограничения: для того, чтобы исследование было точным, частично привитые пациенты должны быть исключены из опыта, помимо этого большие погрешности могут иметь место всякий раз, когда PPV или PCV очень низки или очень высоки. Тем не менее, метод очень полезен, потому что, подобно всем скрининг-исследованиям, он показывает, являются ли клиническая (иммунологическая) и эпидемиологическая (полевая) эффективность вакцинации приемлемыми или требуют дальнейшего изучения. В условиях плановой вакцинации применяют обычные эпидемиологические исследования, детально описанные Оренштейном и соавт. [6]. Исследования эпидемиологической (полевой) эффективности прививки прямо отвечают на вопрос, «защищает ли прививка людей?». Оценка эпидемиологической эффективности предусматривает сбор информации об уровне заболеваемости, проявлениях эпидемического процесса во времени, в пространстве и среди различных групп населения. Основными критериями оценки эффекта массовой иммунизации служат не только показатели заболеваемости, но и смертности, изменения в характере очаговости, сезонности и цикличности, возрастной структуре болеющих, а также клинического течения соответствующего инфекционного заболевания. Эти критерии учитываются за достаточно длительный период времени до и после проведения прививок. Предусматривается определение индекса эффективности, коэффициента (показателя) защищенности, коэффициента тяжести клинического течения болезни. Коэффициент защищенности (Е) определяется по формуле
a – заболеваемость среди лиц, получивших препарат;б – заболеваемость среди лиц, не получивших препарат. По показателю защищенности можно определить, каков удельный вес людей из числа получающих вакцинный препарат защищенных от заболевания. Показатель защищенности может с известной долей достоверности выводиться из показателя непосредственного риска, определяемого в когортном эпидемиологическом исследовании. Индекс эффективности вакцинации равен показателю относительного риска. После вычисления коэффициентов эпидемиологической эффективности того или иного вакцинного препарата следует убедиться, что разница в заболеваемости является закономерной. Для этого следует провести соответствующую статистическую обработку полученного материала. Принято считать, что разница в показателях не является случайной, если уровень значимости p<0,05, т.е. когда вероятность отсутствия разницы в заболеваемости двух наблюдаемых групп не превышает 5%. Для более точной оценки коэффициента эпидемиологической эффективности того или иного препарата следует определить его доверительные границы. При этом коэффициент эпидемиологической эффективности не может быть меньше нижней доверительной границы. Это позволяет утверждать, что при повторных испытаниях данного препарата будут получены аналогичные результаты. ЛИТЕРАТУРА: medi.ru Иммуногенность новой гриппозной вакцины | #10/09Грипп и гриппоподобные заболевания занимают первое место по частоте и количеству случаев в мире. Эпидемия гриппа ежегодно приходит с наступлением осенне-зимнего сезона, и каждый раз иммунная система не готова к встрече с ним. Почему? Грипп является чемпионом среди вирусов по способности к генетической изменчивости, которая позволяет ему уходить от иммунного надзора. Вирус с изменившимися поверхностными белками уже не распознается специфическими противогриппозными антителами к штаммам-предшественникам. Наиболее эффективным, безопасным и экономически оправданным средством профилактики гриппа является вакцинация. Чтобы вакцина защищала от гриппа, должно быть четкое соответствие вакцинных штаммов эпидемическим. В отличие от большинства других вакцинных препаратов, существует необходимость ежегодного обновления штаммового состава противогриппозных вакцин и, следовательно, необходимость ежегодной иммунизации. Проблема гриппа давно вышла за пределы одной страны. Центрами по гриппу ВОЗ, организованными по всему миру, проводится регулярный мониторинг и сбор информации по сезонным циркулирующим штаммам вируса гриппа и вспышкам заболеваемости. На основании анализа присланного материала эксперты делают прогнозы относительно разновидностей гриппа, которые будут циркулировать в следующем эпидсезоне, а также предлагают вирусы-кандидаты в вакцинные штаммы для производителей. С учетом того, что дифференциальная диагностика гриппа от других ОРВИ затруднена, показатели иммуногенности вакцин принято оценивать по уровню специфических антител к гемагглютинину (ГА). Защитный эффект ГА-специфических антител неоднократно был продемонстрирован как у животных, так и у людей. Антитела нейтрализуют вирус гриппа, предотвращая его связывание с рецепторами, при этом уровень антител к гемагглютинину напрямую коррелирует с уровнем защищенности. При оценке потенциальной эффективности вакцины титр антител не менее чем 1:40 считают защитным. Антитела к другому изменчивому поверхностному белку вируса гриппа — нейраминидазе — не могут предотвратить инфекцию, однако играют важную роль в защите от тяжелых форм гриппа, препятствуя выходу вирусных частиц из инфицированных клеток и дальнейшему распространению вируса в организме. Гемагглютинин и нейраминидаза названы протективными белками, а вакцины, содержащие только эти очищенные белки, — субъединичными. Современные достижения вирусологии, развитие технологий фармацевтической индустрии, интеграция исследователей разных стран в сфере контроля и борьбы с гриппом позволили вывести на новый уровень разработку и производство гриппозных вакцин. Вакцина Гриппол® Нео — результат международного сотрудничества двух компаний («Солвей Биолоджикалз Б. В.» и ФК «ПЕТРОВАКС»). Эта субъединичная вакцина содержит иммуноадъювант Полиоксидоний® и антигены (гемагглютинин и нейраминидазу) европейского качества, полученные из вируса, выращенного на культуре клеток. Рост вируса для вакцины осуществляется по современной технологии с использованием клеточной линии MDCK (Madine-Darbin Canine Kidney) в бессывороточной среде и является стандартизированным закрытым процессом, исключающим возможность контаминации любыми, в том числе неизвестными агентами. Применение культур клеток для наработки вирусного материала стало уже традиционным для целого ряда вакцинных препаратов. Но только благодаря разработкам специалистов компании «Солвей Биолоджикалз» технология стала доступной и для гриппозных вакцин. В 2001 году была зарегистрирована вакцина Инфлювак ТС (Нидерланды), в 2009 году в России — Гриппол® Нео. Снижение антигенной нагрузки в вакцинирующей дозе обеспечивает максимальный профиль безопасности препарата. Антигены с адъювантом образуют комплекс, который стимулирует гуморальное и клеточное звенья иммунитета. Это приводит к образованию специфических к протективным белкам антител, отвечающих за защиту от гриппа, и повышает общую резистентность организма к инфекции. Клинические исследования безопасности и иммуногенности Гриппол® Нео проводились с участием добровольцев в высокоспециализированных исследовательских центрах по изучению вакцинных препаратов и поствакцинальных реакций. Изучение частоты местных и общих реакций, а также соматической и инфекционной заболеваемости во всех группах наблюдения, проведенное в рамках данного исследования, показало, что препараты хорошо переносятся и обладают низкой реактогенностью. Целью данной публикации является анализ результатов иммуногенности вакцины Гриппол® Нео в сравнении с коммерческим препаратом — вакциной Гриппол®. Материалы и методы Вакцины В клиническом испытании были использованы три инактивированные субъединичные вакцины, содержащие иммуноадъювант Полиоксидоний® и антигены (гемагглютинин и нейраминидазу) актуальных для эпидемического сезона 2008/2009 штаммов вируса гриппа: h2N1 A/Brisbane/59/2007; h4 N2 A/Uruguay/716/2007; B/Florida/4/2006. Два тестируемых препарата представляли собой две серии вакцины Гриппол® Нео производства ООО «ФК «ПЕТРОВАКС», содержащие по 5 либо по 10 мкг гемагглютинина каждого из трех штаммов и 500 мкг Полиоксидония®. В качестве препарата сравнения использовали коммерческую вакцину Гриппол® производства ФГУП «НПО «Микроген», содержащую по 5 мкг ГА штаммов вирусов гриппа типа А (h2N1 и h4N2), 11 мкг гемагглютинина вируса гриппа типа В, 500 мкг Полиоксидония®. Препараты, используемые в исследовании, были контролированы в ГИСК им. Л. А. Тарасевича на соответствие нормативной документации; испытуемые серии Гриппол® Нео и препарат сравнения зашифрованы специалистами ГИСКа, не принимающими участия в данном исследовании. Дешифровка была проведена после завершения клинического исследования и представления всех результатов в ГИСК. Дизайн исследования Исследования проведены в соответствии с утвержденными протоколами и согласно разрешению МЗ РФ на клинических базах ФГУ НИИ ДИ Росздрава и ГОУ ВПО СПбГМУ им. ак. И. П. Павлова в соответствии с требованиями Надлежащей клинической практики (GCP). Дизайн исследования: рандомизированное, двойное слепое, контролируемое сравнительное в параллельных группах. Вакцинация добровольцев проведена после подписания информированного согласия. Участники были отобраны в соответствии с критериями включения/исключения, определенными протоколом клинического испытания. Всего было вакцинировано 300 здоровых добровольцев в возрасте 18–55 лет (средний возраст — 24,5 ± 0,5 года). Перед прививкой все добровольцы были осмотрены врачом, было проведено измерение температуры тела, артериального давления, женщинам — тест на беременность. Методом случайного выборочного распределения было сформировано три группы по 100 человек. Вакцинацию проводили однократно в дельтовидную мышцу в объеме 0,5 мл. Постановка реакции и учет результатов Парные сыворотки добровольцев, взятые до и через 21 день после вакцинации, исследовали с помощью стандартной методики в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как описано в МУ 3.3.2 1758–03. Постановка РТГА включала следующие этапы: подготовка сывороток, определение гемагглютинирующего титра в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции. Для удаления неспецифических ингибиторов сыворотку обрабатывали RDE по методу, описанному в инструкции к препарату. В качестве рабочей дозы антигена использовалась доза 4АЕ, приготовленная из диагностикумов «Диагностикумы гриппозные для реакции торможения гемагглютинации сухие» (ФСП 42–0321–4042–03) трех штаммов, соответствующих вакцинным. Сыворотки титровали начиная с разведения 1:10. При учете результатов титр < 1:10 принимали равным 1:5, а титр > 1:1280 — равным 1:1280. Иммуногенность оценивали в соответствии с требованиями Европейского комитета к противогриппозным вакцинам (СPMP/BWP/214/96), согласно которым должен выполняться по крайней мере один из трех критериев:
Статистика Результаты исследований статистически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента. Вариационный анализ полученных результатов проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. Результаты и обсуждение Серологическое обследование с целью оценки иммунологической эффективности вакцинации проводили, сравнивая уровень антител в парных сыворотках, взятых до прививки и на 21-й день после вакцинации. Во всех экспериментальных группах в сыворотках привитых регистрировали статистически достоверное нарастание титров антител. По всем анализируемым критериям не наблюдалось статистически достоверной разницы в иммунном ответе на серии вакцины Гриппол® Нео с различными дозировками антигенов. В таблицах приведены данные, относящиеся к серии, содержащей по 5 мкг гемагглютинина каждого штамма. Подсчеты числа лиц с серопротекциями (защитными титрами антител (≥ 1:40)) показали, что в каждой группе уровень этих антител соответствует критерию CPMP (табл. 1).
Наиболее иммуногенными оказались компоненты вакцин h2N1 и B. У привитых вакциной Гриппол® Нео по 5 мкг уровень серопротекций составил 96% и 97% соответственно, у привитых вакциной Гриппол® — 96% и 98%. Число людей с защитным титром антител (сероконверсий) против штамма A/h4N2 было несколько ниже — 93% для Гриппола® Нео и 88% для Гриппола®. Достоверных различий по данному показателю между исследуемыми вакцинами и препаратом сравнения вакциной Гриппол® (p > 0,05) не выявлено. Кратность нарастания антител и доля лиц с 4-кратным и более приростом титра антител являются важными характеристиками иммунного ответа на вакцинацию, особенно у людей, ранее не встречавшихся с данными разновидностями вируса гриппа. В табл. 2 показаны результаты вакцинации серонегативных добровольцев — людей с низким (< 1:20) исходным уровнем антител. Из результатов следует, что для всех подтипов вируса гриппа наблюдалось увеличение титров антител, значительно превышающее критерии CPMP.
Для вакцин Гриппол® Нео и Гриппол® число сероконверсий к подтипу А/h2N1 составило 89,4% и 92,6%; для подтипа А/h4N2 — 77,8% и 77,4%; для типа В — 91,2% и 76,0% соответственно. Кратность прироста титра антител у серонегативных лиц составила от 7,5 до 18,5 для Гриппола® Нео и от 8,5 до 13,9 — для препарата сравнения. Известно, что человеческая популяция неоднородна по наличию антител к различным штаммам и подтипам вируса гриппа вследствие гриппозных эпидемий и предыдущих вакцинаций. Среди вакцинированных добровольцев выявлены как серонегативные, так и серопозитивные участники (исходно имевшие защитный титр). Представлялось интересным оценить эффективность иммунизации в общей популяции людей (табл. 3).
Уровень сероконверсий в целом по группам привитых для штаммов типа А составил 67–75% для вакцины Гриппол® Нео и 61–72% для вакцины сравнения. Уровень сероконверсий для штамма В составил 57% для вакцины Гриппол® Нео и 52% для Гриппола®. Отметим, что в препарате сравнения содержание антигена типа В вдвое выше (11 мкг), чем в тестируемой вакцине — Гриппол® Нео (5 мкг), однако статистически достоверных различий по иммуногенности к этому компоненту не выявлено. Выводы и заключение
В настоящее время вакцина Гриппол® Нео зарегистрирована (РУ № ЛСР-006029/09 от 23.07.2009 г.). Таким образом, семейство вакцин Гриппол® пополнилось новым полноправным членом, а профилактическая медицина обрела новый инструмент для контроля такого заболевания, как грипп. Гриппол® Нео стал первой в мире субъединичной адъювантной вакциной с клеточной технологией получения антигенов. При этом впервые вакцинация против гриппа разрешена людям с аллергией на белок куриного яйца. Исследования по расширению показаний к применению вакцины продолжаются. Е. М. Войцеховская * В. С. Вакин *, кандидат медицинских наук А. А. Васильева * Е. В. Кузнецова *, кандидат биологических наук Н. И. Лонская **, кандидат медицинских наук Г. А. Ельшина **, кандидат медицинских наук М. А. Горбунов **, доктор медицинских наук А. А. Соминина *, доктор медицинских наук Ю. А. Зайцева *** * ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург ** ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора, Москва *** ООО ФК «ПЕТРОВАКС», Москва Ключевые слова: вакцина, грипп, Гриппол® Нео, клеточная культура www.lvrach.ru титр после вакцинации - это... Что такое титр после вакцинации?1) Immunology: postvaccination titer 2) Makarov: postvaccination titer Универсальный русско-английский словарь. Академик.ру. 2011.
Смотреть что такое "титр после вакцинации" в других словарях:
universal_ru_en.academic.ru |
 г.Самара, ул. Димитрова 131 [email protected] |
 |