old.nsuem.ru

Неспецифическое действие микробных вакцин

Медицина Неспецифическое действие микробных вакцин

просмотров - 80

Мукозальные вакцины

Наряду с парентеральным введением давно возникла мысль об апликации вакцин на слизистые оболочки. Современное возрождение интереса к этой идее связано с осознанием относительной автономии мукозальной иммунной системы и тем, что парентеральная доставка антигенов не обеспечивает полноценного иммунитета слизистых оболочек (см. лекция 12). Это принципиально для инфекций, патогенез которых не зависит от внутрисосудистой инвазии и/или токсинœемии, а ограничивается

поражением в зоне входных ворот возбудителя. В таких случаях сывороточные антитела не предупреждают развития патологического процесса, так как их действие проявляется с опозданием и связано с флогогенной экссудацией плазменных белков.

Мукозальные вакцины нацелœены на индукцию опережающего (профилактического) иммунитета слизистых оболочек против инфекций респираторного, кишечного и полового трактов. Это не означает, что их действие строго регионально: реакция в одном из участков мукозального тракта находит отклик в других отделах слизистых оболочек и, кроме того, вызывает общий (системный) иммунный ответ. В этом отношении мукозальные вакцины повторяют эффект парентеральной иммунизации.

В качестве мукозальных вакцин бывают использованы те же препараты, что и для парентерального введения. Главная особенность – адъювантное сопровождение. Среди прочих (более узких) задач мукозальные адъюванты и системы доставки должны обеспечить устойчивость антигенов при апликации на слизистые оболочки (это прежде всœего относится к энтеральным вакцинам) и их проникновение в регионарную лимфоидную ткань. Кроме липосом и различного рода микрокапсул, ведутся поиски оптимальных векторных вакцин на основе рекомбинантных (трансгенных) бактерий и вирусов (см. выше). Примером специфического мукозоадгезивного адъюванта для энтеральных вакцин является В-субъединица холерного токсина. Обладая сродством к ганглиозидам, она усиливает рецепцию энтероцитами конъюгированных антигенов или содержащих ее микросфер.

Несмотря на многочисленные экспериментальные разработки внедрение в медицинскую практику мукозальных, (как и других новых) вакцин идет медленно, с большой острожностью. Единственным препаратом, доказавшим свою эффективность, остается живая пероральная вакцина против полиомиелита2.

При введении в организм вакцины вызывают не только специфические сдвиги, ᴛ.ᴇ. образование антител и Т-лимфоцитов против иммунизирующего агента. Οʜᴎ неизбежно затрагивают сферу неспецифической реактивности, что иногдасопровождается побочными реакциями, не имеющими отношения к основному эффекту. Опасения перед «вакцинальными осложненими» служат поводом (часто необоснованным) для уклонения от прививок, особенно детей из так называемых «групп риска». Это создает прослойку лиц, лишенных иммунитета против эпидемически опасных инфекций, поддерживая циркуляцию возбудителœей с угрозой новых вспышек.

Но неспецифические эффекты бывают и полезными. Убитые бактерии и их дериваты (липополисахаридные эндотоксины, производные пептидогликана и пр.) применяются в качестве биостимуляторов для повышения резистентности организма, в частности при лечении хронических инфекций, когда требуется обострить процесс, чтобы активизировать санирующие реакции воспаления и иммунитета. Иммуностимулирующие свойства вакцины БЦЖ пытались (небезуспешно) использовать для паллиативной терапии больных раком. Много лет развивалась идеология аутовакцин, которые готовили из собственных бактерий больного. Это делалось для того, чтобы сблизить вакцинные и этиологически/патогенетически значимые штаммы, добившись максимального сходства их антигенной композиции. В конце концов оказалось, что действие аутовакцин не отличается от гетерологичных препаратов (ᴛ.ᴇ. вакцин из «чужих» штаммов) и скорее всœего связано с неспецифическим эффектом.

Бактериальные препараты (корпускулярные вакцины, дериваты бактерий) широко применялись при аллергических заболеваниях. Стратегия строилась на признании аллергенных свойств у бактерий (особенно представителœей нормальной микрофлоры) и крайне важности специфического ослабления реактивности (гипосœенсибилизации) к их продуктам. Эта идеология тоже зашла в тупик, хотя лечебный эффект подобного рода «аллергенов» зафиксирован многочисленными исследованиями. Можно думать, что и здесь проявлялось неспецифическое действие вакцинных препаратов, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ затрагивало механизмы аллергического воспаления (см. лекция 9).

В последние годы интерес к неспецифическому действию микробных вакцин получил новое направление в связи с представлениями о функциональной неоднородности Т-лимфоцитов. Главная идея сводится к регуляции иммунных реакций на основе изменения баланса Th2/Th3 цитокинов (см. лекция 6). В случае если учесть, к примеру, что аллергическое воспаление (отсроченная фаза немедленных аллергических реакций) эволюционирует благодаря Th3-цитокинам, то торможение их синтеза может быть полезным при заболеваниях, основанных на данном механизме. Напротив, при аутоиммунной патологии, которая обычно прогрессирует через Th2-зависимые реакции, следует стремиться к подавлению Th2-цитокинов. И того и другого можно добиться при помощи цитокинов полярной группы или индукторов их секреции. С этой целью бывают использованы микробные продукты (в частности, вакцинные препараты), обладающие неодинаковой способностью активировать различные субпопуляции Т-лимфоцитов. Это определяет подходы к лечению заболеваний разной иммунопатогенетической ориентации.

Отсюда не столь уж абсурдны рассуждения об использовании микробных вакцин для предупреждения невынашиваемости беременности. Суть та же – стремление к оптимальному балансу в системе Th2-Th3. В данном случае речь о смещении в пользу Th3-цитокинов для снижения вероятности Th2-зависимого конфликта в системе мать-плод.

Так или иначе, но вакцины сегодня всœе чаще рассматриваются вне классических представлений о превентивном антимикробном эффекте. В подобных случаях они вписываются в контекст неинфекционной иммунологии и нацелœены на регуляцию иммунных реакций.

Тесты для самоконтроля

1. Активный естественно приобретенный иммунитет:

1. Поствакцинальный иммунитет. 2. Постинфекционный иммунитет. 3. Возникает трансплацентарным путем. 4. Воспроизводится путем введения иммуноглобулинов. 5. Неспецифический иммунитет.

(2)

2. Активный искусственно приобретенный иммунитет:

1. Поствакцинальный иммунитет. 2. Постинфекционный иммунитет. 3. Передается от матери плоду/новорожденному. 4. Воспроизводится путем введения антитоксических сывороток. 5. Специфический иммунитет.

(1,5)

3. Пассивный искусственно приобретенный иммунитет:

1. Поствакцинальный иммунитет. 2. Постинфекционный иммунитет. 3. Передается от матери плоду/новорожденному. 4. Воспроизводится путем введения иммуноглобулинов (антител). 5. Неспецифический иммунитет.

(4)

4. Пассивный естественно приобретенный иммунитет:

1. Поствакцинальный иммунитет. 2. Постинфекционный иммунитет. 3. Передается от матери плоду/новорожденному. 4. Воспроизводится путем введения иммуноглобулинов (антител). 5. Специфический иммунитет.

(3,5)

5. Термин «вакцинация» был введен в связи со специфической профилактикой

следующей инфекции:

1. Сибирская язва. 2. Бешенство. 3. Туберкулез. 4. Дифтерия. 5. Натуральная оспа. 6.

Полиомиелит. 6. Коклюш. 7. Корь. 8. Столбняк. 9. Гепатит В.

(5)

Читайте также

oplib.ru

Мукозальная вакцина для иммунотерапии заболеваний, обусловленных вирусами папилломы человека, и способ лечения с ее использованием (варианты)

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в медицине. Мукозальная вакцина содержит в эффективном количестве гибридный белок, состоящий из онкобелка Е7 вируса папилломы человека, слитого с белком теплового шока микобактерий Hsp70, хитозан в соотношении с гибридным белком 1:0,1-10 и фармакологически приемлемые для изготовления суппозиториев добавки. Мукозальную вакцину используют в способах лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека. Предложенное изобретение позволяет многократно повысить эффективность лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, значительно снизить стоимость лечения по сравнению с известными методиками лечения РШМ и РПК. Устранить нежелательные и крайне опасные для жизни пациента побочные эффекты инъекционных препаратов, например анафилактический шок, за счет местного применения. Упростить лечебный процесс - пациент может проходить курс лечения вне клиники, самостоятельно вводя препарат. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно оно относится к композиции рекомбинантных белков на основе онкобелка Е7 вируса папилломы человека, слитого с белком теплового шока микобактерий Hsp70 в сочетании с хитозаном и фармакологически приемлемыми для изготовления суппозиториев добавками. Также изобретение относится к вакцинотерапии заболеваний, обусловленных вирусами папилломы человека.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В середине 70-х годов впервые было высказано предположение о возможном участии вирусов папилломы человека (ВПЧ) в патогенезе рака шейки матки и начаты исследования по идентификации вируса в биопсийном материале. Было установлено, что в злокачественных опухолях шейки матки выявляются наиболее часто два типа вирусов - ВПЧ 16 и ВПЧ 18. А в доброкачественных поражениях присутствуют, в основном, вирусы 6 и 11 типов. При дальнейшем изучении роли ВПЧ в неопластических процессах все серотипы были разделены на три группы:

- низкая степень онкогенного риска: 6, 11, 42, 43, 44;

- средняя степень онкогенного риска: 31, 33, 51, 52, 58;

- высокая степень онкогенного риска: 16, 18, 45, 56.

В настоящее время в ряде исследований показано, что ДНК ВПЧ обнаруживается в среднем в 98,9% и 94,7% образцов остроконечных кондилом и цервикального рака соответственно. В популяции у здоровых женщин ВПЧ обнаруживаются в 35% случаев, причем 6, 11, 16 и 18 типы - только в 21,6%. Интересным для дальнейшего изучения оказался и тот факт, что большая часть ДНК ВПЧ 16 в клетках остроконечных кондилом находится в эписомальной форме, а в образцах цервикального рака - интегрирована в клеточный геном. В последние годы в связи с началом применения профилактических вакцин против ВПЧ проведено несколько крупномасштабных эпидемиологических исследований по географическому распределению различных типов ВПЧ в цервикальных пробах от пациентов с инвазивным раком шейки матки (РШМ). Оказалось, что в большинстве случаев во всем мире (65-77%) выявляются ВПЧ 16/18 типов, однако дальнейшее ранжирование типов ВПЧ имеет ярко выраженные географические особенности. Так, например, в Китае следующими по значимости являются ВПЧ 58 и 52 типов, в Африке - ВПЧ тип 45, в Центральной / Южной Америке - ВПЧ тип 31. (Bao Y., Li N., Smith J. and Qiao Y., Human papillomavirus type-distribution in the cervix of Chinese women: a meta-analysis. Int. Journal of STD & AIDS, 19, 2, 106-111; Nubia M., Xavier В., Xavier С.et al., Against which papillomavirus types shall we vaccinate and screen? The international perspective. Int. Journal of Cancer, 2004, 11, 2, 278-285; Ihekweazu С., Worldwide distribution of HPV types in women with normal cervical cytology and in women with cervical adenocarcinoma, Eurosurveillance, 2006, 11, Issue 12.)

Распространение инфекции происходит преимущественно половым путем, достигая максимума инфицирования до 30 лет. Более 50% сексуально активного населения мира в течение жизни инфицируется вирусом папилломы человека, и это является «первичным» событием в патогенезе РШМ. Большинство случаев инфицирования заканчивается спонтанным выздоровлением. Однако в некоторых случаях развивается персистирующая инфекция, способная запускать механизмы клеточной трансформации эпителиальных клеток. Так, при CIN 1 наблюдается активная репликация вируса и его бессимптомное выделение. Превращение CIN 1 в инвазивный рак происходит с большой частотой и, как правило, сопровождается интеграцией вирусной ДНК в геном клетки хозяина (Киселев В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. M.: Компания «Димитрейд График Групп®», 2004).

ВПЧ высокой степени онкогенного риска (преимущественно 16 и 18 типов) обнаруживают в 50-80% образцов умеренной и тяжелой дисплазии плоского эпителия шейки матки и в 90% инвазивного рака. Важным обстоятельством является то, что клинические проявления ВПЧ-инфекции не обнаруживаются достаточно длительное время, однако последствия персистенции вируса от этого не становятся более легкими. Развитие легкой и умеренной дисплазии в тяжелую происходит соответственно в 10 и 20% случаев. Такая статистика не является фатальной: переход одной стадии атипии эпителия в другую происходит достаточно долго, что дает большие возможности в плане диагностики и лечения. Кроме того, немаловажным является тот факт, что носительство ВПЧ не является пожизненным: по данным ВОЗ (2001 г.) при отсутствии отягощающих факторов в течение 3 лет плоскоклеточные внутриэпителиальные поражения низкой степени тяжести, содержащие ВПЧ, подвергаются регрессии

в 50-62% наблюдений. По сведениям ученых Калифорнийского университета у 70% молодых ВПЧ-инфицированных женщин ДНК ВПЧ перестает определяться на протяжении 24 месяцев. Скорость элиминации значительно снижается при инфицировании несколькими видами ВПЧ, а также - при наличии в анамнезе кондилом вульвы. В то же время среди женщин, у которых по меньшей степени 3 раза были получены положительные результаты определения ВПЧ, риск тяжелых онкологических поражений эпителия возрастал в 14 раз. Ежегодно в мире регистрируется около 500000 случаев РШМ, из которых около 50% заканчиваются летальным исходом. В Российской федерации по данным Министерства здравоохранения в 2002 было зарегистрировано 11320 случаев рака шейки матки (Молочков В.А., Киселев В.И., Рудых И.В., Щербо С.Н. Папиллома-вирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение, пособие для врачей. М.: Издательский дом «Русский врач», 2004).

Следует отметить, что в последние годы значительно увеличилось количество диагнозов рака прямой кишки, также обусловленного вирусами папилломы человека. Особенное распространение этот вид патологии получил среди мужчин с нетрадиционной сексуальной ориентацией. Отмечены случаи развития рака ротовой полости при занятии оральным сексом с партнером, инфицированным ВПЧ (News.com // в мире // 18 ноября 2004. Оральный секс приводит к заболеванию раком). В большинстве случаев онкологической патологии предшествует образование кондилом слизистой прямой кишки, которое сопровождается кровотечениями при акте дефекации, воспалительными процессами и трещинами анального отверстия.

Современные представления о механизме канцерогенеза, обусловленного ВПЧ

ВПЧ инфицирует и реплицируется в эпителии, что подтверждается обнаружением эписомального вирусного генома в клетках базального слоя эпителия. Жизненный цикл вируса тесно связан с дифференцировкой клетки-хозяина. Репликация вирусной ДНК и синтез капсидных белков вируса происходит в наиболее дифференцированных слоях эпителия, и вирус обладает целым набором механизмов, подчиняющих своим интересам жизнедеятельность инфицированной клетки. ДНК вируса кодирует синтез двух белков - Е6 и Е7, которые индуцируют переход дифференцированных клеток в S-фазу клеточного цикла. На стадии активной репродукции вируса экспрессия генов Е6 и Е7 регулируется продуктом гена Е2, являющимся репрессором транскрипции этих генов. Именно поэтому, пока вирус находится в эписомальном состоянии, наблюдаются доброкачественные процессы разрастания инфицированных тканей. Ключевым событием в малигнизации клеток является интеграция вируса в геном клеток, которая сопровождается делецией гена Е2. Это событие имеет два важных последствия:

1) в эпителиальных клетках с интегрированной формой ВПЧ регистрируется сверхэкспрессия генов Е6 и Е7, так как в процессе интеграции утрачивается ген Е2, кодирующий репрессор транскрипции этих генов,

2) любые противовирусные препараты бессильны остановить процесс опухолевой трансформации, так как инфицированные клетки не содержат вирус в традиционном понимании, и все лечебные мероприятия должны быть направлены на элиминацию клеток с интегрированной формой генома ВПЧ.

Контроль клеточного цикла и дифференцировка клеток осуществляется белками Е6 и Е7 посредством их взаимодействия и инактивации таких "ключевых" белков-регуляторов пролиферативной активности и апоптоза клеток, как р53 и белок ретинобластомы (pRB). Бесконтрольная пролиферация инфицированных клеток приводит к накоплению генетических повреждений и, в конечном счете, к малигнизации. Онкобелок Е7 использует несколько путей для регуляции клеточного цикла. Установлено, что Е7 способен образовывать стабильный комплекс с белком pRB, вызывая его деградацию, что приводит к высвобождению транскрипционного фактора E2F, который стимулирует транскрипцию генов, необходимых для репликации ДНК и S-фазы клеточного цикла. Е7 также влияет на активность целого ряда белков клеточного цикла, как А и Е циклины, cdk2 киназу и ингибиторы циклин-зависимой киназы р21 и р27 (Киселев В.И., Киселев О.И. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки: генетические и патогенетические механизмы. Цитокины и воспаления. 2003, 2, 4, 31-38; Phelps W.C., Bames J.A. and Loba D.C., Human papillomavirus: molecular targets and prospects for antiviral therapy. International Antiviral News, 1999, 7, 4-8).

Исследования на животных показывают, что гуморальный иммунитет играет определенную роль в защите от ВИЧ-инфекции. Модель вирусоподобных частиц (virus-like particles - VLP), самособирающихся из основного капсидного белка ВПЧ-L1, широко используется для изучения протективной роли вируснейтрализующих антител. Иммунизация животных VLP защищает их от экспериментальной инфекции гомологичными вирусами. Пассивный перенос сыворотки от мышей, иммунизированных VLP, другим экспериментальным животным также оказывает защитный эффект, что подтверждает протективную роль вируснейтрализующих антител (Tindle R.W., Immune evasion in human papillomavirus-associated cervical cancer. Nature Reviews, 2002, Cancer, 2, 1-7; Zhou J., Liu W.J., Peng S.W. et al. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability, J. Virol., 1999, 73, 4972-4982; Schwarts S. Regulation of human papillomavirus late gene expression, Ups. J. Med. Ski, 2000, 105, 171-192). В случае инфицирования экспериментальных иммунизированных мышей ВПЧ другого типа защитный эффект не регистрировали, что свидетельствует о специфичности наблюдаемого явления и отсутствии перекрестных реакций между различными типами ВПЧ. Более того, денатурация VLP приводила к утрате протективных эффектов, что указывает на роль интактных протективных эпитопов в индукции антителогенеза. Другой поздний ген, кодирующий минорный капсидный белок L2, также исследовался как потенциальный кандидат для профилактической вакцинации. Было установлено, что иммунизация животных гибридным рекомбинантным белком L2 индуцирует высокий титр нейтрализующих антител и защищает от экспериментальной папиллома-вирусной инфекции. Таким образом, накопившиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что капсидные белки ВПЧ являются перспективными кандидатами для создания профилактической вакцины (Nees M. et al. Papillomavirus type 16 oncogenes down-regulate expression of interferon-responsive genes and up-regulate proliferation-associated and NF-kB- responsive genes in cervical keratinocytes. J. Vir., 2001, 75, 4283-4296; Barnard P., Payne E. & McMillan N.A. The human papillomavirus E7 protein is able to inhibit the antiviral and anti-growth functions of interferon-a. Virology, 2000, 277,

411-419). Однако при использовании данных белков для терапевтической иммунизации при устоявшейся, хронической папиллома-вирусной инфекции не удалось получить сколько-нибудь значительного эффекта. Видимо, для лечебной иммунизации необходима другая стратегия, а именно - индукция антиген-специфического Т-клеточного иммунного ответа. Имеющиеся данные позволяют надеяться, что стимуляция клеточной составляющей иммунитета по отношению к неструктурным вирусным белкам может привести к регрессии развивающейся опухоли.

Наблюдения, подтверждающие обоснованность данного предположения, можно разделить на четыре группы:

1. Встречаемость ВПЧ - ассоциированных заболеваний существенно выше среди больных трансплантационных клиник (Park J.S. et al. Inactivation of interferon regulatory factor-1 tumor suppressor protein by HPV E7 oncoprotein. Implication for

the E7-medated immune evasion mechanism in cervical carcinogenesis. J. Biol. Chem 2000, 275, 6764-6769) и ВИЧ-инфицированных, т.е. в случаях с глубокими нарушениями клеточного иммунитета (Frazer I., et al. Systemic administration of bacterial products induces host protective specific immunity to an epithelial tumour antigen. J Immunol., 2000, 167, 6180-6187, Doan Т. et al. Human Papillomavirus Type 16 E7 Oncoprotein Expressed in Peripheral Epithelium Tolerizes E7-Directed Cytotoxic T-Lymphocyte Precursors Restricted through Human (and Mouse) Major Histocompatibility Complex Class I Alleles. J. Virol., 1999, 73, 6166-6170).

2. Экспериментальные животные, иммунизированные неструктурными белками ВПЧ, эффективно защищены от ВПЧ инфекции и развития неопластических процессов (Gtannini S. et al. Cytokine expression in squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix: implications for the generation of local immunosuppression. din. Exp. Immunol., 1998, 113, 183-189).

3. При спонтанной регрессии генитальных бородавок наблюдается интенсивная инфильтрация окружающих тканей CD4+ (Т-хелперы) и CD8+ (цитотоксическими) Т-клетками (Ressing M.E. et al. Human CTL epitopes encoded by human papillomavims type 16 E6 and E7 identifed through in vitro and in vivo immunogenicity studies of

HLA-A'0201-binding peptides. J. Immunol., 1995, 154, 5934-5943).

4. Кожные повреждения, ассоциированные с ВПЧ у больных, получающих иммуносупрессивную терапию, часто исчезают при отмене курса лечения (Lee. S.J. et at. Both E6 and E7 oncoproteins of human papillomavims 16 inhibit IL-18-induced IFN-y production in human peripheral blood mononuclear and NK cells. J Immunol.,

2001, 167, 497-504).

Представленные данные свидетельствуют в пользу того, что специфическая стимуляция Т-клеточного иммунитета может приводить к полной ремиссии ВПЧ-ассоциированных заболеваний. В связи с этим практическая задача при создании лечебной вакцины сводится к стимуляции Т-клеточного иммунитета по отношению к неструктурным белкам ВПЧ, таким как белки E6 и E7.

Основное требование к терапевтическим вакцинам состоит в том, что они должны стимулировать клеточную составляющую специфического иммунитета и блокировать развитие неопластических процессов. Теоретически клеточная реакция должна быть направлена на вирусные и клеточные белки, участвующие в малигнизации эпителия. Однако несмотря на интенсивные исследования довольно мало известно о клеточных мишенях при опухолевой трансформации, поэтому большинство экспериментальных вакцин направлено на продукты генов Е6 и E7 ВПЧ, роль которых в онкогенезе доказана однозначно.

Поскольку белки Е6 и E7 конститутивно экспрессируются в большинстве клеток РШМ и отсутствуют в нормальной ткани, эти вирусные онкобелки рассматриваются как наиболее перспективные мишени при разработке вакцин для терапии ВПЧ-ассоциированных опухолей (Straght S.W., Herman В. & McCance D.J. The E5 oncoprotein of human papillomavirus type 16 inhibits the acidification of endosomes in human keratinocytes. J Virol, 1995, 69, 3185-3192).

Мишенью для иммунотерапии опухолей, как правило, являются нормальные или мутантные клеточные белки, тогда как белки Е6 и E7 являются абсолютно чужеродными для иммунной системы хозяина и в силу этого должны быть весьма иммуногенными (Przepiorka D. and Srivastava P., Heat Shock Proteins - Peptide complexes as immunotherapy for human cancer. Molecular medicine today, 1998, 11, 478-484).

Следующая причина, по которой белки Е7 и Е6 рассматриваются как перспективные кандидаты для вакцинации, состоит в том, что многие опухоли в процессе иммунотерапии могут утрачивать белки-мишени, ускользая, таким образом, от иммунной атаки и сохраняя при этом свой трансформированный статус, тогда развитие РШМ однозначно обусловлено экспрессией белков Е6 и Е7 и их нейтрализация приведет к регрессии опухоли.

Разработка пептидных вакцин сдерживается тем обстоятельством, что до настоящего времени еще точно не определены эпитопы в белках Е6 и Е7, способные индуцировать цитотоксический иммунитет. Поэтому основные усилия сосредоточены на конструировании белковых вакцин с использованием рекомбинантных белков Е7 и Е6.

Последние исследования показывают, что более предпочтительной мишенью для создания вакцин является белок Е7 ВПЧ 16 и 18 типа для рака шейки матки и Е7 ВПЧ 6 типа для анальных кондилом, так как он обладает наименьшей структурной вариабельностью в различных географических изолятах ВПЧ и не имеет сплайсинг-вариантов (Swan D.C., Rajeevan M., Tortolero-Luna G., et al. Human papillomavirus type 16 E2 and E6/E7 variants, Gynecol. Oncol. 2005, 96, (3) 695-700).

Показано, что рекомбинантный белок Е7 ВПЧ 16 типа способен индуцировать цитотоксический иммунитет, и инъекция этого белка в сочетании с различными адъювантами усиливает цитотоксическую реакцию.

В последние годы особенно популярна новая стратегия повышения иммуногенности Е7, состоящая в конструировании гибридных белков. В частности, были изучены иммунологические свойства гибридного белка, содержащего полную последовательность белка теплового шока Hsp70 и белка Е7 ВПЧ. Иммуногенность и протективность такой конструкции была существенно выше, вероятно за счет того, что Hsp 70 M. tuberculosis обеспечивает эффективную презентацию антигенов (Becker Т., Harti F., and Wieland F., CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70 - peptide complexes, J.Cell Biology, 2002, 158, 1277-1285).

Известно, что Е7 синтезируется в малых количествах на репродуктивной фазе жизненного цикла ВПЧ. Однако его синтез значительно возрастает после интеграции вирусной ДНК в клеточный геном, так как этот процесс, как правило, сопровождается утратой гена E2, кодирующего репрессор гена Е7. Несмотря на это в организме не наблюдается индукция специфического клеточного иммунитета в отношении белка Е7. Некоторые экспериментальные модели позволяют пролить свет на удивительную способность онкобелка Е7 индуцировать толерантность.

Если кожный трансплантат от трансгенной мыши, синтезирующий Е7 в эпителиальных клетках, пересадить генетически родственной мыши, то ожидаемое отторжение трансплантата не происходит. Если же мыши ввести стимулирующие образования противовоспалительных цитокинов (убитые бактерии или эндотоксины), то наступает быстрое отторжение трансплантата. Однако отторжение трансплантата на фоне введения индукторов цитокинов происходит только в период приживления трансплантата, а повторная пересадка трансплантата той же мыши приводит к отторжению без дополнительной индукции цитокинов. Высказываются разные предположения о механизмах этого явления, однако все они сходятся в одном - антигенпрезентирующие клетки, поглощающие Е7 в зоне цервикального канала, по каким-то причинам не могут пройти все необходимые этапы созревания, мигрировать в лимфатические узлы и индуцировать Т-клеточный иммунный ответ в отношении этого белка без дополнительной стимуляции цитокинового каскада (Gross G., Joblonska S., Pfister H. Genital papillomavirus infections, 1989; Frazer I. et al. Systemic administration of bacterial products induces host protective specific immunity to an epithelial tumour antigen, JImmunol., 2001, 167, 6180-6187).

Постоянный синтез онкобелков необходим для поддержания опухолевого фенотипа клеток. Очевидно, что появление в организме клеток, несущих чужеродные антигены (Е6 или Е7), должно индуцировать соответствующие иммунные реакции. Однако больные с цервикальными карциномами имеют очень низкий уровень Т-клеточного иммунитета в отношении Е6 и Е7.

При вакцинации этими белками также не наблюдается выраженной реакции несмотря на хорошие характеристики иммунного статуса. Эти наблюдения, а также эксперименты на животных показывают, что онкобелок Е7, синтезирующийся в эпителиальных клетках, способен «ускользать» или даже супрессировать иммунные реакции в отношении себя.

При создании любой противоопухолевой вакцины необходимо решить несколько принципиальных задач. Во-первых, определить мишень, против которой необходимо индуцировать иммунные реакции организма. В случае ВПЧ инфекции по общему мнению такой мишенью является белок Е7 (Киселев В.И., Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. - М.: Компания «Димитрейд График Групп®», 2004).

Не менее важной задачей является выбор адъюванта для индукции устойчивого протективного иммунитета и способа введения вакцинного препарата. Последнему обстоятельству уделяется большое внимание, так как оказалось, что от способа введения вакцины существенно зависит ее эффективность. Как уже упоминалось, ВПЧ-инфекции поражают слизистые как в случае рака шейки матки, так и при РРП и раке прямой кишки. Однако разработанные к настоящему времени вакцинные препараты предназначены для подкожного введения, то есть нацелены на специфическую стимуляцию системного иммунитета и игнорируют мукозальные иммунные реакции (Патент US 6338952 B1, 2002. Stress proteins and uses therefore; Патент РФ №2229307, Пальцев М.А., Северин Е.С., Киселев О.И., Киселев В.И., Свешников П.Г. Композиция рекомбинантных белков, способ получения такой композиции, фармацевтический набор реагентов для иммунотерапии и профилактической вакцинации опухолевых заболеваний аногенитальной сферы, способ иммунотерапии и профилактической вакцинации на его основе). На основе американского патента компания "Nventa" разрабатывает инъекционную форму вакцинного препарата, содержащего белок Е7, «слитый» с белком теплового шока М tuberculosis с молекулярной массой 65 kDa. С нашей точки зрения существенным недостатком данной конструкции является выбор белка 65 kDa, так как имеются убедительные данные о возможности индукции аутоиммунных реакций у человека при введении этого белка. Кроме того, данный белок теплового шока уступает по своим адъювантным свойствам белку Hsp70 М tuberculosis (Zugel U. and Kaufmann S., Role of heat shock protein in protection from and pathogenesis of infectious deseases, Clinical microbiology reviews, 1999, 12, 1, 19-39).

В патенте РФ №2229307 описана разработка вакцины на основе гибридных белков Е7 и Hsp70 М tuberculosis. Авторы описывают инъекционную лекарственную форму, с помощью которой удается добиться регрессии опухолей, индуцированных вирусом, на экспериментальных моделях с перевиваемыми опухолями. Продемонстрированная эффективность вакцинации на этих моделях подтверждает правильность выбора белка Е7 как молекулярной мишени, против которой индуцируются иммунные реакции. Однако при цервикальных дисплазиях, развивающихся у женщин вследствие хронической папиллома-вирусной инфекции шейки матки, индукция системного иммунитета не может гарантировать регрессию процессов малигнизации, так как шейка матки обладает определенной обособленностью от системного иммунитета в регуляции местных иммунологических реакции. В развитии анальных кондилом белок Е7 также играет основную роль в процессах малигнизации и подавлении местных иммунологических реакций. Поэтому мукозальная аппликация вакцины должна приводить к нейтрализации белка Е7 и индуцировать регрессию патологических процессов. Кроме того, в настоящее время становится очевидным, что добиться устойчивого протективного иммунитета с помощью рекомбинантных вакцин можно только при многократной иммунизации. Это создает значительные организационные трудности, так как пациенту необходимо многократно посещать клинику для проведения вакцинации. В случае вагинальной вакцинации пациент может делать это самостоятельно. Другая проблема, связанная с инъекционной формой вакцинации, состоит в том, что при повторном внутримышечном введении чужеродного белка высока вероятность анафилактического шока, что исключается при вагинальном или ректальном способе введения препарата.

Наконец, еще одно достоинство мукозальных вакцин состоит в преимущественной индукции местного мукозального иммунитета, что и требуется при патологиях, поражающих слизистые, как в случае с папиллома-вирусной инфекцией.

В качестве лекарственной формы для мукозальной аппликации вакцин можно рассматривать суппозитории или "спреи", которые позволяют наносить на слизистую вакцинный препарат в виде лиофилизированного порошка.

Раскрытие настоящего изобретения

Авторы предложенного изобретения на основе многолетних исследований папилломатоза пришли к выводу, что оптимальная вакцина для терапии заболеваний, ассоциированных с вирусами папилломы человека, должна отвечать следующим требованиям:

1. Способ введения должен предусматривать стимуляцию местного адаптивного и врожденного иммунитета, а именно: в случае РШМ - способ введения вагинальный; в случае рака прямой кишки - способ введения ректальный.

2. С учетом низкой иммуногенности белка Е7 в составе рекомбинантного белка, являющегося действующим веществом вакцинного препарата, должны присутствовать аминокислотные последовательности белков, обладающих иммуномодуляторным действием, на образование цитокинов и улучшающих презентацию антигена Е7.

3. Лекарственная форма вакцинного препарата должна содержать ингредиенты, повышающие адгезию на слизистых и сродство белковых компонентов вакцины к антиген-презентирующим клеткам.

С целью решения поставленной задачи в настоящей работе были разработаны две лекарственные формы вакцины для иммунотерапии ВПЧ-ассоциированных патологий. Так, для терапии заболеваний аногенитальной сферы разработаны мукозальные вакцины в виде суппозиториев.

Для терапии рака шейки матки были разработаны суппозитории, содержащие в качестве основных антигенов гибридные белки Е7 тип 16 или тип 18, слитые с Hsp70 М tuberculosis. Гибридный белок представляет собой единую полипептидную цепь, состоящую из первого белка - Е7 ВПЧ типа 16 или 18. Как уже установлено в настоящее время, онкобелок Е7 является основным индуктором процессов малигнизации эпителиальных клеток, инфицированных вирусами папилломы человека (Yin E.K. and Park J.S., The role of HPV E6 and Е7 oncoproteins in HPV-associated cervical carcinogenesis, Cancer Res. Treat., 2005, 37, 6, 319-324). Кроме онкогенного потенциала белок Е7 обладает выраженными иммуносупрессивными свойствами. Именно благодаря белку Е7 трансформированным клеткам удается "ускользать" от иммунных реакций организма (Kanoda S., Fahey L.M. and Kast W.M., Mechanism used by papillomaviruses to escape the host immune response. Current Cancer Drug Targets, 2007, 7,

79-89). Именно по этим причинам белок Е7 является оптимальной мишенью для иммунотерапии. Другая часть этого белка представлена белком теплового шока из М tuberculosis, обладающим высоким сродством к антиген-презентирующим клеткам и являющимся мощным индуктором синтеза цитокинов (Przepiorka D. and Srivastava P., Heat Shock Proteins - peptide complexes as immunotherapy for human cancer. Molecular medicine today, 1998, 478-484; Becker Т., Hard F.LL, and Wieland F., CD40, an extractllular receptor for binding and uptake of Hsp70 - peptide complexes. The Journal of cell biology, 2002, 158, 7, 1277-1285; Srivastava P., Interaction of Heat Shock Proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses, Annu. Rev. Immunology, 2002, 20, 395-425; Lachmann H.J., Strangeways L., Vyakarmam A and Evans G. Raising antibodies by coupling peptides PPD and immunizing BCG-sensitized animals. Ciba Found. Symp., 1986, 119, 25-27; Del Giudici G. Hsp70: a carrier molecule with built-in adjuvanticity, Experimentia, 1994, 50, 1061-1066).

В случае рака прямой кишки целесообразно использовать в качестве антигена белок Е7 тип 6, который чаще других типов ВПЧ встречается при поражении слизистой прямой кишки.

Проведенные нами экспериментальные исследования иммуногенности гибридных белков при их аппликации на слизистые показало, что в изолированном виде эти белки не способны индуцировать выраженный протективный иммунитет в отношении белков Е7. Нами было сделано предположение, что причина низкой иммуногенности полипептидов состоит в их неспособности сорбироваться на эпителии слизистых, вследствие чего они могут подвергаться быстрой протеолитической деградации. Для решения этой проблемы было решено использовать комплексы белков с хитозаном. При экспериментальной проверке этого предположения оказалось, что комплекс гибридных белков с хитозаном, обладающим выраженным мукоадгезивным свойством и способствующим активной сорбции антигенов на клеточной поверхности, эффективно индуцирует как гуморальную, так и клеточную составляющую иммунитета в отношении белков Е7.

Исходя из этого в состав вакцин в качестве адгезивного средства, способствующего проникновению антигенов через слизистые, и сильного стимулятора неспецифических иммунных реакций включен хитозан в соотношении белок:

хитозан 1-1 до 1-10. Оптимальное соотношение белка и хитозана в составе лекарственной формы было исследовано экспериментально. Установлено, что максимальный эффект в индукции иммунологических реакций в отношении антигенных детерминант белков наблюдался при использовании соотношения в диапазоне 1-1 до 1-10. При уменьшении или увеличении концентрации хитозана по отношению к фиксированной дозировке белка наблюдалось снижение эффективности индукции иммунологических реакций.

Для изготовления суппозиториев использовались следующие фармакологически приемлемые добавки: Витепсол, масло какао или твердый жир типа А - в качестве липофильной основы, полиэтиленгликоли различной молекулярной массы - в качестве гидрофильной основы, Нипагин, нипазол или аминогликозиды - в качестве антимикробного средств, янтарная кислота и бензоат натрия - в качестве стабилизаторов или консервантов, мертиолят и тиомерсал в качестве стабилизаторов и антимикробных средств (патент RU 2224542 С2, А61К 39/116, 9/02, А61Р 13/00; постановление правительства РФ №885 от 02.08.1999 г.; патент RU 2150268, А61К 9/02, А61К 35/74, А61Р 15/02; «Мертиолят и вакцинация против гепатита В», журнал «Медицина для всех», №1, 2001; Patrizi A., Rizzoli L., Vincenzi С. et al. Sensirization to thimerosal in atopic children. Contact Dermatitis, 1999, 40(2), 974-979).

Настоящее изобретение относится также к способам лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, предусматривающим местное применение мукозальной вакцины. Как вариант для лечения дисплазии шейки матки, вызванной вирусом папилломы человека, используется гибридный белок Е7

тип 16-Hsp70 или Е7 тип 18-Hsp70 в сочетании с хитозаном в соотношении 1:0,1-10 и фармакологически приемлемыми добавками. Изготовленный суппозиторий вводят интравагинально. В зависимости от стадий заболевания суппозитории назначают 2-4 раза с интервалом в неделю при легкой дисплазии шейки матки и 4-8 раз с интервалом в одну неделю с дисплазиями 2-й и 3-й степени. Для лечения анальной кондиломы используется гибридный белок Е7 тип 16-Hsp70 или Е7 тип 6-Hsp70 в сочетании с хитозаном в соотношении 1:0,1-10 и фармакологически приемлемыми добавками. Изготовленный суппозиторий вводят ректально. Суппозитории назначают на ночь с периодичностью раз неделю. Максимальный клинический эффект достигается при назначении 4-8 суппозиториев.

Региональные варианты вагинальных суппозиториев для лечения РШМ

С учетом особенностей географического распределения и для достижения максимальной эффективности региональные варианты для лечения РШМ должны содержать следующие комбинации рекомбинантных гибридных белков Е7 Hsp70 в составе вагинального суппозитория:

1. Глобальная пентавалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е758, Е731, Е745, слитых с Hsp70.

2. Китайская тетравалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е758, Е752, слитых с Hsp70.

3. Латиноамериканская тривалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е731, слитых с Hsp70.

4. Африканская тривалентная вакцина на основе Е716, Е718, Е745, слитых с Hsp70.

5. Для остального мира (Европа, Северная Америка, Австралия) бивалентный вариант на основе Е716, Е718, слитых с Hsp70.

Таким образом, предложенное изобретение позволяет многократно повысить эффективность лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека. Полученный эффект достигается за счет преимущественной индукции местных иммунологических реакций вследствии мукозальной аппликации рекомбинантных белков в комплексе с хитозаном. Именно это сочетание активных компонентов вакцины обеспечивает их высокое сродство к эпителиальным клеткам слизистых, инфицированных ВПЧ, активное распознавание антигенов иммунной системой и, как следствие, индукцию местного иммунитета в отношении белков Е7, играющих ключевую роль в развитии патологических процессов. Использование предложенной мукозальной вакцины позволяет значительно снизить стоимость лечения по сравнению с известными методиками лечения РШМ и РПК. Предложенная вакцина предназначена для местного применения, что позволяет устранить нежелательные и крайне опасные для жизни пациента побочные эффекты инъекционных препаратов, например анафилактический шок. Предложенный метод терапии значительно упрощает лечебный процесс - пациент может проходить курс лечения вне клиники, самостоятельно вводя препарат.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами:

Фигура 1. Динамика сывороточного IgG иммунного ответа при разных способах иммунизации мышей РГБ E76-Hsp70.

Фигура 2. Величины мукозального нормированного IgA антительного ответа при интраназальной и подкожной иммунизации мышей РГБ E76-Hsp70.

Фигура 3. Уровень секреции IFN-gamma(1) и IL-4(2) лимфоцитами из паховых лимфоузлов (А) и селезенки (Б), стимулированными в культуре смесью рекомбинантных белков Е716 и Е718.

Фигура 4. Уровень секреции IFN-gamma(1) и IL-4(2) лимфоцитами из паховых лимфоузлов, стимулированными в культуре смесью рекомбинантных белков Е716 и Е76.

Осуществление настоящего изобретения

Пример 1

Приготовление вакцинных препаратов на основе рекомбинантных белков для мукозального применения с хитозаном

Рекомбинантные гибридные белки E716-Hsp70 (SEQ ID NO:2), E718-Hsp70 (SEQ ID NO:4), E76-Hsp70 (SEQ ID NO:6) очищали из телец включения путем солюбилизации в 8М мочевине с последующей металлохелатной и ионообменной хроматографией до гомогенного состояния. Степень чистоты белка контролировали при помощи электрофореза в 10% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, концентрацию белка определяли по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Перед приготовлением вакцинного препарата рекомбинантный гибридный белок (РГБ) подвергали диализу для удаления консервантов и стабилизаторов против фосфатно-солевого буферного раствора (PBS, рН 7.2), разбавляли или концентрировали до необходимой концентрации и проводили стерилизующую фильтрацию. После этих процедур растворы рекомбинантных белков смешивали с раствором хитозана в различных пропорциях и использовали для изготовления суппозиториев.

Пример 2

Иммунизация мышей и взятие проб

Использовали взрослых самок мышей (возраст 6-8 недель) линии Balb/c (Питомник РАМН «Столбовая») в количестве 5 штук на группу. Иммунизацию производили трижды с интервалами в 4 недели (0-28-56 день). При проведении интраназальной иммунизации мышам вводили 20 мкл препарата РГБ с хитозаном (по 10 мкл в каждую ноздрю) при помощи микропипетки под галотановым наркозом. Для вагинальной и ректальной иммунизации с помощью микропипетки вводили 10 мкг белка в комплексе с хитозаном в объеме 20 мкл. Подкожную иммунизацию проводили в холку мышей путем инъекции 200 мкл суспензии РГБ с Alhydrogel. (Для подкожной (s.c) вакцинации препараты РГБ адсорбировали на 0.5% (вес/вес) геле алюминия гидроксида (Alhydrogel, Brenntag Biosector, Дания) в течение ночи.) В обоих случаях доза РГБ на каждую иммунизацию составляла 10 мкг белка на одну мышь. Контрольные группы мышей были иммунизированы аналогичным образом с использованием 0.5% (вес/объем) раствора хитозана и 0.5% (вес/вес) раствора Alhydrogel для интраназального и подкожного способа введения соответственно.

Пробы крови для определения специфических IgG брали из ретроорбитальной вены каждой мыши при помощи пастеровской пипетки в объеме 0.1 мл через 10 дней после первой, второй и третьей иммунизации. После ретракции сгустка сыворотку отделяли низкоскоростным центрифугированием и хранили при температуре -20°С до исследования в ИФА.

Носоглоточные смывы для определения специфичных IgA получали через 14 дней после третьей иммунизации. С этой целью мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации, декапитировали и промывали носоглотку со стороны трахеи при помощи 0.5 мл PBS. Носоглоточные смывы хранили при температуре -20°С до исследования в ИФА. Для изучения Т-клеточного иммунного ответа на рекомбинантные белки и пептидные эпитопы мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 14 дней после третьей иммунизации и асептически извлекали легкие, селезенку и лимфатические узлы средостения. Культуры лимфоцитов получали путем аккуратного механического измельчения тканей, лизиса эритроцитов и трехкратной отмывки клеток низкоскоростным центрифугированием в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки. 20 мМ L-глутамина и антибиотиков.

Пример 3

Сравнение специфического IgG и IgA антительного иммунного ответа при интраназальной и подкожной иммунизации РГБ E76-Hsp70

Мышей иммунизировали РГБ E76-Hsp70 интраназально и подкожно в соответствии с протоколом и дозировкой, описанными в примере №3. Среднегеометрические титры (СГТ) IgG и IgA антител, специфичных к рекомбинантному белку Е76, в сыворотках и носоглоточных смывах, полученных согласно процедуре из примера №2, определяли при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). Для определения сывороточных IgG на 96-луночном планшете иммобилизовали рекомбинантный белок Е76 из раствора с концентрацией 5 мкг/мл в PBS в течение ночи, проводили титрование мышиных сывороток путем трехкратных последовательных разбавлений и вносили пероксидазный конъюгат козьих антител против IgG (Н) мыши. В качестве субстрата использовали ТМБ, оптическую плотность (OD) регистрировали через 15 мин при длине волны 450 нм. Титр специфических IgG антител для каждой сыворотки определяли по конечной точке, которая соответствовала разведению сыворотки с OD>0.2. Результаты приведены на фигуре 1.

Фигура 1 отображает динамику сывороточного IgG иммунного ответа при разных способах иммунизации мышей РГБ E76-Hsp70:

Группа 1 - E76-Hsp70+хитозан, интраназально;

Группа 2 (контроль) - хитозан, интраназально;

Группа 3 (контроль) - гидроксид алюминия, подкожно;

Группа 4 - Е76-Нsр70+гидроксид алюминия, подкожно. По оси ординат отложен логарифм среднего геометрического титра IgG антител.

Для определения титра IgA в носоглоточных смывах использовали ИФА, аналогичный описанному выше, однако вместо анти-IgG(H) конъюгата применяли пероксидазный конъюгат козьих антител против IgA (H) мыши. Конечную точку титрования для каждого смыва определяли как наивысшее разведение образца, при котором OD>0.1. Для минимизации вариаций, связанных с процедурой получения носоглоточных смывов, в каждом образце определяли общее содержание IgA при помощи коммерческого ИФА набора. В конечном итоге величину мукозального IgA иммунного ответа выражали как отношение титра специфических к Е76 IgA антител к общему содержанию IgA (выраженному в микрограммах) в одном и том же образце. Результаты приведены на фигуре 2.

Фигура 2 показывает величину мукозального нормированного IgA антительного ответа при интраназальной и подкожной иммунизации мышей РГБ E76-Hsp70.

Группа 1 - E76-Hsp70+хитозан, интраназально;

Группа 2 (контроль) - хитозан, интраназально;

Группа 3 (контроль) - гидроксид алюминия, подкожно;

Группа 4 - E76-Hsp70+гидроксид алюминия, подкожно.

Пример 4

Сравнение специфического Т-клеточного ответа при интравагинальной и подкожной иммунизации смесью РГБ E716-Hsp70 и E718-Hsp70

Использовали взрослых самок мышей (возраст 8-10 недель) линии Balb/c в количестве 5 штук на группу. Иммунизацию проводили 3 раза с интервалом 10 дней по схеме: 0-10-20 дней. Для интравагинальной иммунизации (i.vag.) мышам вводили 20 мкг смеси РГБ по 10 мкг E716-Hsp70 и E718-Hsp70 соответственно в 16 мкл 0.5% (вес/объем) раствора хитозана (Chitosan, Selectchemie AG, Швейцария) при помощи микропипетки во влагалище. Подкожную иммунизацию (s.c.) проводили в холку мышей путем инъекции 200 мкл суспензии смеси РГБ (20 мкг) с 0.5% (вес/вес) гелем алюминия гидроксида (Alhydrogel, Brenntag Biosector, Дания). Контрольные группы мышей были иммунизированы аналогичным образом с использованием 0.5% (вес/объем) раствора хитозана и 0.5% (вес/вес) раствора Alhydrogel для интравагинального и подкожного способа введения соответственно. Через 14 дней после третьей иммунизации мышей умерщвляли и асептически извлекали селезенку и паховые лимфоузлы. Культуры лимфоцитов получали путем аккуратного механического измельчения тканей, лизиса эритроцитов и трехкратной отмывки клеток низкоскоростным центрифугированием в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, 20 мМ L-глутамина и антибиотиков. Культуры лимфоцитов, полученные из селезенки и паховых лимфоузлов мышей, иммунизированных смесью РГБ E716-Hsp70 и E718-Hsp70 и контрольных групп, исследовали на предмет секреции интерферона гамма (IFN-gamma) и интерлейкина 4 (IL-4) после стимуляции рекомбинантными белками E716-Hsp70 и E718-Hsp70 при помощи наборов ELISPOT (BD Biosciences, Oxford, Великобритания). Данные приведены на фигуре 3.

Фигура 3 отражает уровень секреции IFN-gamma(1) и IL-4(2) лимфоцитами из паховых лимфоузлов (А) и селезенки (Б), стимулированными в культуре смесью рекомбинантных белков Е716 и Е718. Мышей иммунизировали:

Серые столбцы - Е716-НSР70+Е718-НSР70+хитозан, интравагинально;

Черные столбцы - хитозан, интравагинально;

Белые столбцы - гидроксид алюминия, подкожно;

Штрихованные столбцы - Е716-НSР70+Е718-НSР-70+гидроксид алюминия, подкожно. По оси ординат отложено количество цитокин-секретирующих лимфоцитов на 1 млн клеток.

Пример 5

Сравнение специфического Т-клеточного ответа при ректальной и подкожной иммунизации смесью РГБ E716-Hsp70 и E76-Hsp70.

Использовали взрослых самок мышей (возраст 8-10 недель) линии Balb/c в количестве 5 штук на группу. Иммунизацию проводили 3 раза с интервалом 10 дней по схеме: 0-10-20 дней. Для ректальной иммунизации (i.R.) мышам вводили 20 мкг смеси РГБ по 10 мкг E716-Hsp70 и E76-Hsp70 соответственно в 16 мкл 0.5% (вес/объем) раствора хитозана (Chitosan, Selectchemie AG, Швейцария) при помощи микропипетки в прямую кишку. Подкожную иммунизацию (s.c.) проводили в холку мышей путем инъекции 200 мкл суспензии смеси РГБ (20 мкг) с 0.5% (вес/вес) гелем алюминия гидроксида (Alhydrogel, Brenntag Biosector, Дания). Контрольные группы мышей были иммунизированы аналогичным образом с использованием 0.5% (вес/объем) раствора хитозана и 0.5% (вес/вес) раствора Alhydrogel для ректального и подкожного способа введения соответственно.

Через 14 дней после третьей иммунизации мышей умерщвляли и асептически извлекали паховые лимфоузлы. Культуры лимфоцитов получали путем аккуратного механического измельчения тканей, лизиса эритроцитов и трехкратной отмывки клеток низкоскоростным центрифугированием в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, 20 мМ L-глутамина и антибиотиков. Культуры лимфоцитов, полученные из паховых лимфоузлов мышей, иммунизированных смесью

РГБ E716-Hsp70 и E76-Hsp70 и контрольных групп, исследовали на предмет секреции интерферона гамма (IFN-gamma) и интерлейкина 4 (IL-4) после стимуляции рекомбинантными белками E716-Hsp70 и E76-Hsp70 при помощи наборов ELISPOT (BD Biosciences, Oxford, Великобритания). Данные приведены на фигуре 4.

Фигура 4 отражает уровень секреции IFN-gamma(l) и IL-4(2) лимфоцитами из паховых лимфоузлов, стимулированными в культуре смесью рекомбинантных белков Е716 и Е76. Мышей иммунизировали:

Серые столбцы - Е716-НSР70+Е76-НSР70+хитозан, ректально;

Черные столбцы - хитозан, ректально;

Белые столбцы - гидроксид алюминия, подкожно;

Штрихованные столбцы - Е716-НSР70+Е76-НSР-70+гидроксид алюминия, подкожно. По оси ординат отложено количество цитокин-секретирующих лимфоцитов на 1 млн клеток.

Пример 6

Адъювантное действие Hsp70 M tuberculosis на клетки иммунной системы in vitro

Незрелые дендритные клетки (ДК) получали путем перфузии полых костей задних конечностей мышей линии СВА при помощи стерильного изотонического раствора по стандартной методике. Клетки промывали трижды и культивировали в матрицах с добавлением термоинактивированной фетальной сыворотки КРС в среде RPMI 1640 (150000 клеток/мл) в течение 48 часов без стимуляции, а также в присутствии Hsp70 в концентрации 25 мкг/мл. Полученные в результате центрифугирования культуральные жидкости анализировали на предмет продукции мышиных цитокинов при помощи иммуноферментных наборов фирмы R&D Systems (США) Экспрессию дифференцировочных маркеров ДК исследовали методом проточной цитофлюорометрии с использованием моноклональных антител производства фирмы R&D Systems (США). Результаты определения продукции цитокинов (условные единицы) и дифференцировочных маркеров ДК (% клеток) приведены в таблице 1:

Ваша корзина В корзине 0 товаров Заказать Очистить Каталог товаров Масла REDLINE Масла MOTUL AVS продукция

ГлавнаяВакциныМукозальные вакцины Эпидемиологическая безопасность и прикладная вакцинология (стр. 1 из 2). Мукозальные вакцины Мукозальные вакцины Разработка энтеральных вакцин идет по трем направлениям: использование per os обычных вакцин, применяемых парентерально, конструирование специальных вакцин и использование адъювантов или носителей. Одним из подходов создания новых вакцин заключается в разработке средств, препятствующих колонизации возбудителей инфекционных заболеваний на поверхности слизистых оболочек. Основу таких вакцин может составить белок-адгезин, который находится на концахпилей, специальных волосков, с помощью которых бактерии прикрепляются к поверхности слизистой. Введение такого адгезина сопровождаетсяобразованием антител, которые препятствуют колонизации бактерий и развитию инфекционного процесса. Такой же эффект наблюдается при введении готовых антител. Микрокапсулированные вакцины Для получения таких вакцин используются биодеградирующие микросферы, которые с одной стороны предохраняют антиген от вредного влияния окружающей среды, а с другой стороны распадаются и освобождают антиген в заданное время. Микрокапсулы состоят из нетоксичных неантигенных полимеров лактида или гликолида или их сополимеров. Микросферы могут быть разной величины, максимальный диаметр обычно не превышает 10микр. Вакцины можно вводить любым способом (парентерально, орально, интраназально и пр.). БАКТЕРИОФАГИ Бактериофаги – вирусы, инфицирующие бактерии. По морфологии выделяют 5 основных типов бактериофагов. Наиболее изучены из них Т-(типовые)-четные фаги E.coli, состоящие из следующих компонентов: (1) головки, содержащей спирально упакованную ДНК, и (2) хвоста. Хвост, или отросток, Т-фагов включает полый стержень и сократительный чехол. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью фибриллами. Взаимодействие бактериофагов с микробной клеткой включает несколько этапов: адсорбция на бактериальной клетке, внедрение вирусной ДНК (инъекция фага), репродукция фага и выход дочерних популяций. Взаимодействие бактериофагов с клеткой строго специфично. В связи с этим выделяют: Видовые бактериофаги, способные поражать бактерии одного вида. Типовые бактериофаги, поражающие только определенный тип бактерий внутри определенного вида. Специфичность бактериофагов объясняется рецепторными взаимодействиями с инфицируемыми клетками. Поскольку бактерии одного вида часто различаются по набору рецепторов для определенных вирусов, то их разделяют на фаготипы (фаговары). Видовые бактериофаги используются для фагоидентификации (в объеме микробиологического метода диагностики заболеваний), то есть определения вида микроорганизма с помощью бактериофагов. (Метод «дорожки»: на чашку Петри методом газона засевается культура микроорганизма, взятого от больного. Туда же капается препарат бактериофага, чашка наклоняется и капле дается возможность полностью пересечь диаметр чашки. После этого чашка помещается в термостат, и через опреледенное время смотрят результат. Он считается положительным, если на месте движения капли отсутствует рост культуры, т.е. вид известного бактериофага соответствует виду возбудителя взятого в исследуемом материале от больного). Типовые бактериофаги используются для фаготипирования (в объеме микробиологического метода диагностики заболеваний), то есть определения источника инфекции на основании типа бактериофага. (Метод фаготипирования: на чашку Петри методом газона засевается культура микроорганизма, взятого из исследуемого материала больного. Крышка чашки Петри расчерчивается на количество квадратов, соответствующее количеству типов бактериофага. В каждый квадрат помещается капля бактериофага определенного типа. Чашка ставится в термостат. Результат учитывается по отсутствию роста на месте капли в квадрате, соответствующем определенному типу бактериофага). Кроме того, реакция с бактериофагами может ставиться в направлении фагоиндикации для обнаружения искомого вида микроорганизмов, чувствительных к данному фагу, непосредственно в исследуемом материале. Реакция считается положительной когда поместив в исследуемый материал индикаторный бактериофаг с определенным титром мы наблюдаем, через определенное время, нарастание титра бактериофага. С терапевтической целью используются лечебные бактериофаги для лечения заболеваний кожи и желудочно–кишечного тракта. В настоящее время, например, нередко применяют дизентерийные, сальмонеллезные, стафилококковые и другие препараты бактериофагов для борьбы с соответствующими инфекциями. Тесты для контроля знаний: Специфические цитотоксические реакции в организме осуществляют: А) В-лимфоциты Б) Т-хелперы II типа В) CD8+ клетки * Г) макрофаги Д) естественные килеры Распознающий специфический рецептор к антигену на своей поверхности не сут: А) клетки Лангерганса Б) тимоциты В) CD4+ клетки * Г) СD16+ клетки Д) эозинофилы Клеточный иммунный ответ опосредуется: А) В-лимфоцитами Б) Т-лимфоцитами * В) одновременно Т- и В-лимфоцитами Г) эндотелиальными клетками Д) макрофагами Гуморальный иммунный ответ: А) завершается продукцией антител дифференцированными В-лимфоцитами * Б) осуществляется с участием только Т-лимфоцитов В) требует презентации антигена клетками Лангерганса Г) включает в число элиминирующих механизмов цитотоксическое поврежде- ние клеток, несущих комплекс «HLA-D – антиген» Д) осуществляется с участием только В-лимфоцитов и макрофагов Первичные органы иммунной системы включают: А) тимус и печень Б) селезенку и лимфатические узлы В) бурсазависимые зоны и вилочковую железу * Г) костный мозг и кишечник Д) миндалины и тимус Молекулы, входящие в антигенраспознающий комплекс В-лимфоцитов, вклю- чают: А) HLA-А и СD3 Б) IgD и HLA-D * В) TCR и CD4 Г) CD19 и IgD Д) HLA-C и IgG Естественные киллеры: А) распознают антиген в комплексе с молекулами HLA II класса Б) распознают антиген в комплексе с молекулами HLA II класса В) распознают антиген только на поверхности макрофага Г) распознают антиген, не связанный с молекулами главного комплекса гисто- Совместимости * Д) участвуют в реакциях гуморального иммунного ответа Макрофаги: А) секретируют иммуноглобулины Б) являются презентирующими клетками при гиперчувствительности замедлен- ного типа В) несут на своей поверхности HLA-молекулы I класса Г) являются иммунокомпетентными клетками Д) являются презентирующими клетками гуморального иммунного ответа * Функции IgM включают: А) осуществление вторичного иммунного ответа Б) активацию системы комплемента * В) обеспечение плацентарного иммунитета новорожденных Г) участие в аллергических реакция немедленного типа Д) осуществление секреторного иммунного ответа IgE: А) в составе иммунных комплексов способствуют фагоцитозу антигенов Б) являются антигенраспознающими рецепторами Т-лимфоцитов В) участвуют в формировании циркулирующих иммунных комплексов Г) участвуют в механизмах гиперчувствительности замедленного типа Д) вступают во взаимодействие с антигеном на поверхности тучных клеток * Охарактеризуйте серологические реакции: А) Реакция агглютинации 1) микробные антигены находятся в корпус- Б) Реакция связывания кулярной форме А, В комплемента 2) воспроизводство реакции требует специ- В) Иммуноферментный альной аппаратуры В анализ 3) в реакции используется свежая сыворот- ка морской свинки Б 4) микробные антигены находятся в молеку- лярной форме Б, В 5) в реакции используются антитела, мечен- ные флюорохромом Охарактеризуйте серологические реакции: А) Реакция нейтрализа- 1) перед постановкой реакции возбудитель ции вирусов должен быть выделен в чистой культуре Б) Прямой иммунолюми- 2) реакция может воспроизводится на стекле Б несцентный метод 3) реакция воспроизводится только с целью В) Реакция пассивной серодиагностики инфекционных болезней В гемагглютинации 4) реакция применяется с целью обнаружения возбудителя в исследуемом материале А, Б 5) реакция воспроизводится in vitro Б, В Охарактеризуйте серологические реакции: А) Непрямой иммунофер- 1) реакция воспроизводится in vivo В ментный анализ 2) реакция используется только в направле- Б) Реакция преципитации нии серодиагностики А, В В) Реакция Шика 3) антиген имеет корпускулярную форму 4) в реакции используется «сэндвич»-принцип А 5) реакция основана на осаждении антигена из раствора Б Охарактеризуйте методы аллергодиагностики: А) Тест ингибиции мигра- 1) характеризует аллергические реакции ции лейкоцитов немедленного типа Б, В Б) Кожная проба 2) находит широкое применение при В) Определение специфи- диагностике инфекционных болезней А, Б ческого IgE 3) при воспроизведении предполагает ис- пользование аллергенов А,Б,В 4) учитывается по феномену разрушения лейкоцитов 5) широко используется при вирусных ин- фекциях Охарактеризуйте серологические реакции: А) Реакция торможения 1) в реакции используются меченные антитела Б гемагглютинации 2) в реакции используются меченные эритро- Б) Радиоиммунный анализ циты В) Реакция нейтрализации 3) в реакции используется чистая культура Токсина самого возбудителя А 4) в реакции используются продукты жизне- деятельности возбудителя В 5) реакция может быть поставлена для обна- ружения антигенов возбудителя в иссле- дуемом материале Б, В Охарактеризуйте серологические реакции: А) Реакция агглютинации 1) реакция может быть использована при Б) Реакция связывания диагностике вирусных инфекций Б, В комплемента 2) учет реакции производится по измене- В) Реакция нейтрализации ниям в индикаторной системе Б 3) при учете реакции ориентируются на ди- агностический титр сыворотки больного А 4) в основе положительной реакции лежит осаждение иммунного комплекса А, Б 5) в реакции используется эритроцитарный диагностикум Охарактеризуйте методы аллергодиагностики: А) Определение общего 1) предполагает использование аллергенов Б, В IgE 2) может характеризовать реагиновый тип Б) Реакция лейкоцитолиза аллергической реакции А, В В) Провокационный 3) характеризует только гиперчувстви- ринотест тельность замедленного типа 4) воспроизводится in vivo В 5) воспроизводится аппаратным 18. Выберите тесты, наиболее адекватно характеризующие: А) Клеточный иммунитет 1) число CD19+ клеток Б при вирусной инфекции 2) число CD4+ клеток А, Б Б) Гуморальный иммунитет 3) число CD8+ клеток А при хронической бакте- 4) уровень IgM риальной инфекции 5) уровень IgG Б Выберите тесты, наиболее адекватно характеризующие: А) Гуморальный иммунитет 1) число CD19+ клеток А при острой протозойной 2) число CD4+ клеток А, Б инфекции 3) уровень комплемента А Б) Клеточный иммунитет 4) уровень IgM А при грибковой инфекции 5) уровень IgG Выберите тесты, наиболее адекватно характеризующие: А) Клеточный иммунитет 1) число CD19+ клеток Б при бактериальной инфекции 2) число CD4+ клеток А, Б Б) Гуморальный иммунитет 3) уровень IgM при хроническом стомато- 4) уровень IgG Б логическом заболевании 5) уровень IgF Б Задачи для контроля знаний, умений и практических навыков: №1. Возбудителем брюшного тифа служат грамотрицательные палочковидные бактерии. Попадая в организм человека вместе с водой и пищей, возбудители первично размножаются в макрофагах лимфоидного аппарата кишечника, а затем проникают в кровь, где частично разрушаются с участием бактерицидных гуморальных факторов. В последнем случае высвобождаются антигены жгутиков и полисахаридные антигены клеточной стенки бактерий, обладающие видовой специфичностью. В связи с указанными особенностями патогенеза возбудители брюшного тифа вызывают на первых этапах заболевания выраженную гуморальную иммунологическую перестройку организма, а позднее (примерно на 2-й неделе заболевания) развиваются клеточные реакции. Составьте краткую схему-алгоритм развития иммунного процесса на 8-й день от начала заболевания брюшным тифом. Выберите правильные ответы в составе тестов, пользуясь лекционным материалом и материалом практических занятий. 1. К какой категории относятся видовые антигены возбудителя брюшного тифа: а) О-антиген * б) антиген капсида в) К-антиген г) Н-антиген * д) гаптен е) М-антиген ж) гемагглютинин 2. Какие клетки в наибольшей степени могут презентировать антиген в этот период развития брюшного тифа: а) гранулоциты крови б) эпителиальные клетки в) макрофаги тканей * г) нефагоцитирующие клетки лимфы и лимфатических узлов * д) макрофаги крови * е) клетки Лангерганса ж) тучные клетки 3. Какие иммунокомпетентные клетки будут преимущественно задействованы в данный период развития иммунного ответа: а) В-лимфоциты * б) цитотоксические Т-лимфоциты в) Т- и В-лимфоциты памяти г) плазматические клетки * д) естественные киллеры е) активированные Т-хелперы* ж) клетки с антиидиотипическими рецепторами 4. Какие секреторные продукты клеток, участвующих в иммунном ответе, будут преимущественно влиять на иммунопатогенез заболевания в указанный период: а) IgА б) IgD * в) IgE г) IgG д) IgM * е) интерферон ж) комплемент * 5. Какая форма иммунного ответа будет преобладать в данном случае: а) первичный иммунный ответ * б) вторичный иммунный ответ в) секреторный иммунный ответ г) гиперчувствительность немедленного типа д) гиперчувствительность замедленного типа * е) спонтанная цитотоксичность ж) антигенспецифический цитолиз з) иммуносупрессия 6. Какие изменения будут превалировать у данного больного в лейкоформуле: а) изменение числа нейтрофильных гранулоцитов б) изменение числа эозинофильных гранулоцитов в) изменение числа базофильных гранулоцитов г) изменение числа лимфоцитов * д) изменение числа моноцитов * 7. Какие изменения будут превалировать у данного больного в иммунограмме: а) изменение числа CD3+ клеток * б) изменение числа СD4+ клеток * в) изменение числа CD8+ клеток г) изменение числа CD16+ клеток * д) изменение числа HLA-D+ клеток * в) изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови * г) изменение уровня комплемента в крови * д) изменение фагоцитарного показателя крови Выберите серологическую реакцию, которая позволит определить антитела к поверхностным клеточным антигенам возбудителя в сыворотке крови, поставьте эту реакцию, обсудив схему постановки с преподавателем, и учтите ее результаты (реакция агглютинации) №2. Вирус кори относится к семейству парамиксовирусов и поражает в организме клетки слизистых оболочек дыхательных путей, а также обладает способностью прикрепляться к поверхности эритроцитов. Заболевание обычно сопровождается накоплением вируса в региональных лимфатических узлах и выраженной вирусемией (циркуляцией возбудителя в крови), которая иногда приводит к развитию иммуносупрессии и длительной персистенции вируса в организме даже тогда, когда симптомы заболевания давно исчезли. Составьте краткую схему-алгоритм развития иммуносупрессии вследствие длительной вирусемии, если учесть, что ребенок перенес заболевание месяц назад Выберите правильные ответы в составе тестов, пользуясь лекционным материалом и материалом практических занятий. 1. К какой категории относятся видовые антигены возбудителя брюшного тифа: а) О-антиген б) антиген капсида * в) К-антиген г) Н-антиген д) гаптен е) М-антиген ж) гемагглютинин * 2. Какие клетки в наибольшей степени могут презентировать антиген в этот период развития брюшного тифа: а) гранулоциты крови б) эпителиальные клетки * в) макрофаги тканей г) нефагоцитирующие клетки лимфы и лимфатических узлов * д) макрофаги крови * е) клетки Лангерганса ж) тучные клетки 3. Какие иммунокомпетентные клетки будут преимущественно задействованы в данный период развития иммунного ответа: а) В-лимфоциты * б) цитотоксические Т-лимфоциты в) Т- и B-лимфоциты памяти г) плазматические клетки * д) естественные киллеры е) активированные Т-хелперы* ж) клетки с антиидиотипическими рецепторами * 4. Какие секреторные продукты клеток, участвующих в иммунном ответе, будут преимущественно влиять на иммунопатогенез заболевания в указанный период: а) IgА б) IgD в) IgE г) IgG * д) IgM е) интерферон * ж) комплемент 5. Какая форма иммунного ответа будет преобладать в данном случае: а) первичный иммунный ответ б) вторичный иммунный ответ * в) секреторный иммунный ответ г) гиперчувствительность немедленного типа д) гиперчувствительность замедленного типа * е) спонтанная цитотоксичность ж) антигенспецифический цитолиз з) иммуносупрессия * 6. Какие изменения будут превалировать у данного больного в лейкоформуле: а) изменение числа нейтрофильных гранулоцитов б) изменение числа эозинофильных гранулоцитов в) изменение числа базофильных гранулоцитов г) изменение числа лимфоцитов * д) изменение числа моноцитов 7. Какие изменения будут превалировать у данного больного в иммунограмме: а) изменение числа CD3+ клеток * б) изменение числа СD4+ клеток * в) изменение числа CD8+ клеток г) изменение числа CD16+ клеток д) изменение числа HLA-D+ клеток в) изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови * г) изменение уровня комплемента в крови д) изменение фагоцитарного показателя крови Выберите чувствительную серологическую реакцию, которая позволит определить минимальное количество антител к вирусному возбудителю в сыворотке крови, поставьте эту реакцию, обсудив схему постановки с преподавателем, и учтите ее результаты (реакция связывания комплемента). №3. Сибирская язва – зоонозная инфекция. Ее возбудитель является грамположительной палочковидной бактерией, обладает уникальной способностью проникать в организм человека через неповрежденную кожу и вызывать ее поражение с последующим быстрым распространением во внутренних средах организма и развитием сепсиса. Дело в том, что возбудитель формирует в организме выраженную капсулу, препятствующую его фагоцитозу, и вырабатывает экзотоксины. В связи с этими особенностями на месте проникновения возбудителя развивается клеточная аллергическая реакция, а в крови постепенно накапливаются антитела. Нередко развитие гуморальной реакции значительно запаздывает, что очень часто делает прогноз заболевания неблагоприятным. Составьте краткую схему-алгоритм развития иммунологической перестройки организма при сибирской язве, если учесть, что диагностика проводится на 4-ый день болезни. Выберите правильные ответы в составе тестов, пользуясь лекционным материалом и материалом практических занятий. 1. К какой категории относятся видовые антигены возбудителя брюшного тифа: а) О-антиген б) антиген капсида в) К-антиген * г) Н-антиген д) гаптен е) М-антиген ж) экзотоксин * 2. Какие клетки в наибольшей степени могут презентировать антиген в этот период развития брюшного тифа: а) гранулоциты крови б) эпителиальные клетки в) макрофаги тканей г) нефагоцитирующие клетки лимфы и/или лимфатических узлов * д) макрофаги крови * е) клетки Лангерганса* ж) тучные клетки 3. Какие иммунокомпетентные клетки будут преимущественно задействованы в данный период развития иммунного ответа: а) В-лимфоциты * б) цитотоксические Т-лимфоциты в) Т- и B-лимфоциты памяти г) плазматические клетки д) естественные киллеры е) активированные Т-хелперы* ж) клетки с антиидиотипическими рецепторами 4. Какие секреторные продукты клеток, участвующих в иммунном ответе, будут преимущественно влиять на иммунопатогенез заболевания в указанный период: а) IgM б) IgG в) цитотоксин * г) комплемент д) ИЛ-2 * е) интерферон * ж) ФУМ * 5. Какая форма иммунного ответа будет преобладать в данном случае: а) первичный иммунный ответ * б) вторичный иммунный ответ в) секреторный иммунный ответ г) гиперчувствительность немедленного типа д) гиперчувствительность замедленного типа * е) спонтанная цитотоксичность ж) антигенспецифический цитолиз з) иммуносупрессия 6. Какие изменения будут превалировать у данного больного в лейкоформуле: а) изменение числа нейтрофильных гранулоцитов б) изменение числа эозинофильных гранулоцитов в) изменение числа базофильных гранулоцитов г) изменение числа лимфоцитов * д) изменение числа моноцитов * 7. Какие изменения будут превалировать у данного больного в иммунограмме: а) изменение числа CD3+ клеток * б) изменение числа СD4+ клеток * в) изменение числа CD8+ клеток г) изменение числа CD16+ клеток д) изменение числа HLA-D+ клеток * в) изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови г) изменение уровня комплемента в крови д) изменение фагоцитарного показателя крови Выберите реакцию, которая позволит обнаружить антигены возбудителя в том материале, через который произошло заражение человека (например, при выделке кожи больного животного), поставьте эту реакцию, обсудив схему постановки с преподавателем, и учтите ее результаты (реакция термокольцепреципитации). №4. Вирус клещевого энцефалита является флавивирусом, обладает гемагглютинирующими и цитопатогенными свойствами. Названный вирус относится к числу возбудителей, способных вызывать поражение клеток ЦНС, попадая в центральную нервную систему гематогенным путем. Это приводит к развитию антигенспецифических и спонтанных клеточных реакций противовирусного иммунитета, в то время как циркуляция вируса в крови способствует развитию гуморального иммунного ответа. Составьте краткую схему-алгоритм развития иммунологической перестройки организма при клещевом энцефалите, если учесть, что у больного уже в течение 2-х недель регистрируются признаки заболевания. Выберите правильные ответы в составе тестов, пользуясь лекционным материалом и материалом практических занятий. 1. К какой категории относятся видовые антигены возбудителя брюшного тифа: а) О-антиген б) антиген капсида * в) К-антиген г) Н-антиген д) гаптен е) Vi-антиген ж) гемагглютинин 2. Какие клетки в наибольшей степени могут презентировать антиген в этот период развития брюшного тифа: а) гранулоциты крови б) эпителиальные клетки в) макрофаги тканей * г) нефагоцитирующие клетки лимфы и лимфатических узлов д) макрофаги крови * е) клетки Лангерганса ж) тучные клетки 3. Какие иммунокомпетентные клетки будут преимущественно задействованы в данный период развития иммунного ответа: а) В-лимфоциты * б) цитотоксические Т-лимфоциты * в) Т- и B-лимфоциты памяти г) плазматические клетки * д) естественные киллеры * е) активированные Т-хелперы * ж) клетки с антиидиотипическими рецепторами 4. Какие секреторные продукты клеток, участвующих в иммунном ответе, будут преимущественно влиять на иммунопатогенез заболевания в указанный период: а) IgА б) IgD в) IgE г) IgG * д) IgM е) интерферон ж) комплемент * 5. Какая форма иммунного ответа будет преобладать в данном случае: а) первичный иммунный ответ б) вторичный иммунный ответ * в) секреторный иммунный ответ г) гиперчувствительность немедленного типа * д) гиперчувствительность замедленного типа е) спонтанная цитотоксичность ж) антигенспецифический цитолиз з) иммуносупрессия Выберите реакцию, которая относительно быстро позволит определить в сыворотке больного антитела к возбудителю, поставьте эту реакцию, обсудив схему постановки с преподавателем, и учтите ее результаты (реакция торможения гемагглютинации). №5 Возбудитель бруцеллеза относится к грамотрицательным палочковидным бактериям. Заболевание протекает как хронический сепсис, сопровождающийся периодическим выходом в кровь большого количества возбудителей из печени, селезенки и других органов. Поскольку гуморальные реакции на возбудителя выражены достаточно хорошо, возбудитель активно разрушается в крови с участием комплемента, при этом из клеточной стенки бруцелл и их капсул выделяются белковые антигены, характерные для этих возбудителей и участвующие в процессе взаимодействия с антителами. Это взаимодействие, в свою очередь, провоцирует поражение суставов, поскольку установлено, что явления артрита не связаны с присутствием самих бруцелл в полости суставов, а имеют иммунологическую природу. Составьте краткую схему-алгоритм развития иммунологической перестройки организма при бруцеллезе, если учесть, что у больного уже в течение 2-х месяцев регистрируются признаки заболевания. Выберите правильные ответы в составе тестов, пользуясь лекционным материалом и материалом практических занятий. 1. К какой категории относятся видовые антигены возбудителя брюшного тифа: а) О-антиген б) антиген капсида в) К-антиген * г) Н-антиген д) гаптен е) Vi-антиген * ж) гемагглютинин 2. Какие клетки в наибольшей степени могут презентировать антиген в этот период развития брюшного тифа: а) гранулоциты крови б) эпителиальные клетки в) макрофаги тканей * г) нефагоцитирующие клетки лимфы и лимфатических узлов д) макрофаги крови * е) клетки Лангерганса ж) тучные клетки 3. Какие иммунокомпетентные клетки будут преимущественно задействованы в данный период развития иммунного ответа: а) В-лимфоциты * б) цитотоксические Т-лимфоциты в) Т- и B-лимфоциты памяти * г) плазматические клетки * д) естественные киллеры е) активированные Т-хелперы * ж) клетки с антиидиотипическими рецепторами 4. Какие секреторные продукты клеток, участвующих в иммунном ответе, будут преимущественно влиять на иммунопатогенез заболевания в указанный период: а) IgА б) IgD в) IgE г) IgG * д) IgM е) интерферон ж) комплемент * 5. Какая форма иммунного ответа будет преобладать в данном случае: а) первичный иммунный ответ б) вторичный иммунный ответ * в) секреторный иммунный ответ г) гиперчувствительность немедленного типа * д) гиперчувствительность замедленного типа е) спонтанная цитотоксичность ж) антигенспецифический цитолиз з) иммуносупрессия 6. Какие изменения будут превалировать у данного больного в лейкоформуле: а) изменение числа нейтрофильных гранулоцитов * б) изменение числа эозинофильных гранулоцитов в) изменение числа базофильных гранулоцитов г) изменение числа лимфоцитов * д) изменение числа моноцитов * 7. Какие изменения будут превалировать у данного больного в иммунограмме: а) изменение числа CD3+ клеток * б) изменение числа СD4+ клеток * в) изменение числа CD8+ клеток г) изменение числа CD16+ клеток д) изменение числа HLA-D+ клеток * в) изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови * г) изменение уровня комплемента в крови * д) изменение фагоцитарного показателя крови * Выберите реакцию, которая позволит определить в сыворотке больного антитела к возбудителю даже если у больного длительная ремиссия заболевания, сопровождающаяся снижением уровня циркулирующих антител, поставьте эту реакцию, обсудив схему постановки с преподавателем, и учтите ее результаты (реакция пассивной гемагглютинации). № 6. Споры грибов несут в составе своей оболочки большое число гаптенов, свойственных многим грибам. В связи с этим развитие у человека грибкового заболевания неизменно сопровождается сопутствующей аллергической перестройкой организма. У лиц с определенной наследственной предрасположенностью, имеющих частые контакты со спорами грибов, последние вызывают аллергию гуморального типа. В то же время мицеллий гриба, образуясь при ряде заболеваний в тканях организма, в частности, в легких и лимфатических узлах, слабо стимулирует антигенами клеточной стенки гуморальный иммунный ответ и провоцирует развитие аллергии, характеризующейся как разновидность клеточного иммунного ответа. Составьте краткую схему-алгоритм развития аллергической перестройки организма при грибковом заболевании в ситуации, когда на фоне длительно протекающего микоза в организм человека попадают споры плесниевых грибов и вызывают гиперреактивность бронхов. Выберите правильные ответы в составе тестов, пользуясь лекционным материалом и материалом практических занятий. 1. К какой категории относятся антигены патогенного возбудителя: а) О-антиген * б) антиген капсида в) К-антиген г) Н-антиген д) гаптен е) М-антиген ж) гетероантиген * 2. Какие клетки в наибольшей степени могут презентировать антиген в этот период развития брюшного тифа: а) гранулоциты крови б) дендритные клетки * в) макрофаги тканей * г) нефагоцитирующие клетки лимфы и лимфатических узлов * д) макрофаги крови е) клетки Лангерганса ж) тучные клетки 3. Какие иммунокомпетентные клетки будут преимущественно задействованы в данный период развития иммунного ответа: а) В-лимфоциты * б) цитотоксические Т-лимфоциты в) Т- и В-лимфоциты памяти г) плазматические клетки * д) естественные киллеры е) активированные Т-хелперы* ж) клетки с антиидиотипическими рецепторами 4. Какие секреторные продукты клеток, участвующих в иммунном ответе, будут преимущественно влиять на иммунопатогенез заболевания в указанный период: а) IgА б) IgD в) IgE * г) IgG * д) IgM е) гистамин * ж) фактор некроза опухолей * 5. Какая форма иммунного ответа будет преобладать в данном случае: а) первичный иммунный ответ б) вторичный иммунный ответ * в) секреторный иммунный ответ г) гиперчувствительность немедленного типа * д) гиперчувствительность замедленного типа * е) спонтанная цитотоксичность ж) антигенспецифический цитолиз з) иммуносупрессия 6. Какие изменения будут превалировать у данного больного в лейкоформуле: а) изменение числа нейтрофильных гранулоцитов б) изменение числа эозинофильных гранулоцитов * в) изменение числа базофильных гранулоцитов * г) изменение числа лимфоцитов * д) изменение числа моноцитов 7. Какие изменения будут превалировать у данного больного в иммунограмме: а) изменение числа CD3+ клеток * б) изменение числа СD4+ клеток * в) изменение числа CD8+ клеток г) изменение числа CD16+ клеток д) изменение числа HLA-D+ клеток * в) изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови * г) изменение уровня воспалительных медиаторов в крови * д) изменение фагоцитарного показателя крови Выберите диагностическую реакцию, которая позволит определить состояние аллергии клеточного типа к грибковым аллергенам, поставьте эту реакцию, обсудив схему постановки с преподавателем, и учтите ее результаты (тест ингибиции миграции лейкоцитов) СХЕМА ОТВЕТА ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ Диагностические препараты Лечебно-профилактические препараты Для какой диагностической реак- Применяется для лечения или профи- ции предназначен? лактики? При каком заболевании? При каком заболевании? В каком диагностическом направ- Какой эффект достигается при приме- лении? нении? Способ получения? Способ получения? Способ применения? Способ применения? Способ титрования (если есть титр)? Способ титрования (если есть титр)? Когда реакция считается положи- Основной критерий эффективности пре- тельной? парата? studfiles.net Эпидемиологическая безопасность и прикладная вакцинология Генетически инактивированные гоксины (рекомбинантные анатоксины) Химическая инактивация бактериальных токсинов с помощью формальдегида предложена в 1923—1924 гг. и применяется в производстве до настоящего времени. Специалисты подчеркивают, что полученные таким способом анатоксины сохраняют способность к реверсии. Рекомбинантные анатоксины лишены потенциальной опасности химически инактивированных препаратов. В общем виде схема получения генетически инактивированных токсинов выглядит таким образом: делеция участка гена, кодирующего детоксичность, клонирование модифицированного гена, введение его в систему экспрессии, получение иммуногенного белка, лишенного токсичности. Получены генетически инактивированные токсины возбудителя коклюша, дифтерии, синегнойной инфекции, сибирской язвы, столбняка. В настоящее время АКДС-вакцина с генетически инактивированным коклюшным токсином используется в Италии. Терапевтические вакцины. Терапевтические вакцины (ТВ) — это препараты, которые индуцируют развитие иммунного ответа, направленного на прекращение или смягчение (облегчение) существующего заболевания. Спектр реального или прогнозируемого применения ТВ весьма широк и включает: - хронические заболевания, ассоциированные со смешанной бактериальной или бактериально-вирусной инфекциями; « хронические инфекции, возбудителями которых являются вирус гепатита В, вирус папилломы, вирус гепатита С, ВИЧ; - опухоли, прежде всего меланома, рак молочной железы или прямой кишки; - аллергические или аутоиммунные болезни (рассеянный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит). В настоящее время на рынке широко представлены ТВ для лечения хронических воспалительных заболеваний, ассоциированных со смешанными бактериальными или бактериально-вирусными инфекциями. Имеются ТВ для терапии аутоиммунных процессов. Перечисленные препараты получены методами классической вакцинологии. Они состоят из лизатов и антигенных комплексов штаммов условно-патогенных микроорганизмов, рассматриваемых как доминирующий возбудитель инфекций дыхательных путей или мочеполового тракта (пневмококк, стафилококк, клебсиелла, кишечная палочка т.д.). Бактериальные ТВ вызывают развитие адаптивного иммунитета к входящим в их состав микроорганизмам, нормализуют вторичные иммунодефицита, сопровождающие хронический инфекционный процесс, и активизируют за счет входящих в их состав патогенассоции-рованных молекулярных структур врожденный иммунитет, что приводит к быстрому развитию неспецифической рези-стентности. Разрешены для применения и используются Иммуновак-ВП-4 (Россия), Анатоксин стафилококковый очищенный (Россия), Рибомунил (Франция), СолкоУро-вак (Болгария). Для лечения ревматоидного артрита применяют препарат Субреум, состоящий из лизата 18 штаммов кишечной палочки. Завершены экспериментальная разработка и первые клинические испытания нового класса терапевтических вакцин (аллерготропинов) для лечения аллергии. Прогнозируется, что к 2020 г. существенно увеличится применение в медицинской практике ТВ за счет расширения выпуска традиционных препаратов и создания вакцин нового поколения для терапии рака, аллергии и аутоиммунных болезней. Появились сообщения об эффективности ДНК-вакцины в составе микрочастиц при лечении рака прямой кишки у мышей. Исследования были выполнены в рамках I фазы клинических испытаний. Проведена серия доклинических испытаний и 2 клинических исследования терапевтических дендритных вакцин против ВИЧ-1. Четко продемонстрирована их способность вызывать развитие клеточного иммунитета у здоровых людей. Убедительных данных, свидетельствующих об их влиянии на развитие виремии у больных, пока не получено. Вакцины для профилактики и иммунотерапии злокачественных заболеваний, в т. ч. дендритные вакцины. Рассматривают два типа противораковых вакцин. Один тип направлен против новообразований, ассоциированных с вирусами или бактериями. Другой тип противораковых вакцин — это вакцины против спонтанных опухолей. Получены первые доказательства того, что вакцины против вируса гепатита В обладают несомненной способностью предупреждать развитие гепатокарциномы. Среди привитых детей, живущих на Тайване, частота развития этой опухоли сократилась на 50%, смертность от нее — на 70%. Лицензированной вакцины против вируса папилломы пока нет. Имеются сообщения об испытании нескольких кандидатов в вакцину, различающихся по своей структуре. В экспериментах на животных идет апробация по меньшей мере 9 ДНК-вакцин против вируса простого герпеса типа I и 6 ДНК-вакцин против этого вируса типа П. Завершено доклиническое изучение вакцины из цельных клеток H.pylori. Проблема вакцинотерапии спонтанных опухолей разрабатывается достаточно долго. К 2000 г. стало очевидным, что использование туморассоциированных антигенов (ТАА) не дает желаемого эффекта. Это обусловлено развитием под влиянием опухолей периферической толерантности к ТАА, подавлением функции антиген-представляющих клеток ИЛ-10 или ИЛ-6, секретируемых злокачественными клетками. Начата проверка гипотезы, согласно которой иммунологические нарушения при новообразованиях можно преодолеть и вызвать развитие специфического иммунного ответа с помощью так называемых дендритных вакцин. Предлагают разные варианты дендритных противораковых вакцин: - дендритные клетки, обработанные туморассоциированными антигенами; - дендритные клетки, слившиеся с опухолевыми клетками; - дендритные клетки, обработанные тРНК, когда ассоциированные с опухолью неизвестны. Следует подчеркнуть, что дендритные вакцины могут использоваться для лечения как спонтанных опухолей, так и новообразований, ассоциированных с вирусами. Имеются сообщения о первых результатах испытания дендритных противораковых вакцин на людях. Исследования проводили на ограниченных группах пациентов в IV стадии заболевания. Четко доказана безвредность вакцин. В ряде случаев наблюдали положительный клинический эффект. Высказывается предположение, что дендритные вакцины окажутся эффективными для продления безрецидивного периода онкологических больных после максимальной циторедукции хирургическим путем и/или при помощи химиотерапии. Неинъекционные вакцины. Необходимость разработки вакцин для непарентерального введения продиктована следующими обстоятельствами. 1. Стремлением повысить безопасность процедуры вакцинации, снизить затраты на ее проведение и сделать эту процедуру более приемлемой (привлекательной) для населения. В настоящее время ребенок первых лет жизни получает в развитых странах до 17—20 лечебных и вакцинальных инъекций. Ожидается, что по мере расширения календаря прививок число инъекций будет увеличиваться. 2. Предположением, что доставка антигена в зоны локализации дендритных клеток, рассматриваемых в настоящее время как главное звено запуска иммунного ответа, существенно повысит эффективность вакцинации. Интенсивно разрабатываются вакцины для орального, назального применения и транскожной иммунизации. Первые два типа вакцин объединяются понятием мукозальные вакцины. Мукозальные вакцины Преимущества мукозальных вакцин обусловлены не только удобством для пациентов, а прежде всего тем, что этот метод стимулирует иммунный ответ во входных воротах большинства известных патогенов. При этом взаимодействие антигена с определенным участком слизистой (кишечника) ведет к стимуляции иммунных реакций в мукозальной системе в целом, а также к развитию системного иммунного ответа. Теоретически мукозальные вакцины обладают важным свойством, которое не обнаружено у парентеральных препаратов — они создают местный иммунный ответ и таким образом защищают не только против болезни, но и предупреждают развитие инфекционного процесса на слизистых (колонизацию), что ведет к уменьшению (или прекращению) горизонтальной передачи патогена от носителя к чувствительному субъекту. Предполагается, что именно мукозальные вакцины станут основным инструментом в профилактике и, возможно, глобальной элиминации дифтерии, а также в борьбе с инфекциями, вызываемыми стрептококками группы В, гемофильной палочкой, клебсиеллой. Основной сложностью применения мукозальных вакцин является необходимость усиления иммунного ответа на протективный антиген с помощью специальных адъювантов. Уже начаты клинические исследования субъединичной назальной вакцины против гриппа, содержащей также му-тантный адъювант LTK63. Есть все основания предполагать, что использование данного подхода может оказаться полезным не только для создания вакцин против респираторных инфекций, но и местных вакцин против некоторых венерических заболеваний и ВИЧ. Появление таких вакцин можно ожидать уже к 2010 г. Весьма большие надежды возлагают на иммуностимулирующий комплекс (ISCOM). Особого внимания заслуживает адъювант MF59- Гранскожная иммунизация Метод основан на гипотезе, согласно которой доставка антигена непосредственно в расположение дендритных клеток позволит усилить системный иммунный ответ. Метод находится в стадии экспериментальной разработки. Изучается его эффективность на примере ДНК-вакцин. Для введения препарата используют метод genegun (частицы золота, несущие на своей поверхности антиген в струе гелия под давлением, внедряются в кожу). Вакцины на основе рекомбинантных белков, воспроизводимых в растениях (син.: растительные, съедобные вакцины) Описаны два приема получения рекомбинантных белков в растениях: 1. Временная экспрессия. Достигается путем введения модифицированного вируса, который несет ДНК, кодирующую протективный белок. 2. Стабильная трансформация генома растения. Такое трансгенное растение способно при выращивании синтезировать протективный антиген, который накапливается в плодах, корнях, листьях и стеблях, т. е. в съедобных частях этого растения. Для получения растительных вакцин используют табак, помидоры, картофель, бананы. В последнее время большое внимание уделяется маису. Декларируется серия преимуществ растительных вакцин по сравнению с классическими иммунопрофилактическими препаратами: безопасность, экономичность, высокая технологичность, развитие массового производства без крупных инвестиций. Пока остается много вопросов, без ответа на которые трансгенные растения (ТР) — продуценты протективных антигенов, не смогут войти в практику. mirznanii.com Съедобные вакцины - Иммунитет сдизистых оболочек

Иммунитет слизистых оболочек Воротами проникновения многих патогенов в организм позвоночных являются слизистые оболочки пищеварительной, респираторной, мочеполовой систем, а так же конъюктивы глаза, внутреннего уха и выводящих путей всех экзокринных желез. Защитные функции этих оболочек обеспечиваются наличием в них разнообразных иммунокомпетентных клеток, в том числе Т- и В-лимфоцитов и антигенпредставляющих клеток, организованных в мукозальную лимфоидную ткань (слизисто-ассоциированную лимфоидную ткань). Еще в 1925 году А.М. Безредка выдвинул и опубликовал теорию местного иммунитета как  важной и особенной части общего иммунитета, функционирующей совместно с системным иммунитетом. Как показало время, он справедливо полагал, что вакцины необходимо вводить тем же путем, каким возбудители инфекционных болезней проникают в организм (Медуницын, 2004). В последние годы сформировались такие понятия, как мукозальная система (от лат. mucosus - слизистый), мукозальный иммунитет, которые используются как частный случай понятия - «местный иммунитет», тем самым, подчеркивая важность иммунитета слизистых. К мукозальной системе относятся желудочно-кишечный, респираторный и урогенитальный тракты, а также слезные, слюнные и грудные железы. Мукозальная иммунная система выполняет три основные функции: Защита слизистых от колонизации и инвазии потенциально опасными микроорганизмами Препятствие усвоению недеградированных антигенов, включая чужеродные белки из употребляемой пищи,  переносимые воздухом и содержащиеся в сапрофитных микроорганизмах Предотвращение развития потенциально опасных иммунных реакций на вышеперечисленные антигены В отличие от системного иммунного аппарата, мукозальный иммунитет постоянно функционирует в условиях плотного контакта с чужеродными молекулами и должен эффективно выбирать механизмы ответа на антигены и регулировать их интенсивность, чтобы избежать повреждения тканей и иммунного истощения организма. Многочисленные исследования показали, что индукция системного иммунного ответа в результате инъекционной   иммунизации   может   эффективно предотвращать системные инфекции, но обычно при этом не защищает слизистые оболочки. Доставка же антигена на слизистые чаще всего приводит к стимуляции как местного, так и системного иммунного ответа (Holmgren and Czerkinsky, 2005; Walmsley and Arntzen, 2000). Чрезвычайно важным является тот факт, что иммунный ответ слизистых оболочек желудочно-кишечного, респираторного и мочеполового трактов - взаимосвязан. При стимуляции иммунного ответа в кишечнике, специфичный иммунный ответ против данного антигена будет также наблюдаться в дыхательных и мочеполовых путях в виде продукции соответствующего sIgA (секреторного IgA). В зависимости от сайта проникновения антигена существует предпочтительное направление миграции иммунокомпетентных клеток: В-клетки из лимфоидной ткани носоглотки в основном мигрируют в верхние дыхательные пути, тогда как слизистая урогенитального тракта получает В-клетки из нижних отделов пищеварительного тракта. Экспериментальные исследования мукозального иммунитета позволили установить несколько важных закономерностей.  В слизистой оболочке существуют активные лимфоидные структуры, примером которых являются Пейровы бляшки кишечника (Ярилин, 1999), содержащие М-клетки с выраженными пиноцитарными свойствами. Чужеродный белок, обладающий антигенными свойствами, распознается этими клетками, далее они переносят чужеродные антигены к антигенпредставляющим клеткам (таким, как субэпителиальные дендритные клетки и макрофаги), в которых антигенные детерминанты презентируются лимфоцитам (Hathaway and Kraehenbuhl, 2000; Neutra, 1998). Происходит активация T-хэлперов, которые в сочетании с антигеном активируют В-лимфоциты. Популяция лимфоцитов, находящихся в слизистых оболочках, отличается по составу от популяций, характерных для лимфатических узлов или крови. Отличия касаются набора поверхностных рецепторов, а также типа индуцируемых иммуноглобулинов (Manganaro et al., 1994). В эпителии концентрируются Т-клетки с цитотоксическими маркерами. В слизистой соотношение плазматических клеток, секретирующих IgA, IgM и IgG, составляет  20:3:1, а в секреторной жидкости соотношение IgA:IgG составляет  1:1, в сыворотке крови последнее соотношение составляет 1:6 (Медуницын, 2004). После сенсибилизации антигенами В-клетки пролиферируют и переключаются на синтез IgA и sIgA (последний отличается наличием секреторного компонента, который IgA приобретает, проходя сквозь клетки эпителия слизистой). IgA обычно присутствует на слизистой в формах димера или олигомера. Эта форма предохраняет  IgA от действия ферментов. Сам sIgA препятствует адгезии вирусов к поверхности слизистой, нейтрализует токсины и активирует фагоцитарную деятельность клеток (Liashenko et al., 1999; Ярилин, 1999). В процессе развития мукозального иммунного ответа наблюдается широкая миграция клеток-предшественников продуцентов IgA. При посредстве рецепторов взаимодействия клеток - селектинов и интегринов - лимфоциты "находят своё место" в различных слизистых, в частности в лимфоидных фолликулах слизистой оболочки, где и дифференцируются в клетки, продуцирующие IgA антитела (Brandtzaeg and Johansen, 2005; Hansen et al., 2006). Антигены и сенсибилизированные лимфоциты могут проникать через регионарные лимфатические узлы в грудной проток и кровеносные сосуды, оседать в лимфоидных органах и индуцировать образование антител разных классов. Затем дифференцированные В-клетки выходят из фолликул и поступают через общую циркуляцию в мезентеральные лимфатические узлы, где происходит их созревание и превращение в slgA-продуцирующие плазматические клетки, синтезирующие специфические антитела. Клетки, синтезирующие IgA, возвращаются в слизистую кишечника, усиливая местный иммунитет. Надо отметить большое значение в антиинфекционном иммунитете такого механизма как – повторное поступление IgA в кишечник через печень. Гепатоциты захватывают IgA (его дву- и олигомерные формы) из циркулирующей крови и экскретируют его в желчь, что в значительной степени повышает устойчивость организма к поступающим с пищей микробам. Примечательно, что иммуноглобулин IgA (sIgA) обычно не синтезируется при системном иммунном ответе (de Aizpurua and Russell-Jones, 1988).  Таким образом, речь идёт о единой мукозальной системе иммунитета (Manganaro et al., 1994; Quiding-Jarbrink et al., 2001; Ruedl et al., 1993). В последние годы внимание специалистов-вакцинологов всё больше обращено на неинъекционные формы вакцинации и  в частности – на аэрозольный и энтеральный способ введения мукозальных вакцин. Методы, не нарушающие естественные барьеры человека, лишены многих недостатков парентерального введения: это и низкая реактогенность вакцин при внесении их на слизистую оболочку и отсутствие риска случайного заражения инфекционным заболеванием связанного с небрежностью медицинского персонала. Теоретически, мукозальные вакцины способны создавать "иммунитет входных ворот", предотвращая размножение патогенных микроорганизмов в слизистой оболочке и их проникновение в другие ткани человека. В 60-х годах прошлого столетия успешно прошли испытания энтеральные вакцины (вариант мукозальных вакцин, вводимых через рот (перорально)) против гриппа, кори, паротита, клещевого энцефалита и аденовирусной инфекции. Массовая пероральная вакцинация против полиомиелита является прекрасным доказательством правомерности самой идеи энтеральной иммунизации. Для введения мукозальных вакцин энтерально и защиты их от пищеварительных ферментов используют дополнительное включение антигенов в липосомы или медленно растворяющиеся микрочастицы (de Haan et al., 1996; Eyles et al., 2000; Kang et al., 1999). При создании мукозальных вакцин были использованы и другие адъюванты: полисахариды, биологически активные пептиды (Boyaka and McGhee, 2001; Davis, 2001; Ruedl et al., 1993). История создания энтеральных вакцин исчисляется уже десятилетиями, но в практике используются лишь единичные энтеральные вакцины. Среди них – живая полиомиелитная вакцина и рекомбинантная антирабическая вакцина, широко применяемая для профилактики бешенства у диких животных. Так или иначе, но мукозальные вакцины пока мало используются для профилактики инфекций у человека. Разрабатываются оральные вакцины против кори, аденовирусной и менингококковой инфекций, гриппа, ВИЧ-1. Немаловажное значение для внедрения оральных вакцин имеет их рентабельность. Для энтеральной иммунизации необходимы высокие дозы вакцин, во многих случаях антиген должен быть защищен от разрушения желудочным соком с помощью кислотоустойчивого покрытия, что естественно увеличивает стоимость вакцин. Одной из целей создания съедобных вакцин как раз и являлось преодоление таких недостатков энтеральных вакцин. В практике здравоохранения используются несколько способов введения вакцин: парентеральные - подкожный, внутримышечный, безыгольный (с помощью инъектора) и непарентеральные – накожный, энтеральный (оральный), аэрозольный, интраназальный, конъюктивальный, перректальный и интравагинальный пути. Все непарентеральные способы, кроме накожного, индуцируют мукозальный иммунитет. Ведущие вакцинологи признают, что энтеральный способ представляется самым перспективным. При введении вакцин через рот потенциально можно индуцировать иммунитет к любой инфекции. Энтеральные вакцины обладают низкой реактогенностью и слабой аллергенностью. Они хорошо переносимы, их иммунологическая и эпидемиологическая эффективность не уступает аналогичным вакцинам, вводимым другим способом. Пероральный метод  безопасен и прост, не требует специальных условий, оборудования и аппаратуры. Вакцинацию можно проводить в любых условиях, она лишена недостатков шприцевого и аэрозольного методов, при ней отсутствует опасность передачи инфекций, она не вызывает отрицательных эмоций у прививаемых. Все вышесказанное говорит о том, что иммунизация человека через пищеварительный тракт является физиологическим способом приобретения специфической устойчивости к инфекционным заболеваниям. (Медуницын, 2004).  Все эти особенности и преимущества энтеральных мукозальных вакцин легли в основу способа иммунизации настоящего исследования.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что Hsp70 индуцирует в ДК выработку провоспалительных цитокинов: IL-1 beta, IL-6, IL-12 и TNF-alpha, что указывает на выраженный адъювантный эффект Hsp70. Исследование изменений фенотипа ДК при стимуляции Hsp70 показало, что доля клеток, экспрессирующих маркеры зрелых ДК (CD38, CD40, CD83, молекулы MHC2), возрастает. Из всего спектра маркеров зрелых ДК не повышается экспрессия костимуляторных молекул CD86 и CD11с. Остается неясным также изменение уровня TLR2 и TLR4, более типичных для незрелых ДК.

Пример 7

Изготовление многокомпонентных вагинальных суппозиториев для лечения и профилактики вируса папилломы человека

Компоненты:

1) Раствор рекомбинантных белков, E716-Hsp70, E718-Hsp70

2) Хитозан фирмы TAI ZHOU CANDORLY BATCH №06020301, степень деацетиллирования 86%

3) Polyethylenglycol 1500 фирма APPLI СНЕМ CAS-NO: 25322-68-3

4) твердый жир типа А

5) витепсол HW

6) TRIS фирмы МР Biomedicals Inc. cat. №195605.

Состав на 1 суппозиторий:

Раствор рекомбинантных белков E716-Hsp70, E718-Hsp70

Методика получения суппозиториев

Суппозитории готовили методом выливания.

Расчет компонентов проводили на 100 суппозиториев по 3,0 г.

Раствор рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов

К раствору рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов (с=1 мг/мл) в 50 мл 0,01М TRIS прибавляют 0,165 г хитозана и перемешивают в течение 5-10 минут, затем фильтруют через бумажный фильтр (фильтр с синей полосой). В полученный после фильтрации раствор вводят предварительно расплавленный ПЭО 1500 и перемешивают 5 минут. К смеси постепенно прибавляют предварительно расплавленную гидрофобную основу (витепсол, жир типа А) и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С.

Пример 8

Изготовление многокомпонентных ректальных суппозиториев для лечения и профилактики вируса папилломы человека

Компоненты:

1) Раствор рекомбинантных белков E7-16-Hsp70, E7-6-Hsp70

2) Хитозан фирмы TAI ZHOU CANDORLY BATCH №06020301, степень деацетиллирования 86%

3) Polyethylenglycol 1500 фирма APPLI CHEM CAS-NO: 25322-68-3

4) твердый жир типа А

5) витепсол HW

6) Твин-80 до 5%

7) TRIS фирмы МР Biomedicals Inc. cat. №195605.

Состав на 1 суппозиторий:

Раствор рекомбинантных белков E716-Hsp70, E76-Hsp70

Методика получения суппозиториев

Суппозитории готовили методом выливания.

Расчет компонентов проводили на 100 суппозиториев по 3,0 г.

Раствор рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов

К раствору рекомбинантных белков Е7 16 и 18 типов (с=1 мг/мл) в 50 мл 0,01 М TRIS прибавляют 0,165 г хитозана и перемешивают в течение 5-10 минут, затем фильтруют через бумажный фильтр (фильтр с синей полосой). В полученный после фильтрации раствор вводят предварительно расплавленный ПЭО 1500 и перемешивают 5 минут. К смеси постепенно прибавляют предварительно расплавленную гидрофобную основу (витепсол, жир типа А) и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С.

Пример 9

Исследование клинической эффективности разработанной мукозальной вакцины у пациенток с дисплазией шейки матки, обусловленной вирусами папилломы человека тип 16 и 18

Для клинических исследований были отобраны три группы пациенток с диагнозом дисплазии шейки матки (CIN I) и (CIN II). Каждая группа состояла из 10 человек. Диагноз дисплазия шейки матки был установлен на основании клинического обследования и лабораторного анализа образцов эпителия шейки матки на носительство ВПЧ 16 и 18 типов. Каждой пациентке назначали курс лечения вагинальными суппозиториями различного состава 1 раз в неделю в течение 4 недель. В ряде случаев курс лечения проводили в течение 8-12 недель, сохраняя режим назначения препарата по 1 свече на ночь раз неделю. После завершения курса лечения пациенток обследовали с помощью кольпоскопии, проводили морфологические исследования клеток шейки матки и лабораторный анализ ПЦР на наличие ДНК ВПЧ 16 и 18 типов.

Пример 10

Исследование клинической эффективности разработанной мукозальной вакцины у пациентов с диагнозом кондиломы прямой кишки.

Для клинического исследования были отобраны 20 пациентов проктологического отделения с диагнозом "Рецидивирующие кондиломы прямой кишки". Пациенты предъявляли жалобы на боли при акте дефикации, следы крови в стуле. При визуальном осмотре слизистой прямой кишки выявлены кондиломы размером 0.2-0.5 см., слизистая воспалена. У некоторых больных обнаружены трещины анального отверстия.

Пациентам назначена монотерапия ректальными суппозиториями, содержащими описанные ингредиенты по 1 свече на ночь, один раз в неделю в течение 4 недель. В ряде случаев курс лечения проводили в течение 8-12 недель, сохраняя режим назначения препарата по 1 свече на ночь раз неделю. После проведенного курса лечения у 16 пациентов наступило полное клиническое выздоровление, которое сопровождалось исчезновением кондилом и всех признаков воспалительного процесса. У 4 пациентов после проведенного лечения наблюдалось уменьшение числа кондилом отсутствием признаком воспаления. Предлагаемая мукозальная вакцина в виде ректальных суппозиториев весьма эффективна при названных патологиях.

1. Мукозальная вакцина против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, которая содержит в эффективном количестве гибридный белок, состоящий из онкобелка Е7 вируса папилломы человека, слитого с белком теплового шока микобактерий Hsp70, хитозан в соотношении с гибридным белком 1:0,1-10 и фармакологические приемлемые для изготовления суппозиториев добавки.

2. Мукозальная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что для лечения дисплазии шейки матки, вызванной вирусом папилломы человека, используется гибридный белок Е7 тип 16-Hsp70 или Е7 тип 18-Hsp70.

3. Мукозальная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что для лечения анальной кондиломы используется гибридный белок Е7 тип 16-Hsp70 или Е7 тип 6-Hsp70.

4. Способ лечения заболевания, ассоциированного с вирусом папилломы человека, предусматривающий местное применение мукозальной вакцины по любому из пп.1-3 в виде суппозитория.

5. Способ лечения дисплазии шейки матки, вызванной вирусом папилломы человека, предусматривающий интравагинальное введение эффективного количества мукозальной вакцины по п.2.

6. Способ лечения анальной кондиломы, предусматривающий ректальное введение эффективного количества мукозальной вакцины по п.3.

www.findpatent.ru

Эпидемиологическая безопасность и прикладная вакцинология

Генетически инактивированные гоксины (рекомбинантные анатоксины)

Химическая инактивация бактериальных токсинов с помощью формальдегида предложена в 1923—1924 гг. и применяется в производстве до настоящего времени. Специалисты подчеркивают, что полученные таким способом анатоксины сохраняют способность к реверсии. Рекомбинантные анатоксины лишены потенциальной опасности химически инактивированных препаратов. В общем виде схема получения генетически инактивированных токсинов выглядит таким образом: делеция участка гена, кодирующего детоксичность, клонирование модифицированного гена, введение его в систему экспрессии, получение иммуногенного белка, лишенного токсичности. Получены генетически инактивированные токсины возбудителя коклюша, дифтерии, синегнойной инфекции, сибирской язвы, столбняка. В настоящее время АКДС-вакцина с генетически инактивированным коклюшным токсином используется в Италии.

Терапевтические вакцины.

Терапевтические вакцины (ТВ) — это препараты, которые индуцируют развитие иммунного ответа, направленного на прекращение или смягчение (облегчение) существующего заболевания. Спектр реального или прогнозируемого применения ТВ весьма широк и включает:

- хронические заболевания, ассоциированные со смешанной бактериальной или бактериально-вирусной инфекциями;

« хронические инфекции, возбудителями которых являются вирус гепатита В, вирус папилломы, вирус гепатита С, ВИЧ;

- опухоли, прежде всего меланома, рак молочной железы или прямой кишки;

- аллергические или аутоиммунные болезни (рассеянный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит).

В настоящее время на рынке широко представлены ТВ для лечения хронических воспалительных заболеваний, ассоциированных со смешанными бактериальными или бактериально-вирусными инфекциями. Имеются ТВ для терапии аутоиммунных процессов.

Перечисленные препараты получены методами классической вакцинологии. Они состоят из лизатов и антигенных комплексов штаммов условно-патогенных микроорганизмов, рассматриваемых как доминирующий возбудитель инфекций дыхательных путей или мочеполового тракта (пневмококк, стафилококк, клебсиелла, кишечная палочка т.д.).

Бактериальные ТВ вызывают развитие адаптивного иммунитета к входящим в их состав микроорганизмам, нормализуют вторичные иммунодефицита, сопровождающие хронический инфекционный процесс, и активизируют за счет входящих в их состав патогенассоции-рованных молекулярных структур врожденный иммунитет, что приводит к быстрому развитию неспецифической рези-стентности.

Разрешены для применения и используются Иммуновак-ВП-4 (Россия), Анатоксин стафилококковый очищенный (Россия), Рибомунил (Франция), СолкоУро-вак (Болгария).

Для лечения ревматоидного артрита применяют препарат Субреум, состоящий из лизата 18 штаммов кишечной палочки.

Завершены экспериментальная разработка и первые клинические испытания нового класса терапевтических вакцин (аллерготропинов) для лечения аллергии.

Прогнозируется, что к 2020 г. существенно увеличится применение в медицинской практике ТВ за счет расширения выпуска традиционных препаратов и создания вакцин нового поколения для терапии рака, аллергии и аутоиммунных болезней.

Появились сообщения об эффективности ДНК-вакцины в составе микрочастиц при лечении рака прямой кишки у мышей. Исследования были выполнены в рамках I фазы клинических испытаний.

Проведена серия доклинических испытаний и 2 клинических исследования терапевтических дендритных вакцин против ВИЧ-1. Четко продемонстрирована их способность вызывать развитие клеточного иммунитета у здоровых людей. Убедительных данных, свидетельствующих об их влиянии на развитие виремии у больных, пока не получено.

Вакцины для профилактики и иммунотерапии злокачественных заболеваний, в т. ч. дендритные вакцины.

Рассматривают два типа противораковых вакцин. Один тип направлен против новообразований, ассоциированных с вирусами или бактериями. Другой тип противораковых вакцин — это вакцины против спонтанных опухолей. Получены первые доказательства того, что вакцины против вируса гепатита В обладают несомненной способностью предупреждать развитие гепатокарциномы. Среди привитых детей, живущих на Тайване, частота развития этой опухоли сократилась на 50%, смертность от нее — на 70%.

Лицензированной вакцины против вируса папилломы пока нет. Имеются сообщения об испытании нескольких кандидатов в вакцину, различающихся по своей структуре.

В экспериментах на животных идет апробация по меньшей мере 9 ДНК-вакцин против вируса простого герпеса типа I и 6 ДНК-вакцин против этого вируса типа П.

Завершено доклиническое изучение вакцины из цельных клеток H.pylori. Проблема вакцинотерапии спонтанных опухолей разрабатывается достаточно долго. К 2000 г. стало очевидным, что использование туморассоциированных антигенов (ТАА) не дает желаемого эффекта. Это обусловлено развитием под влиянием опухолей периферической толерантности к ТАА, подавлением функции антиген-представляющих клеток ИЛ-10 или ИЛ-6, секретируемых злокачественными клетками.

Начата проверка гипотезы, согласно которой иммунологические нарушения при новообразованиях можно преодолеть и вызвать развитие специфического иммунного ответа с помощью так называемых дендритных вакцин. Предлагают разные варианты дендритных противораковых вакцин:

- дендритные клетки, обработанные туморассоциированными антигенами;

- дендритные клетки, слившиеся с опухолевыми клетками;

- дендритные клетки, обработанные тРНК, когда ассоциированные с опухолью неизвестны.

Следует подчеркнуть, что дендритные вакцины могут использоваться для лечения как спонтанных опухолей, так и новообразований, ассоциированных с вирусами. Имеются сообщения о первых результатах испытания дендритных противораковых вакцин на людях. Исследования проводили на ограниченных группах пациентов в IV стадии заболевания. Четко доказана безвредность вакцин. В ряде случаев наблюдали положительный клинический эффект. Высказывается предположение, что дендритные вакцины окажутся эффективными для продления безрецидивного периода онкологических больных после максимальной циторедукции хирургическим путем и/или при помощи химиотерапии.

Неинъекционные вакцины.

Необходимость разработки вакцин для непарентерального введения продиктована следующими обстоятельствами.

1. Стремлением повысить безопасность процедуры вакцинации, снизить затраты на ее проведение и сделать эту процедуру более приемлемой (привлекательной) для населения. В настоящее время ребенок первых лет жизни получает в развитых странах до 17—20 лечебных и вакцинальных инъекций. Ожидается, что по мере расширения календаря прививок число инъекций будет увеличиваться.

2. Предположением, что доставка антигена в зоны локализации дендритных клеток, рассматриваемых в настоящее время как главное звено запуска иммунного ответа, существенно повысит эффективность вакцинации. Интенсивно разрабатываются вакцины для орального, назального применения и транскожной иммунизации. Первые два типа вакцин объединяются понятием мукозальные вакцины.

Мукозальные вакцины

Преимущества мукозальных вакцин обусловлены не только удобством для пациентов, а прежде всего тем, что этот метод стимулирует иммунный ответ во входных воротах большинства известных патогенов. При этом взаимодействие антигена с определенным участком слизистой (кишечника) ведет к стимуляции иммунных реакций в мукозальной системе в целом, а также к развитию системного иммунного ответа.

Теоретически мукозальные вакцины обладают важным свойством, которое не обнаружено у парентеральных препаратов — они создают местный иммунный ответ и таким образом защищают не только против болезни, но и предупреждают развитие инфекционного процесса на слизистых (колонизацию), что ведет к уменьшению (или прекращению) горизонтальной передачи патогена от носителя к чувствительному субъекту. Предполагается, что именно мукозальные вакцины станут основным инструментом в профилактике и, возможно, глобальной элиминации дифтерии, а также в борьбе с инфекциями, вызываемыми стрептококками группы В, гемофильной палочкой, клебсиеллой. Основной сложностью применения мукозальных вакцин является необходимость усиления иммунного ответа на протективный антиген с помощью специальных адъювантов. Уже начаты клинические исследования субъединичной назальной вакцины против гриппа, содержащей также му-тантный адъювант LTK63. Есть все основания предполагать, что использование данного подхода может оказаться полезным не только для создания вакцин против респираторных инфекций, но и местных вакцин против некоторых венерических заболеваний и ВИЧ. Появление таких вакцин можно ожидать уже к 2010 г.

Весьма большие надежды возлагают на иммуностимулирующий комплекс (ISCOM). Особого внимания заслуживает адъювант MF59-

Гранскожная иммунизация

Метод основан на гипотезе, согласно которой доставка антигена непосредственно в расположение дендритных клеток позволит усилить системный иммунный ответ. Метод находится в стадии экспериментальной разработки. Изучается его эффективность на примере ДНК-вакцин. Для введения препарата используют метод genegun (частицы золота, несущие на своей поверхности антиген в струе гелия под давлением, внедряются в кожу).

Вакцины на основе рекомбинантных белков, воспроизводимых в растениях (син.: растительные, съедобные вакцины)

Описаны два приема получения рекомбинантных белков в растениях:

1. Временная экспрессия. Достигается путем введения модифицированного вируса, который несет ДНК, кодирующую протективный белок.

2. Стабильная трансформация генома растения. Такое трансгенное растение способно при выращивании синтезировать протективный антиген, который накапливается в плодах, корнях, листьях и стеблях, т. е. в съедобных частях этого растения. Для получения растительных вакцин используют табак, помидоры, картофель, бананы. В последнее время большое внимание уделяется маису. Декларируется серия преимуществ растительных вакцин по сравнению с классическими иммунопрофилактическими препаратами: безопасность, экономичность, высокая технологичность, развитие массового производства без крупных инвестиций. Пока остается много вопросов, без ответа на которые трансгенные растения (ТР) — продуценты протективных антигенов, не смогут войти в практику.

1. Какова генетическая стабильность ТР, синтезирующих чужеродные антигены; каково влияние этих растений на растения того же вида и возможно ли распространение ТР естественным путем; меняется ли пищевая или иная ценность овощей, фруктов и других плодов, полученных от ТР.

2. Не нарушат ли трансгенные вакцины кишечную толерантность к пищевым аллергенам.

3. Как законодательно исключить неконтролируемое выращивание и распространение трансгенных растений — продуцентов чужеродных антигенов. По-видимому, в ближайшие годы работы по получению рекомбинантных белков в трансгенных растениях не выйдут за пределы экспериментов на животных и ограниченных испытаний на людях.

Приоритетные для России фундаментальные исследования и прикладные разработки в области вакцинологии

1. Исследование клеточных и молекулярных механизмов активации врожденного иммунитета при формировании антиинфекционного и противоопухолевого иммунитета.

2. Экспериментальная разработка и клиническая апробация адъювантов нового поколения для потенцирования иммуногенности генно-инженерных продуктов.

3. Получение методами обратной вакцинологии кандидатов в вакцины против ВИЧ-инфекции, инфекции вируса гепатита С и менингококковой инфекции типа В.

4. Использование метода обратной транскрипции при получении посевного штамма из актуальных штаммов вируса гриппа птиц для конструирования пандемической гриппозной вакцины.

5. Создание нового поколения средств для иммунотерапии рака (аутологичные дендритные вакцины), аллергологии (аллерготропины) и послеоперационных инфекционных осложнений (бактериальные иммуномодуляторы, пробиотики).

6. Разработка иммунобиологических средств для экстренной защиты от неизвестных патогенов.

7. Создание вакцин календаря прививок для непарентерального введения (назальное, оральное, транскожное).

8. Разработка и внедрение в практику бесклеточной коклюшной вакцины с последующим включением ее в состав АКДС-вакцины.

9. Разработка и внедрение в практику новой инактивированной вакцины против полиомиелита.

Список литературы

Журнал «Ремедиум», №9, 2005 год

Дата добавления: 10.10.2005

www.km.ru

Смотрите также

• 
  Вакцина гинатрен
• 
  Вакцина ультракс
• 
  Вакцины неживые
• 
  Вакцина для
• 
  Совинол вакцина
• 
  Вакцина pentaxim
• 
  Pentaxim вакцина
• 
  Синагис вакцина
• 
  Пента вакцина
• 
  Вакцина нобилис
• 
  Вакцина иммуноглобулин