аттенуированные бактерии bordetella pertussis, вакцина против возбудителя коклюша. Вакцина ккв

6 распространенных заблуждений о вакцинации и как на них реагировать | вакцинация

Введение

Будучи практикующим врачом, проводящим прививки, Вы столкнетесь с пациентами, которые имеют предубеждения против вакцинации себя или своих детей, включая таких, которые вообще откажутся делать прививки. Может быть приведено множество причин страха и предубеждений против вакцинации. Некоторые пациенты имеют религиозные или философские возражения. Некоторые рассматривают обязательные прививки как вмешательство правительства в то, что по их соображениям является личным выбором каждого. Другие граждане беспокоятся о безопасности и/или эффективности вакцин, или, возможно, верят в то, что заболевания предотвращаемые вакцинопрофилактикой, не представляют серьезной угрозы здоровью.

Практикующий врач обязан выслушать и постараться понять соображения, страх и предубеждения пациента насчет вакцинации и принять их в рассмотрение при предложении вакцины. Это не только поможет формированию взаимного доверия между пациентом и врачом, но также поможет Вам решить, какие аргументы могут быть наиболее эффективны для убеждения каждого конкретного пациента признать необходимость прививки.

Цель этого памфлета состоит в описании 6 распространенных заблуждений о вакцинации. Они часто приводятся родителями в качестве довода против необходимости прививать своих детей, и, если мы сможем аккуратно опровергнуть их, то мы не только “облегчим их душу” по этим вопросам, но и настроим их против слепого принятия на веру антивакцинных “фактов”. Наша цель - не “застращать” родителей, а дать им точную информацию для самостоятельного принятия осознанного решения.

Заболевания начали исчезать до начала применения вакцин, просто по причине лучшей санитарии и гигиены.

Утверждения типа приведенного выше часто встречаются в антипрививочной литературе, их авторы пытаются показать, что вакцины не нужны. Улучшение социальноэкономических условий несомненно прямо повлияло на заболевания. Лучшее питание, не упоминая даже применение антибиотиков, и другие методы лечения, увеличили показатель выживания среди заболевших; менее тесные условия проживания снизили распространение заболеваний; снижение коэффициента рождаемости уменьшило число контактирующих в семьях. Но, если посмотреть на действительный коэффициент заболеваемости за последние годы, не останется сомнений в значительном непосредственном влиянии, оказанном вакцинами, даже в нынешнее время. Ниже приводится график отчета по заболеваемости корью начиная с 1920 года до сегодняшнего дня.

Заболеваемость корью в США с 1920 года до современности

В течение отчетных лет происходили периодические пики и спады заболеваемости, но реальный, устойчивый спад совпадает по времени с получением лицензии на использование вакцины против кори, начиная с 1963 года. Такой же график, построенный для других заболеваний, предотвращаемых с помощью вакцинации, демонстрируют аналогичную закономерность (исключение составляет только гепатит B*): значительный спад заболеваемости совпадает по времени с началом использования вакцины. Должны ли мы верить в то, что лучшие санитарные условия привели к снижению заболеваемости и это совершенно случайно совпадает по времени с началом применения вакцины?

Вакцина против инфекции, вызванной гемофильной палочкой типа b, представляет собой еще один прекрасный пример, так как болезнь, вызываемая этим, всего несколько лет назад была распространенным заболеванием до того момента, как в конце концов была изобретена вакцина, которую можно было прививать детям. (Прежнюю полисахаридную вакцину нельзя было прививать младенцам, между тем среди них данное заболевание встречалось чаще всего). Так как санитарные условия в 1990 были никак не хуже, чем сейчас, сегодняшнее практически полное исчезновения у детей заболевания, вызываемого гемофильной палочкой типа b (от приблизительно 20000 случаев в год до 1419 случаев в 1993, и имеющее тенденцию к дальнейшему снижению), тяжело приписать чему-либо еще, кроме вакцины.

Ветряная оспа тоже является хорошим примером для иллюстрации этого факта, так как современные санитарные условия не предотвращают почти 4.000.000 случаев заболевания ежегодно в США. Если бы заболевания исчезали сами собой, то можно было бы ожидать, что ветряная оспа должна исчезать вместе с остальными. Но практически все дети в США переносят это заболевание, точно так же, как и 20, и 80 лет назад. На основе опыта работы с вакциной против ветряной оспы до ее лицензирования, можно вскоре ожидать резкого падения коэффициента заболеваемости ветряной оспой, так как вакцина теперь получила лицензию на применение в США.

И, наконец, мы можем ознакомиться с опытом нескольких развитых стран, где снизился охват населения иммунизационными мероприятиями. Три страны - Великобритания, Швеция, и Япония значительно урезали применения вакцины против коклюша из-за своих опасений. Результат не заставил себя ждать. В Великобритании за снижением охвата иммунизацией в 1974 году последовала эпидемия среди более чем 100000 человек и это привело к 36 смертям из-за коклюша к 1978 году. В Японии, примерно в то же время, охват иммунизацией упал с 70% до 20-40%, что привело к росту заболеваемостью коклюшем с 393 случаев при нулевой смертности в 1974 году, до 13000 случаев и 41 смерти в 1979 году. В Швеции, годичная заболеваемость коклюшем на 100000 детей в возрасте от 0 до 6 лет возросла с 700 случаев в 1981 году до 3200 в 1985 г. Кажется очевидным из этих примеров, что заболеваемость не только перестанет снижаться, если мы прекратим вакцинацию, но будет возвращаться к прежнему уровню.

Большая эпидемия дифтерии происходит сейчас на территории бывшего Советского Союза, где низкий коэффициент первичной иммунизации среди детей и недостаточная бустерная иммунизация среди взрослого населения привели к росту числа заболеваний с 839 случаев в 1989 до почти 50000 случаев и 1700 смертей в 1994, и число случаев растет в 2-10 раз ежегодно. Уже имеется по меньшей мере 20 известных случаев в Европе и 2 случая в США, среди граждан, ранее работавших в бывшем СССР.

Большинство заболевших людей были полностью привиты.

Это другой довод, часто приводимый в анти-прививочной литературе - с его помощью противники вакцинаций стараются доказать, что вакцины неэффективны. Фактически, правда то, что во время вспышки число ранее вакцинированных лиц среди заболевших часто превышает число ранее невакцинированных - даже для таких вакцин, как вакцина против кори, про которую мы знаем, что она имеет эффективность 98% при правильном использовании.

Явный парадокс можно объяснить с помощью двух факторов. Во первых, нет 100% эффективных вакцин. Для того, чтобы вакцина была безопаснее заболевания, вирус убивается или ослабляется. По индивидуальным причинам, не все вакцинированные лица приобретают иммунитет. Большинство обычных детских вакцин имеют эффективность порядка 85-95%. Во вторых, в такой стране как Соединенные Штаты Америки, количество людей, получивших прививки, намного превышает число невакцинированных. Если мы рассмотрим гипотетический пример, сразу же станет ясно, как это два фактора работают вместе и приводят к тому, что большинство случаев во время вспышек эпидемии наблюдается среди привитого населения.

В школе учится 1000 учеников, никто из них ранее не болел корью. Почти все ученики (кроме 5) получили две дозы вакцины против кори и, таким образом, являются полностью привитыми. Поголовно все школьники контактировали с больным корью и каждый подверженный ученик заразился. Все 5 невакцинированных, конечно, заразились. Но мы можем ожидать несколько случаев неудачного вакцинирования среди 995 вакцинированных детей. Эффективность двух доз вакцины может достигать 99% и более, тогда в школе появится 7 случаев неудачной вакцинации, то есть зараженных учеников. Таким образом 7/12, или 58%, заболевших учеников будут полностью привиты.

Как Вы видите, это не доказывает того, что вакцина не работает - а говорит только о том, что большая часть детей в школе прошли вакцинацию, так что число случаев неудачной вакцинации превысило число невакцинированных. С другой точки зрения, 100% непривитых детей заразились, по сравнению с 1% вакцинированных. Вакцина против кори спасла почти всех учеников; если бы никто в школе не был привит, мы бы наблюдали 1000 случаев заболевания корью.

Есть такие “горячие серии” вакцины, которые связаны с большим количеством неблагоприятных побочных эффектов, чем другие. Родители должны узнавать номера этих серий и не дозволять прививать детей такими испорченными вакцинами.

Этот предрассудок стал весьма широко известен в последнее время, когда по телевизору стали обсуждать проблемы безопасности вакцин. Прежде всего, концепция “горячих серий” вакцин неверно используется в данном контексте. Это основано на предположении, что чем больше отчетов по данной серии вакцины поступает в ССНПВ** , тем более опасна вакцина в данной партии. Сверяясь со списком количества отчетов в ССНПВ для данной партии, родитель может определить те партии, которых следует избегать.

Это неверно по двум причинам:

ССНПВ - система сообщения неблагоприятных явлений проявляющихся во время получения прививки; отчеты ССНПВ не обязательно содержат информацию о случаях заболевания. Другими словами, отчет ССНПВ не означает того, что именно вакцина вызвала то или иное состояние. Статистически можно ожидать определенное количество серьезных заболеваний, даже смертей, чисто по случайной причине среди ранее привитых детей. Хотя известно, что вакцины вызывают незначительные побочные эффекты, такие как болезненные ощущения или жар, нет достаточных оснований полагать что применение вакцины  приводит к перманентным проблемам со здоровьем или к смерти. Вывод прост - тот факт, что нежелательные явления были сообщены в ССПДИ, еще не означает того, что явление было вызвано вакциной.

Партии вакцин не являются абсолютно похожими. Размер серии вакцины меняется от нескольких тысяч доз до нескольких миллионов, некоторые из них используются дольше остальных. Естественно, чем больше серия и чем дольше ее расходуют, тем больше будет случаев нежелательных явлений, чисто на статистической основе. Также, больше случайных смертей совпадающих по времени с вакцинацией происходит в младенческом возрасте, чем среди более взрослых детей, так как фоновая младенческая смертность высока в первый год жизни. Таким образом, знание того, что серия А связана с количеством нежелательных явлений Х, а серия В связана с количеством нежелательных явлений У, не даст Вам никакой информации об их относительной безопасности, даже если вакцина действительно вызвала события.

Ознакомление с опубликованными “горячими сериями” не поможет родителям избрать наилучшую вакцину для ребенка. Если количество и тип отчетов ССПДИ для какой-то конкретной серии вакцины указывает, что число нежелательных явлений или смертей совпадающих по времени с прививкой превысило ожидаемый по теории вероятности уровень, АППЛ (Администрация по Пищевым продуктам и Лекарствам) имеет право отозвать эту серию немедленно. До сегодняшнего дня еще не произошло случая отзыва вакцины по причине ее небезопасности на основе отчетов ССПДИ.

Каждый производитель вакцин и сама вакцина имеют лицензию АППЛ (Администрации по Пищевым продуктам и Лекарствам). Каждая партия проверяется на безопасность самим производителем. Результаты этих анализов поступают в АППЛ (Администрация по Пищевым продуктам и Лекарствам), где повторяются некоторые из анализов, как дополнительная мера предосторожности. АППЛ также проводит инспекцию завода-изготовителя вакцины с точки зрения строгости соблюдения технологии производства и указаний по тестированию продукта. АППЛ знакомится с еженедельными отчетами ССПДИ по каждой серии, выявляя необычные картины. АППЛ отзовет партию вакцины при первом же угрожающем знаке или проблеме. Нет никакой заинтересованности ни производителя, ни АППЛ в продолжении использования небезопасной вакцины. И так как прививки проводятся здоровым детям, американская общественность не позволила бы проводить их если бы вакцины не соответствовали самым высоким стандартам безопасности. Даже тот факт, что серия вакцины находится в использовании, уже означает то, что АППЛ считает ее безопасной.

Вакцины вызывают множество вредных побочных эффектов, болезней и даже смерть - не упоминая даже возможные долгосрочные эффекты, о которых мы даже не подозреваем.

В действительности вакцины абсолютно безопасны, несмотря на противоположенные утверждения в анти-прививочной литературе (в которой иногда приводится количество отчетов, получаемых ССПДИ, и это заставляет читателя верить, что это число представляет собой действительное число побочных эффектов). Подавляющее большинство нежелательных эффектов не тяжелые и быстро проходящие, как боль в плече и умеренный жар. Эти явления зачастую можно контролировать, принимая парацетомол до или после вакцинации. Более серьезные нежелательные эффекты случаются очень редко (порядка одного раза на тысячу или одного раза на миллион доз), а какие-то настолько редки, что нельзя точно оценить степень риска. Что касается смерти из-за вакцин, то в действительности происходит настолько мало смертей, которые вероятно возможно связать с вакцинами, то эти данные очень трудно интерпретировать статистически. Из всех смертей, попавших в отчеты ССПДИ, в период с 1990 по 1992, только одну можно отдаленно связать с вакциной. Каждый случай смерти, попавший в отчет ССПДИ, тщательно изучается для определения того, явилась ли новая проблема, связанная с вакциной, причиной смерти, но существует ничтожно мало доказательств в пользу гипотезы о вакцине как о причине смерти. В отчете Института Медицины за 1994 год указано, что риск смерти по причине вакцины “черезвычайно низок”.

Вакцина АКДС и синдром внезапной смерти Детей.

Есть один долгоживущий миф о том, что вакцина АКДС вызывает Синдром Внезапной Смерти Детей(СВСД). Это убеждение пришло от того, что какая-то часть случаев Синдрома Внезапной Смерти Детей случается после проведения прививки АКДС; при поверхностном рассмотрении кажется, что это есть доказательство причинной связи между двумя событиями. Но это порочная логика; с таким же успехом вы можете сказать, что потребление хлеба вызывает автомобильные катастрофы, так как доказано, что большинство водителей ели хлеб за 24 часа до катастрофы.

Если Вы предположите, что большинство случаев Синдрома Внезапной Смерти Детей происходят в тот же период, когда проводится серия из 3-х прививок АКДС, то Вы можете ожидать, что АКДС предварят куда более значительное число Синдрома Внезапной Смерти Детей  по чистой случайности. Фактически, при проведении хорошо контролируемого исследования в 1980-х годах, было обнаружено, почти анонимно, что определенное число случаев Синдрома Внезапной Смерти Детей, совпадающих по времени с прививкой АКДС, находилось в допустимых теорией вероятности границах и могло произойти чисто случайно. Другими словами, эти смерти могли бы все равно произойти по теории вероятности даже при отсутствии прививки АКДС. Фактически, в некоторых исследованиях посвященных изучению состояния здоровья детей непосредственно после прививки АКДС, было показано, что для них вероятность Синдрома Внезапной Смерти Детей даже меньше. Отчет Института Медицины гласит “все контролируемые исследования показывают, что при сравнении групп привитых и непривитых детей с точки зрения Синдрома Внезапной Смерти Детей не было найдено связи...или же уменьшение риска... Синдрома Внезапной Смерти Детей среди привитых ”, и делается вывод, что “нет доказательств причинной связи между АКДС и Синдромом Внезапной Смерти Детей.”

Но еще недостаточно просто рассматривать риск - надо рассматривать риск вкупе с приносимой вакцинацией пользой. При отсутствии пользы от вакцинации даже один нежелательный эффект на миллион прививок не может быть оправдан. Если бы вообще не существовало вакцин, было бы намного больше случаев заболеваний, и вместе с ними, больше серьезных побочных эффектов, включая смерть. Например, при исследовании вопроса о риске и пользе прививок АКДС было показано, что при отсутствии прививок в США произошло бы 71-кратное возрастание числа случаев заболевания коклюшем и почти 4-кратное возрастание смертей по причине коклюша. Сравнение риска связанного с заболеванием и риска связанного с вакциной, которая защищает от этого заболевания, может помочь нам получить представление о пользе, которую мы получим при вакцинации наших детей.

Очевидно, что вероятность того, что ребенок получит серьезные проблемы со здоровьем из-за заболевания гораздо больше, чем вероятность того, что ему повредит вакцина. Хотя, если по причине вакцинации происходит хоть какая-нибудь проблема, это уже слишком много, ясно, что польза, приносимая вакцинацией, намного превосходит незначительный риск, и намного большей ущерб был бы нанесен обществу, значительно большее число смертей бы произошло если бы прививок не было. В действительности, было бы бессовестно иметь такое эффективное медицинское средство для предупреждения заболеваний, как вакцинация и не воспользоваться им.

Служба Общественного Здравоохранения США проводит исследования для определения того, какие нежелательные явления, связываемые с вакцинами, действительно вызваны вакцинами, и как в дальнейшем уменьшить и так незначительный риск этих серьезных нарушений.

Заболевания, предотвращаемые вакцинами, практически уничтожены на территории США, так что нет необходимости прививать моего ребенка.

Правда то, что вакцинация дала нам возможность довести заболеваемость в США по многом болезням до очень низкого уровня. Однако, некоторые из заболеваний все еще весьма распространены - даже на уровне эпидемии - в других частях света. Путешественники могут неосознанно привезти заболевания в США, и, если мы не предохраним себя вакцинацией, эти заболевания могут быстро распространиться среди населения и вызвать эпидемию. В то же время, те относительно немногочисленные случаи, регистрируемые в США в настоящее время, могут быстро стать десятками или сотнями тысяч случаев без защиты вакцинами.

Есть две причины, по которым мы должны получать вакцины даже в настоящее время. Первая причина - для самозащиты. Даже если мы полагаем, что опасность заболевания мала, болезни все еще существуют и могут поразить любого из непредохранившихся. Несколько лет назад в Калифорнии был такой случай: ребенок только пошел в школу, заразился дифтерией и умер. Он был единственным непривитым учеником в классе.

Вторая причина для вакцинации - защита ваших близких. Есть небольшое количество людей, которые не могут получать прививки (например, из-за серьезных аллергических реакций на определенные компоненты вакцины) и существует малое количество неудачных вакцинаций. Эти люди подвержены заболеваниям и у них есть только одна надежда защитить себя, если окружающие их иммунны и не переносят заболевания. Успешная программ вакцинации , как и успешное общество, зависит от сотрудничества каждого члена в целях общественного блага. Все согласятся с тем, что было бы крайне безответственно, если бы водитель игнорировал правила дорожного движения на том основании, что другие водители будут вести себя осторожно и объезжать его. Аналогично, мы не должны полагаться на окружающих нас людей в деле остановки распространения заболевания, если мы не делаем все то, что обязаны.

Если сделать ребенку одновременную прививку от нескольких заболеваний сразу, то это создает риск вредных побочных эффектов может перегрузить иммунную систему.

Дети каждый день подвергаются влиянию многих антигенов. Обычное потребление пищи приносит новые бактерии в тело, и множественные бактерии живут в носу и во рту, подвергая иммунную систему воздействию еще большего количества антигенов. Простое ОРЗ подвергает ребенка воздействию от 4 до 10 антигенов, а в случае “стрептококковой ангины” от 25 до 50. В отчете Института Медицины за 1994 год “Неблагоприятные События, Связанные с Детскими Вакцинами” записано: “в свете этих событии кажется невероятным, что число отдельных антигенов в детских вакцинах...будет представлять значительную дополнительную нагрузку на иммунную систему и иметь иммуноподавляющий эффект”. И, разумеется, доступная научная информация показывает отсутствие нежелательных эффектов при одновременной вакцинации множественными вакцинами для нормальной иммунной системы ребенка.

Для изучения влияния комбинации вакцин было проведено большое число исследований. Фактически, ни Консультативный Комитет по Вакцинопрофилактике (ККВ), ни Американская Академия Педиатрии (ААП) не дали бы рекомендаций по одновременному применению никаких вакцин до того, как исследования показали, что комбинация эффективна и безопасна. Такие исследования показали, что рекомендованные вакцины так же эффективны в сочетании, как и по отдельности, и такая комбинация не дает увеличения риска появления нежелательных побочных эффектов. Следовательно, и Консультативный Комитет по Вакцинопрофилактике (ККВ), и Американская Академия Педиатрии (ААП) рекомендуют одновременное применение обычных вакцин там, где это необходимо. Проводятся исследования для нахождения путей комбинации большего количества антигенов в одном шприце (например, Тривакцина Корь-Паротит-Краснуха и вакцина против ветряной оспы). Это будет иметь все достоинства отдельных вакцин, но потребует меньше уколов.

Есть два практических фактора, говорящих в пользу одновременной вакцинации в течение одного посещения врача. Во-первых, мы хотим привить ребенка в самом раннем возрасте, чтобы он был защищен в наиболее опасные ранние месяцы своей жизни. Это обычно означает применение инактивированных вакцин начиная с 2 месяцев жизни и живых вакцин с 12 месяцев. Таким образом, необходимое время прививок различных вакцин совпадает. Во-вторых, если будет можно делать прививку несколькими вакцинами за одно посещение врача, это будет означать меньше посещений поликлиники, что сохранит время и деньги и будет меньше травмировать ребенка.

* Заболеваемость гепатитом B еще не упала настолько значительно, по причине того. что младенцы, которых мы начали прививать с 1991 года, не попадают в категорию повышенного риска до того, как они достигнут хотя бы подросткового возраста. Таким образом, мы ожидаем проявления желаемого результата  через приблизительно 15 лет после начала всеобщей иммунизации новорожденных.

** Система Сообщения о побочном действии иммунизации  (ССПДИ) получает сообщения от врачей и пациентов о побочных эффектах происходящих после проведения прививок.

Рубрики: За вакцинациюМетки: АКДС, вакцинация, гепатит, дети, иммунитет, коклюш, корь, оспа, побочные эффекты, ребенку, смертность, эпидемия Комментариев нет

Добавить комментарий

antivakcina.org

аттенуированные бактерии bordetella pertussis, вакцина против возбудителя коклюша - патент РФ 2455024

Изобретение раскрывает аттенуированные бактерии В. pertussis, содержащие мутантные гены ptx и dnt, не проявляющие активности дермонекротического токсина, но сохранившие способность связывания с рецептором эукариотической клетки. Бактерии по изобретению продуцируют генетически измененную иммунологически активную нетоксичную токсоидную форму коклюшного токсина. Изобретение касается штамма бактерий В.pertussis, содержащего указанные мутантные гены, который депонирован в Коллекции штаммов НИИЭМ им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи под номером 171/331 В.р KS-4. Штамм может быть использован в качестве вакцины. Вакцина против возбудителя коклюша содержит живые аттенуированные бактерии или инактивированные аттенуированные бактерии В.pertussis. Интраназальная иммунизация вакциной, содержащей живые или инактивированные аттенуированные бактерии В.pertussis по изобретению, проведенная в эксперименте in vivo, обеспечивает эффективную и пролонгированную защиту от заражения вирулентным штаммом возбудителя коклюша. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 5 пр.

Рисунки к патенту РФ 2455024

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается аттенуированных бактерий В.pertussis, содержащих нокаутную мутацию в гене dnt и продуцирующих нетоксическую, иммунологически активную, токсоидную форму коклюшного токсина, их применению в качестве живой и инактивированной вакцин и вектора для поливалентной вакцины. Интраназальная иммунизация мышей живыми и инактивированными аттенуированными бактериями B.pertussis обеспечивает эффективную и пролонгированную защиту от заражения вирулентным штаммом возбудителя коклюша.

Уровень техники

Вакцинация против коклюша в течение многих лет проводится коклюшной корпускулярной вакциной (ККВ). ККВ обеспечивает защиту от заболевания более 85% привитых детей. Тем не менее, из-за возникающих разнообразных побочных реакций после вакцинации в ряде развитых стран, а также у нас в стране, наблюдалось снижение охвата детского населения прививками. Как следствие, увеличилась заболеваемость не только новорожденных детей, но и детей школьного возраста и взрослых, особенно, находящихся в контакте с детьми в организованных коллективах [Centers for Disease Control and Prevention. Pertussis United States, 1997-2000. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2002, 51:73-76].

Детальное изучение иммунобиологических свойств возбудителя коклюша позволило установить роль конкретных факторов вирулентности в патогенезе заболевания, формировании иммунного ответа и разработать менее реактогенные бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ). Показано, что ведущим фактором, определяющим патогенез, клинику заболевания и обеспечивающим формирование иммунитета, является коклюшный токсин (КТ).

Используемые в настоящее время бесклеточные KB значительно различаются по составу антигенов коклюшного микроба, методам их очистки и обезвреживания KT [Mooi, F.R., I.H. van Loo, A.J.King. Emerg. Infect. Dis. 2001, 7:.526-28]. При производстве БКВ используются трудоемкие и дорогостоящие технологические операции, а их хранение требует специальных условий. Несмотря на то, что бесклеточные KB, по сравнению с ККВ, обладают более низкой реактогенностью, отмечены случаи неврологических осложнений и смертей новорожденных, связанные с вакцинацией БКВ [Чупринина Р.П., Озерецковский Н.А., Алексеева И.А., 2001, 3:19-22]. Эффективность поликомпонентных БКВ и высокий стабильный уровень защитной активности ККВ подтверждает важную роль в защите против коклюша белков, связанных с наружной мембраной клетки, в частности филаментозного гемагглютинина, пертактина, агглютиногенов 2 и 3.

Опыт применения моно- и поликомпонентных БКВ показал, что их низкая реактогенность обусловлена, в частности, практически полным отсутствием в препаратах термолабильного или дермонекротического эндотоксина (ДНТ). Этот факт позволяет предположить, что бактерии, не продуцирующие эндотоксин, наиболее перспективны для производства безвредных вакцин, интраназальное введение которых будет нивелировать и отрицательный эффект липополисахарида. Наблюдения за профилактической эффективностью противококлюшных вакцин в течение последних 20 лет свидетельствуют о том, что иммунитет после вакцинации БКВ сохраняется не более 4-х лет, после иммунизации ККВ 5-6 лет, а после перенесенного заболевания продолжительность напряженного иммунитета достигает 10 лет [Guiso.N, Njamkepo Е., Vié Ie Sage.F, et al. Vaccine. 2007, 25:1390-13907; Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews. 2005, 18:326-382; Purdy K..W, Hay J..W, Botteman M..F, Ward J..I. Clin Infect Dis. 2004, 39:29-30].

Таким образом, максимальная длительность и напряженность иммунитета, скорее всего, могут быть обеспечены в результате использования для массовой вакцинации (ревакцинации) детей и взрослых живой вакцины интраназального применения, созданной на основе полноценных аттенуированных бактерий В.pertussis. Возможность разработки такой вакцины продемонстрирована в ряде исследований [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. PLoS Pathogens. 2006, 2:0662-70; Stevenson A, Roberts M. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003, 37:121-128]. Показано также, что бактерии В.pertussis могут быть использованы в качестве вектора для конструирования поливалентных живых вакцин, предназначенных для интраназальной иммунизации. Интраназальная иммунизация животных бактериями, продуцирующими гетерологичные антигены, сопровождается выработкой IgG и IgA как против филаментозного гемагглютинина B.pertussis, так и против слитых с ним гетерологичных антигенов. При этом антитела обнаруживаются не только в сыворотке крови, но и в выделениях генитального тракта мышей [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. PLoS Pathogens. 2006, 2:0662-70; Stevenson A., Roberts M. FEMS Immunol. Med.Microbiol. 2003, 37:121-128].

Направленная аттенуация бактерий B.pertussis путем конструирования мутантов B.pertussis, продуцирующих токсоид КТ, описана ранее [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Однако одним из существенных недостатков указанного аттенуированного штамма является способность продуцировать дермонекротический токсин, кодируемый геном dnt, являющийся одним из факторов патогенности бактерий рода Bordetella, определяющим реактогенность вакцины. Как отмечено выше, дермонекротический токсин, кодируемый последовательностью хромосомы dnt, является второй важной мишенью для снижения токсичности бактерий рода Bordetella. Гены dnt присутствуют в хромосомах практически всех представителей рода Bordetella и почти не отличаются друг от друга [Kashimoto Т., Katahira J., Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Parkhill J., Sebaihia M., Preston A. et al. Nat. Genet. 2003, 35:32-4; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71; Schmidt G., U.M. Goehring, J. Schirmer, et al. J. Bio Chem. 1999, 274:31875-3188]. Исключение составляют некоторые штаммы, так называемого комплекса IV В. bronchiseptica, выделенные от людей и утратившие ген dnt [Diavatopoulos D.A., Craig A. et al. PLOS Pathogens. 2005, 1:373-383]. Синтез ДНТ находится под контролем bvg-локуса. Bvg- клетки B.pertussis не продуцируют ДНТ [Stibitz S., Miller J.F. In V.L.Miller, J.B.Kaper, D.A.Portney, R.R.Isberg (ed.), Molecular genetics of bacterial pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1994, 407-422]. Нет данных, указывающих на участие ДНТ в формировании иммунного ответа. Дермонекротический, термолабильный или летальный мышиный токсин представляет собой белковую молекулу, состоящую из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 140 кДа. ДНТ является эндотоксином, локализован в цитоплазме и клеточной стенке бактерий, инактивируется нагреванием при 56°С [Horiguchi Y, Nakai Т, Kume К.. Infect. Immun. 1991, 59: 1112-1116; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J.Cell Sci. 1995, 108:3243-51; Kashimoto Т, Katahira J, Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71]. При внутрикожном введении животным ДНТ вызывает некрозы. После внутривенного и внутрибрюшинного введения животным ДНТ наблюдаются значительные некрозы, кровоизлияния, отеки и дегенеративные изменения в печени, почках, селезенке. Сообщалось, что ДНТ ингибирует активность щелочной фосфатазы и уменьшает накопление коллагена 1 типа в остеобласто-подобных клетках. Предполагается, что ДНТ может влиять на способность клеток к дифференциации, стимулирует синтез ДНК и белка, что является следствием модификации GTF- связывающего белка RhoA эукариотических клеток [Horiguchi Y., Nakai Т., Kume К. Infect. Immun. 1991, 59:1112-1116; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J. Cell Sci. 1995, 108:3243-51]. Картирована область ферментативного центра и участка, ответственного за связывание ДНТ с рецептором эукариотической клетки [13, 20]. Роль ДНТ в патогенезе коклюша изучена недостаточно. Предполагается, что ДНТ принимает участие в приживлении и колонизации коклюшного микроба [Diavatopoulos D.A., Craig A. et al. PLOS Pathogens. 2005, 1:373-383; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J. Cell Sci. 1995, 108:3243-51].

Известен аттенуированный штамм Bordetella pertussis, содержащий мутацию в гене ptx, делецию гена dnt и гетерологичный ген ampG, продукт которого значительно снижает количество трахеального цитотоксина (WO/2007/104451). В экспериментах на новорожденных мышах показано, что штамм способен индуцировать иммунный ответ у лабораторных животных. Однако защитные свойства аттенуированного тройного мутанта Bordetella pertussis оценивались по способности бактерий вирулентного штамма размножаться в носоглотке и легких мышей после их интраназальной вакцинации аттенуированными бактериями, что не соответствует тесту, рекомендованному Всемирной Организацией здравоохранения и используемому в большинстве стран, включая Россию, для оценки протективности коклюшной вакцины. Несоответствие условий анализа протективности международным стандартам (в значительной степени заниженные дозы заражения бактериями вирулентного штамма, способ заражения и метод оценки протективности) не позволяют оценить пригодность известного аттенуированного тройного мутанта Bordetella в качестве кандидата живой вакцины.

Раскрытие изобретения

Авторами настоящего изобретения впервые предложен штамм аттенуированных бактерий B.pertussis, не проявляющих активности дермонекротического токсина и продуцирующих генетически измененную иммунологически активную нетоксичную, токсоидную форму коклюшного токсина, способный обеспечивать при интраназальном способе вакцинации эффективный иммунитет против вирулентного штамма бактерий B.pertussis.

Другой аспект изобретения касается живой вакцины против возбудителя коклюша B.pertusis на основе аттенуированного двойного мутанта B.pertusis KS. Еще один аспект изобретения касается инактивированной цельноклеточной (корпускулярной) вакцины на основе аттенуированного штамма, содержащего мутантные гены ptx и dnt.

Еще один аспект изобретения касается использования аттенуированного штамма Bordetella в качестве вектора при создании поливалентной вакцины для профилактики или лечения инфекций, вызываемых различными патогенами, в частности возбудителем туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis).

В еще одном аспекте изобретение обеспечивает штамм аттенуированных бактерий В.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, деропонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» № 171/331 B.p KS-4.

Краткое описание чертежей

Фиг.1а. Схема конструирования и структура рекомбинантной плазмиды pKS1.

Стрелками обозначены последовательности генов в составе рекомбинантных плазмид: cat - серая, dnt - черная, bla - незакрашенная, tet - косая штриховка. Ломаными линиями обозначены положения праймеров Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Др (Tcg ttc aac аса tcc aag gc), использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt.

Фиг.1б. Схема конструирования и структура рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3.

Стрелками обозначены последовательности генов в составе рекомбинантных плазмид: cat - серая, dnt - черная, bla - незакрашенная, tet - косая штриховка. Ломаными линиями обозначены положения праймеров Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Др (Tcg ttc aac аса tcc aag gc), использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt.

Фиг.2. Схема аллельного обмена между копиями фрагментов мутантных (плазмида и pKS3) и нативных (хромосома B.pertussis 5) последовательностей гена dnt. Структура фрагмента хромосомы KS B.pertussis, содержащего мутантный ген dnt.

Ломаными линиями обозначены положения праймеров использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt. Длинные линии на верхней части рисунка фланкируют участки последовательности гена dnt, участвующие в гомологичной рекомбинации в процессе аллельного обмена.

Фиг.3. Электрофорез продуктов ПЦР ДНК B.pertussis KS.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение впервые обеспечивает аттенуированные бактерии B.pertussis, не проявляющие активности дермонекротического токсина, коклюшного токсина и общей токсической активности, но сохранивших способность связывания с рецепторами эукариотической клетки (мутацией не затронута область гена dnt, кодирующая участок связывания токсина с рецептором эукариотической клетки) и продуцирующих генетически измененную иммунологически активную нетоксичную, токсоидную форму коклюшного токсина (оперон ptx), причем аттенуированные двойные мутанты B.pertussis являются нереактогененными и обеспечивает эффективную защиту лабораторных животных, вакцинированных интраназально, против интрацеребральной инфекции вирулентным штаммом B.pertussis.

В одном из аспектов изобретение направлено на аттенуированные бактерии В.pertussis KS, несущие нокаутную мутацию в гене dnt, сконструированные на основе описанного ранее мутанта В.pertussis 5, продуцирующего токсоид КТ (Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009). Согласно современной классификации бактерии исходного вирулентного штамма В.pertussis 173 и мутанта В.pertussis 5 относятся к генотипу ptxS1A4, соответствующему генотипу большинства штаммов бактерий B.pertussis, используемых на протяжении последних 60 лет для производства противококлюшных вакцин в РФ и ряде зарубежных стран [Borisova. О; Kombarova S.Y.; Zakharova, N.S. et al. Clin vaccine Immunol. 2007; 14:234-238; Audrey J King, Tamara van Gorkom, Jeroen L.A.; Penningsye at al. BMC Genomics. 2010; 11:196]. В качестве бактерий используемых для конструирования двойных мутантов, содержащих описанные мутации в опероне ptx и гене dnt, могут быть использованы не только бактерии B.pertusis 173 и B.pertusis 5, имеющие генотип ptxS1A4, но и бактерии с другими генотипами, в частности ptxS1 A1, выделяемые от больных коклюшем в настоящее время.

Согласно предложенному изобретению для мутагенеза была выбрана область гена dnt, кодирующая токсический центр белка. В отличие от описанной ранее делеции [Kashimoto Т., Katahira J. Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Pullinger G.D., Adams Т.Е. , Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71] используемая согласно изобретению инсерция последовательности гена cad в Tth2111 сайт гена dnt не затрагивает область гена, кодирующего участок связывания ДНТ с рецептором эукариотической клетки.

Конъюгативная плазмида pKS3, несущая фрагмент последовательности dnt, содержащий инсерцию гена cad и не реплицирующаяся в клетках микроорганизмов рода Bordetella, получена для конструирования аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, согласно изобретению (Фиг.1б, пример 2). Бактерии B.pertussis, содержащие мутации ptxS1 и нокаутную мутацию dnt в хромосоме, сконструированы в результате аллельного обмена между природной копией оперона dnt в составе хромосомы реципиента и мутантной копией в составе плазмиды pKS3 (фиг.2, пример 3). Плазмиду pKS3 передавали в бактерии B.pertussis в результате скрещивания S17 Е.coli/pKS3XKmRRifR и В. pertussis 5. Локализация инсерции последовательности в гене dnt подтверждена путем проведения ПЦР на ДНК хромосомы трансконъюганта с праймерами Дфв (Gct gct ggg caa tgt gtt cg) - Cp (Ctc aat gta cct ata acc aga. ccg ttc) (фиг.3, пример 3).

Таким образом, в соответствии с изобретением сконструированы бактерии B.pertussis KS, содержащие мутантный оперон ptx, инсерцию гена kan, расположенную вблизи мутантного оперона в участке, не оказывающем влияния на экспрессию оперона ptx или транспорт субъединиц рекомбинантного белка через бактериальную стенку, и инактивированную инсерцией гена cad последовательность гена dnt.

В еще одном аспекте изобретение обеспечивает штамм аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, деропонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» под № 171/331 B.p KS-4.

Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого аттенуированными бактериями B.pertussis согласно изобретению, была оценена в экспериментах по определению степени лейкоцитоза и гистаминсенсибилизации у мышей и эффекта образования кластеров клеток СНО, результаты представлены в табл.1.

Из данных, представленных в табл.1, видно, что количество КТ, продуцируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS, практически не отличается от количества КТ, продуцируемого бактериями вирулентного штамма B.pertussis 173. Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS согласно изобретению, напротив, значительно отличается от специфической токсической активности КТ, синтезируемого бактериями вирулентного штамма B.pertussis 173. Аттенуированные бактерии B.pertussis, синтезирующие мутантный КТ, вызывают более низкий лейкоцитоз (ЛСА 21×103 против 63×103), гистаминсенсибилизацию у мышей (ГСД50 2.4×109 против 6,9×10 3) и эффект образования кластеров клеток СНО при значительно большей концентрации токсоида, чем КТ, продуцируемый природными вирулентными бактериями (одинаковый кластер-эффект при концентрации токсина меньшей в 104 раз, чем токсоида).

Определение токсической активности ДНТ рекомбинантных клеток B.pertussis KS определяли в опытах на животных (морских свинках и мышах), результаты представлены в табл.2.

Данные, представленные в табл.2, демонстрируют, что аттенуированные рекомбинантные бактерии B.pertussis KS, в отличие от бактерий исходного вирулентного штамма 173 и бактерий B.pertussis 5, не вызывают гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах.

Общую токсичность аттенуированных бактерий B.pertussis KS согласно изобретению, характеризующую действие на организм мышей всех токсинов возбудителя коклюша, в том числе и цитотоксина, определяли в соответствии с требованиями РФ после введения инактивированной прогреванием бактериальной суспензии лабораторным мышам внутрибрюшинно [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. Результаты теста изменения массы тела мышей (табл.3) показали, что в отличие от инактивированных бактерий вирулентного штамма B.pertussis 173, живые аттенуированные бактерии B.pertussis KS при внутрибрюшинном введении 10 МОЕ (Международный оптический стандарт микробных клеток, 1 МОЕ соответствует 1 миллиарду микробных клеток) в 0,5 мл 0,85% раствора хлорида натрия проявляли низкую токсичность.

Защитные свойства бактерий определяли по проценту выживаемости мышей при иммунизации их определенным количеством микробных клеток в соответствии с международными стандартами, принятыми в РФ [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов В.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва], результаты представлены в табл.4.

Таблица 4
Защитные свойства живых аттенуированных бактерий B.pertussis штамма KS, введенных мышам интраназально при интрацеребральном заражении высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323.
Штамм B.pertussis (фенотип)	Количество м.к.×109.
0,5	0,1	0.02	0,004
173 (PT+ , NT+)	16/16	16/16	11/16	10/16
KS (PT*, DNT-)	16/16	16/16	10/16	9/16
0,85% р-р NaCl	-		-

При интраназальной иммунизации мышам вводили от 4 до 500 млн живых микробных клеток в 25 мкл, однократно. Через 14 дней после иммунизации мышей заражали интрацеребрально высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323. В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3 (Отраслевой стандартный образец корпускулярной коклюшной вакцины, ГИСК им.Л.А.Тарасевича), который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве 10 МОЕ. После интрацеребрального заражения мышей высоковирулентным штаммом 18323 наблюдали защиту от гибели от 80 до 100% в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации.

Еще один аспект изобретения касается использования аттенуированных двойных мутантов B.pertusis KS в качестве живой вакцины против возбудителя коклюша B.pertusis. Вакцина согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель, а также адъюванты, например двуокись алюминия. Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются, фосфатным буфером, дистиллированной водой, эмульсиями "масло в воде" и т.п. Предпочтительно вакцина согласно изобретению вводится интраназально в одной дозе.

Еще один аспект изобретение касается инактивированной цельноклеточной вакцины на основе аттенуированных бактерий, содержащих мутантные гены ptx и dnt. Инактивация живых бактерий аттенуированного двойного мутанта B.pertusis KS производится с помощью обработки гексаметилентетрамином (ГМТА) в соответствии с описанным ранее методом (Авт. свид. № 1497802). Токсическую активность определяли в опытах на мышах, морских свинках и кроликах, результаты экспериментов приведены в табл.4 и 5 (Пример 5). Данные, представленные в таблицах 4 и 5, демонстрируют, что корпускулярная вакцина, содержащая инактивированные аттенуированные рекомбинантные бактерии B.pertussis KS, не имеет специфической активности коклюшного и дермонекротического токсинов (уровень ЛСА и ГСА ниже, чем у ОСО-3), не вызывает гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах.

Защитные свойства корпускулярной вакцины на основе инактивированных аттенуированных бактерий B.pertussis KS определяли при интрацеребральном заражении высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323 (табл.6, пример 5). В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем опытным образцам - 0,5; 0,1; 0,02×109 микробных клеток. После внутрибрюшинного введения животным инактивированных бактерий B.pertussis KS, в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали защиту мышей от 80 до 100% от последующего интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.

Инактивированная цельноклеточная вакцина согласно изобретению может содержать перечисленные выше фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель, используемые для живой вакцины, а также адъюванты, например двуокись алюминия. Инактивированная цельноклеточная вакцина согласно изобретению вводится подкожно.

В еще одном из аспектов изобретение обеспечивает поливалентную вакцину на основе аттенуированных двойных мутантов Bordetella pertussis в качестве вектора. Поливалентный вакцинный штамм В. pertussis продуцирует антигены возбудителя туберкулеза ESAT-6, CFP-10 и Ag85A (заявки на патент РФ 2010123879, 2010123883, 2010123865, соответственно) в составе слитого комплекса с адгезином FGA или/и автотранспортным белком BrkA возбудителя коклюша. Белки ESAT-6, CFP10 и Ag85A экспонированы на С-конце химерного белка, что обеспечивает их представление на поверхности бактерии-вектора и сохранение их иммуногенных свойств, и, как следствие, индукцию выработки специфических защитных антител против возбудителя коклюша и основных протективных антигенов возбудителя туберкулеза при интраназальном введении человеку.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний.

Пример 1. Бактериальные штаммы E.coli, В.pertussis и условия их культивирования

Штаммы В. Pertussis 173 [Rifr, Серовар 1.2.3.7.13., ЛСА (40-50)], полученный из коллекция штаммов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, и B.pertussis 5 [Rifr, Kmr, Серовар 1.2.0.7.13; ЛСА 17-20 т., ptx(M)], а также бактерии B.pertussis KS [Rif r, Kmr, Cmr, DNT], полученные согласно изобретению, выращивались на среде Борде-Жангу с добавлением 10% дефибринированной крови барана и жидкой питательной среде типа Коен-Уиллер.

Штаммы E.coli S17-1 pir [TprSmr recA, thi, pro, hsdR-M + RP4:2-Tc:Mu::Km Tn7 pir], E.coli Dh5 [F, Ф80dА (lacZ)ml5, recAl, endAl, gyrA96, thi-1 hsdR17(r k--mk+), supE44, relAl, glnV44, deoR, (lacZYA-argF)U169], E.coli Dh5 CmrApr/pBScad, полученные из коллекции штаммов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, и штаммы E.coli Dh5 /pKS1, E.coli Dh5 /pKS2, E.coliS17-1 pir)/pKnock-Tc и E.coli S17-1 pir/pKS3, полученные согласно изобретению, выращивались в жидкой или на агаризованной среде «L», казеиновоугольном агаре (КУА). Антибиотики добавляли в концентрациях (мкг/мл): ампициллин - 100; канамицин - 25, рифампицин - 100, хлорамфеникол - 25, тетрациклин - 20.

Пример 2. Конструирование плазмиды для рекомбинационного обмена между копиями нативного и мутантного генов dnt

Для конструирования плазмиды с целью рекомбинационного обмена между копиями нативного и мутантного генов dnt был использован конъюгативный вектор pKnock - Тс [Tet ori-R6K mob RP4], не способный реплицироваться в бактериях рода Bordetella [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Схема конструирования плазмиды pKS3 и ее структура представлены на фиг.1б. Плазмида pKSl [pGEM (dnt)], содержащая последовательность гена dnt, инактивированную инсерцией гена cad (Фиг.1а), получена в результате клонирования продукта ПЦР ДНК B.pertusis-5 с праймерами Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg) и, Дp (Tcg ttc aac аса tcc aag gc) в вектор pGem (PromegaUSA) и последующей интеграции гена cad (фрагмента Acc1 плазмиды pBScad) в TthlllI сайт гена dnt (плазмида pKS2). Структура рекомбинантной плазмиды pKS2 представлена на Фиг.1б. Плазмида pKS3 получена в результате переклонирования (SaeII-NotI) фрагмента плазмиды pKS2 в соответствующие сайты плазмиды pKnock-Tc (фиг.1б). Структура рекомбинантных плазмид подтверждена с помощью рестрикционного анализа и ПЦР с использованием различных сочетаний праймеров

Рестрикционный анализ, лигирование, электрофорез ДНК, клонирование последовательностей ДНК проводили в соответствии с методическим руководством Маниатиса с соавт. [Маниатис Т., Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 1984]. Выделение ДНК плазмид, хромосомы и продуктов ПЦР из геля проводили с помощью систем Wizard Plus SV MiniPrepsDNA purification system (Promega США), Wizard Plus MiniPrepsDNA purification system (Promega США) и Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе «Терцик» (Россия) при использовании праймеров, синтезированных АО "Синтол".

Пример 3. Конструирование бактерий В.pertussis SK, содержащих мутантный ген dnt в составе хромосомы

Трансформацию клеток E.coli ДНК плазмид и лигированной смесью проводили в соответствии с методическим руководством Маниатиса с соавт. [Маниатис Т., Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 1984]. Скрещивание между бактериями E.coli S17 и В.pertussis проводили в соответствии с методическим руководством Миллера [Миллер Дж. В. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир, Москва, 1984. 436]. В качестве реципиента для конструирования аттенуированных бактерий использовался охарактеризованный ранее KmRRif R штамм В.pertussis 5, содержащий мутацию в гене ptx.

Бактерии В.pertussis, содержащие мутации ptxS1 и нокаутную мутацию dnt в хромосоме, сконструированы в результате аллельного обмена между природной копией оперона dnt в составе хромосомы реципиента и мутантной копией в составе плазмиды pKS3 (фиг.2). Плазмиду pKS3 передавали в бактерии В.pertussis в результате скрещивания S17 E.coli/pKS3XKmRRifR и В.pertussis 5. После трехкратной расчистки на среде КУА с хлорамфениколом бактерии проверяли по маркерам антибиотикоустойчивости, наличию плазмидной ДНК и последовательностей генов kan, cad и dnt в ПЦР с праймерами Все проверенные бактериальные клоны трансконъюгантов имели фенотип СmR KmR RifR, не содержали плазмидного маркера устойчивости к тетрациклину и плазмидной ДНК. В ПЦР ДНК хромосомы, выделенной из бактерий трансконъюгантов, с праймерами Сф-Ср, и Кф-Кр показано наличие последовательностей, кодирующих устойчивости к канамицину и хлорамфениколу. В результате ПЦР ДНК хромосомы трансконъюгантов с праймерами Дфв-Дрв выявлены фрагмент размером 2380 п.о. и фрагмент размером 870 п.о., что соответствует размеру фрагмента dnt, содержащего вставку гена cat (фиг.3).

Для подтверждения локализации инсерции последовательности в гене dnt проведена ПЦР на ДНК хромосомы трансконъюганта с праймерами Дфв-Ср (фиг.3). Так как праймер Дфв (Ccg caa tgg gcc gag ctg tt) расположен за пределами фрагмента dnt, клонированного в составе плазмиды pKS3, то в результате ПЦР с праймерами Дфв-Ср образуется специфический продукт размером 870 п.о. только при наличии инсерции последовательности cad в сайт TthlllI последовательности dnt. Специфичность полученных продуктов подтверждена результатами рестрикции эндонуклеазами АсcI и SalGI. Определение последовательности гeнa ptxS1 в составе хромосомы аттенуированных бактерий B.pertussis KS подтвердило наличие замен Arg9-Lys9 и Glul29-Glyl29 в области, кодирующей ферментативный центр КТ.

Таким образом, в соответствии с изобретением сконструированы бактерии B.pertussis KS, содержащие мутантный оперон ptx, инсерцию гена kan, расположенную вблизи мутантного оперона в участке, не оказывающем влияния на экспрессию оперона ptx или транспорт субъединиц рекомбинантного белка через бактериальную стенку [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009], и инактивированную инсерцией гена cad последовательность гена dnt.

Пример 4. Иммунобиологические свойства аттенуированных бактерий B.pertussis KS

Лейкоцитозстимулирующую (ЛСА) и гистаминсенсибилизирующую (ГСА) активности КТ, а также количество КТ определяли в соответствии с известными методами [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва; Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Из данных, представленных в табл.1 видно, что количество КТ, продуцируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS, практически не отличается от количества КТ, продуцируемого исходными вирулентными бактериями. Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого аттенуированными рекомбинантными бактериями B.pertussis и бактериями вирулентного штамма, напротив, значительно отличается. Аттенуированные бактерии B.pertussis, синтезирующие мутантный КТ, вызывают более низкий лейкоцитоз, гистаминсенсибилизацию у мышей и эффект образования кластеров клеток СНО при значительно большей концентрации токсоида, чем природного КТ. В таблице 1 снижение токсичности КТ приведено в процентах. Эти цифры отображают отношение концентрации природного токсина к мутантному, при добавлении которых к культуральной среде наблюдается одинаковый кластер - эффект монослоя клеток СНО. Значения измеренных параметров практически не отличаются у одиночных и двойных мутантов и близки к специфической активности токсоида, определенной ранее [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009; Pizza M., Covacci A., Bartoloni A., et al. Science, 1989, 246: 497-500].

Токсическую активность ДНТ рекомбинантных клеток определяли в опытах на животных (кроликах, морских свинках и мышах). Кроликам весом 1,5-2,0 кг и морским свинкам весом 300-350 г вводили внутрикожно 2.0 МОЕ, 1 МОЕ и 0,5 МОЕ живых микробных клеток в логарифмической фазе в объеме 0,2 мл. Контроль - ОСО-5 (отраслевой стандартный образец. Тот же, что и ОСО-3, только живые бактерии). Некроз учитывали через 24 и 48 ч.

При определении активности ДНТ в опытах на мышах определяли 50% летальную дозу [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. Животным весом 10-12 г вводили живые бактерии внутрибрюшинно в соответствующих разведениях. Результаты учитывали в течение 48 ч.

Для оценки остаточной токсичности аттенуированные бактерии B.pertussis KS выращивали на среде КУА в течение 36-48 ч, смывали 0.85% раствором хлорида натрия, концентрацию бактериальных клеток доводили до 50-60 МОЕ в 1 мл. Каждой мыши вводили внутрибрюшинно 10 МОЕ в объеме 0,5 мл. Контрольным животным вводили 0.5 мл 0.85% раствора хлорида натрия. За животными наблюдали в течение 7 суток. Массу мышей определяли через 72 ч и через 7 суток после введения. Абсолютный прирост массы тела мышей, которым ввели аттенуированные бактерии, на седьмые сутки был 100% и выше. Относительный прирост массы мышей по сравнению с контрольными мышами, которым вводили 0,85% раствор хлорида натрия, был более 80%. Через 72 ч масса мышей, которым вводили аттенуированные бактерии, была не ниже их массы до введения препарата и составляла 20% относительного прироста массы контрольных мышей.

Защитные свойства бактерий определяли по проценту выживаемости мышей при иммунизации их определенным количеством микробных клеток в соответствии с международными стандартами, принятыми в РФ [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. При интраназальной иммунизации мышам вводили от 4 до 500 млн живых микробных клеток в 25 мкл, однократно. Через 14 дней после иммунизации мышей заражали интрацеребрально высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323. В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО 3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем 1000 млн микробных клеток. После внутрибрюшинного и интраназального введения животным живых бактерий B.pertussis 5 и KS, в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали от 80 до 100% их защиту от интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.

Стабильность структуры генома и свойств рекомбинантных бактерий B.pertussis KS определяли после 15 пассажей на среде КУА, лиофильного высушивания в сахарозо-желатинозной среде и хранения при 4°С (срок наблюдения более 1 года), а также после высева бактерий из легочной ткани мышей, инфицированных живыми аттенуированными бактериями. Для изучения приживаемости штаммов и развития инфекционного процесса суспензии микробных клеток в концентрации 1×10 9 в казеиновом гидролизате рН 7.0 вводили в каждую ноздрю мыши в объеме 0.3 мл, параллельно в том же объеме вводили внутривенно. Через 72 ч проверяли ЛСА и проводили посевы из легких. В посевах из легких мышей на среде КУА с кровью через 3 и 6 дней после их заражения не регистрировали бактериальных колоний. В группе мышей, зараженных внутривенно вирулентным штаммом B.pertussis 173, наблюдали высокий лейкоцитоз (около 100000), тогда как у мышей, зараженных аттенуированными бактериями, значение ЛСА находилось в пределах 17.000-23.000 лейкоцитов/мл, что соответствует ЛСА при иммунизации мышей коммерческой ККВ. ЛСА исходных и мутантных бактерий B.pertussis при интраназальном введении микробных клеток не превышал 10-15000. К 8-му дню после интраназального введения микробной суспензии исходного штамма и мутантных бактерий B.pertussis KS и 5 число выросших колоний при посеве гомогената легких мышей достигало 150-200, в то время как после внутривенного введения мышам бактерий B.pertussis KS и 5 высевалось не более 40 колоний. При внутривенном заражении бактериями исходного штамма и посеве на среду КУА гомогената из легких мышей роста отдельных колоний не наблюдали. К 14-му дню после заражения количество колоний при посеве гомогената легких мышей, зараженных интраназально бактериями B.pertussis 173 и мутантами B.pertussis 5 и B.pertussis KS, достигало 3×103, 104 и 3×10 4, соответственно, и продолжало сохраняться в таком количестве до конца третьей недели после заражения. Различия между числом бактерий дикого штамма и двойного мутанта B.pertussis KS - статистически значимы (Р=0,95). К концу четвертой недели после интраназального и внутривенного заражения животных исходными и аттенурованными бактериями B.pertussis в высевах гомогената легких мышей не выявили бактериальных колоний на индикаторных чашках. Отдельные колонии аттенуированных бактерий B.pertussis KS, выросших на индикаторных чашках после посева гомогенатов легких мышей на четвертой неделе инфекции, перепечатывали на селективные чашки, содержащие антибиотики канамицин и хлорамфеникол и определяли стабильность маркеров в процессе размножения бактерий в организме животных. Все 100 проверенных колоний сохраняли оба маркера устойчивости к антибиотикам. Три отдельные колонии были размножены на среде КУА и использованы для проверки ЛСА и дермонекротической активности. Аналогичные исследования выполнены с бактериями B.pertussis KS после 15 пассажей на среде КУА и лиофильного высушивания штаммов в сахарозо-желатинозной среде и хранении при 4°С в течение не менее 12 месяцев. Показано, что бактерии, выделенные из легких спустя три недели после инфицирования мышей, бактерии после пассажей на искусственной питательной среде КУА и бактерии, прошедшие процедуру лиофилизации, не имеют дермонекротической активности и проявляют ЛСА в пределах, зарегистрированных у бактерий B.pertussis KS до пассажа в организме животных и лиофильного высушивания.

Параллельно с высевом на селективную среду гомогената легких мышей, зараженных интраназально, препараты ДНК анализировали с помощью ПЦР на праймерах, специфичных для последовательностей генов ptx, kan, cad и инактивированной последовательности гена dnt. Результаты ПЦР не выявили ДНК бактерий дикого типа в легких мышей уже на пятой недели после заражения. Результаты ПЦР подтвердили, что все тестированные последовательности присутствовали в гомогенатах, выделенных от животных, инфицированных аттенуированными бактериями B.pertussis KS и B.pertussis 5 на протяжении 4-х недель, в течение которых удавалось выделять бактерии B.pertussis из легких инфицированных животных, и далее вплоть до десятой недели. Результаты ПЦР разведения ДНК возбудителя коклюша из препаратов, выделенных в конце 10-й недели, выявили значимые различия в количестве ДНК бактерий B.pertussis KS и B.pertussis 5. В легких мышей, зараженных бактериями двойного мутанта B.pertussis KS, обнаружено в 5-10 раз больше ДНК возбудителя коклюша, чем у мышей, зараженных одиночным мутантом В.pertussis 5. Полученные результаты указывают на лучшую переживаемость бактерий B.pertussis KS, чем бактерий В.pertussis 5 и, тем более, бактерий дикого типа. B.pertussis 173, в легких лабораторных животных, зараженных интраназально.

Таким образом, аттенуированные бактерии B.pertussis согласно изобретению не имеют дермонекротической активности и проявляют низкую общую токсическую активность, соответствующую требованиям, предъявляемым к противококлюшным вакцинам, производимым в РФ. Более того, аттенуированные бактерии B.pertussis согласно изобретению продуцируют иммунологически активную, нетоксичную производную коклюшного токсина и сохраняют структуру мутантных генов ptx и dnt после, по крайней мере, 15 пассажей на искусственных питательных средах, хранения и при размножении в легких лабораторных животных. Интраназальная иммунизация лабораторных мышей живыми бактериями аттенуированного штамма B.pertussis KS обеспечивает защиту от внутримозгового заражения мышей высоковирулентным штаммом 18323 возбудителя коклюша, близкую по защитному эффекту после иммунизации отраслевым стандартным образцам коклюшной корпускулярной вакцины (ОСО-3).

Пример 5. Корпускулярная вакцина на основе аттенуированных бактерий B.pertussis KS, инактивированных гексаметилентетрамином (ГМТА)

Препараты готовили согласно описанному ранее методу (Авт. свид. № 1497802). Бактерии В. pertussis выращивают на средах КУА или Коен-Уиллер при 35°С 36 часов, смывают 0,85% раствором хлорида натрия (рН 7,0-7,2) до концентрации 50-60 МОЕ/мл. В суспензию добавляют 10% раствор ГМТА. Выдерживают при 35°С 48-96 часов. Оценку токсичности и защитных свойств образца вакцины согласно изобретению определяли в соответствии с инструкцией по отбору, проверке и хранению штаммов коклюшных бактерий для производства коклюшных вакцин и коклюшного компонента АКДС-вакцин (М., 1987). Образцы вакцины на основе аттунуированных бактерий B.pertussis KS проверяли через 3 месяца после приготовления. Токсическую активность определяли в опытах на мышах, морских свинках и кроликах.

Данные, представленные в табл.4 и 5, демонстрируют, что корпускулярная вакцина, приготовленная инактивированием аттенуированных рекомбинантных бактерий B.pertussis KS, не имеет специфической активности коклюшного и дермонекротического токсинов (уровень ЛСА и ГСА ниже, чем у ОСО-3, не вызывает гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах). Результаты теста изменения массы мышей (табл.4) показали, что испытуемая корпускулярная вакцина проявляет низкую токсичность в сравнении с ОСО-3 (прирост массы тела мышей через 72 ч составил 20% и через 7 суток составил более 80%) (табл.6).

В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем опытным образцам - 0,5; 0,1; 0,02×109 микробных клеток. После внутрибрюшинного введения животным инактивированных бактерий B.pertussis KS в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали защиту мышей от 80 до 100% от последующего интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Аттенуированные бактерии Bordetella pertussis, содержащие мутантные гены ptx и dnt, не проявляющие активности дермонекротического токсина, но сохранившие способность связывания с рецептором эукариотической клетки, и продуцирующие генетически измененную иммунологически активную нетоксичную токсоидную форму коклюшного токсина.

2. Штамм аттенуированных бактерий Bordetella pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, депонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития российской Федерации» под № 171/331 В.р KS-4, для использования в качестве вакцины.

3. Вакцина против возбудителя коклюша, содержащая аттенуированные бактерии B.pertussis по п.1.

4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что она содержит живые аттенуированные бактерии или инактивированные аттенуированные бактерии B.pertussis.

www.freepatent.ru

Аттенуированные бактерии bordetella pertussis, вакцина против возбудителя коклюша

Изобретение раскрывает аттенуированные бактерии В. pertussis, содержащие мутантные гены ptx и dnt, не проявляющие активности дермонекротического токсина, но сохранившие способность связывания с рецептором эукариотической клетки. Бактерии по изобретению продуцируют генетически измененную иммунологически активную нетоксичную токсоидную форму коклюшного токсина. Изобретение касается штамма бактерий В.pertussis, содержащего указанные мутантные гены, который депонирован в Коллекции штаммов НИИЭМ им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи под номером 171/331 В.р KS-4. Штамм может быть использован в качестве вакцины. Вакцина против возбудителя коклюша содержит живые аттенуированные бактерии или инактивированные аттенуированные бактерии В.pertussis. Интраназальная иммунизация вакциной, содержащей живые или инактивированные аттенуированные бактерии В.pertussis по изобретению, проведенная в эксперименте in vivo, обеспечивает эффективную и пролонгированную защиту от заражения вирулентным штаммом возбудителя коклюша. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 5 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается аттенуированных бактерий В.pertussis, содержащих нокаутную мутацию в гене dnt и продуцирующих нетоксическую, иммунологически активную, токсоидную форму коклюшного токсина, их применению в качестве живой и инактивированной вакцин и вектора для поливалентной вакцины. Интраназальная иммунизация мышей живыми и инактивированными аттенуированными бактериями B.pertussis обеспечивает эффективную и пролонгированную защиту от заражения вирулентным штаммом возбудителя коклюша.

Уровень техники

Вакцинация против коклюша в течение многих лет проводится коклюшной корпускулярной вакциной (ККВ). ККВ обеспечивает защиту от заболевания более 85% привитых детей. Тем не менее, из-за возникающих разнообразных побочных реакций после вакцинации в ряде развитых стран, а также у нас в стране, наблюдалось снижение охвата детского населения прививками. Как следствие, увеличилась заболеваемость не только новорожденных детей, но и детей школьного возраста и взрослых, особенно, находящихся в контакте с детьми в организованных коллективах [Centers for Disease Control and Prevention. Pertussis United States, 1997-2000. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2002, 51:73-76].

Детальное изучение иммунобиологических свойств возбудителя коклюша позволило установить роль конкретных факторов вирулентности в патогенезе заболевания, формировании иммунного ответа и разработать менее реактогенные бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ). Показано, что ведущим фактором, определяющим патогенез, клинику заболевания и обеспечивающим формирование иммунитета, является коклюшный токсин (КТ).

Используемые в настоящее время бесклеточные KB значительно различаются по составу антигенов коклюшного микроба, методам их очистки и обезвреживания KT [Mooi, F.R., I.H. van Loo, A.J.King. Emerg. Infect. Dis. 2001, 7:.526-28]. При производстве БКВ используются трудоемкие и дорогостоящие технологические операции, а их хранение требует специальных условий. Несмотря на то, что бесклеточные KB, по сравнению с ККВ, обладают более низкой реактогенностью, отмечены случаи неврологических осложнений и смертей новорожденных, связанные с вакцинацией БКВ [Чупринина Р.П., Озерецковский Н.А., Алексеева И.А., 2001, 3:19-22]. Эффективность поликомпонентных БКВ и высокий стабильный уровень защитной активности ККВ подтверждает важную роль в защите против коклюша белков, связанных с наружной мембраной клетки, в частности филаментозного гемагглютинина, пертактина, агглютиногенов 2 и 3.

Опыт применения моно- и поликомпонентных БКВ показал, что их низкая реактогенность обусловлена, в частности, практически полным отсутствием в препаратах термолабильного или дермонекротического эндотоксина (ДНТ). Этот факт позволяет предположить, что бактерии, не продуцирующие эндотоксин, наиболее перспективны для производства безвредных вакцин, интраназальное введение которых будет нивелировать и отрицательный эффект липополисахарида. Наблюдения за профилактической эффективностью противококлюшных вакцин в течение последних 20 лет свидетельствуют о том, что иммунитет после вакцинации БКВ сохраняется не более 4-х лет, после иммунизации ККВ 5-6 лет, а после перенесенного заболевания продолжительность напряженного иммунитета достигает 10 лет [Guiso.N, Njamkepo Е., Vié Ie Sage.F, et al. Vaccine. 2007, 25:1390-13907; Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews. 2005, 18:326-382; Purdy K..W, Hay J..W, Botteman M..F, Ward J..I. Clin Infect Dis. 2004, 39:29-30].

Таким образом, максимальная длительность и напряженность иммунитета, скорее всего, могут быть обеспечены в результате использования для массовой вакцинации (ревакцинации) детей и взрослых живой вакцины интраназального применения, созданной на основе полноценных аттенуированных бактерий В.pertussis. Возможность разработки такой вакцины продемонстрирована в ряде исследований [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. PLoS Pathogens. 2006, 2:0662-70; Stevenson A, Roberts M. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003, 37:121-128]. Показано также, что бактерии В.pertussis могут быть использованы в качестве вектора для конструирования поливалентных живых вакцин, предназначенных для интраназальной иммунизации. Интраназальная иммунизация животных бактериями, продуцирующими гетерологичные антигены, сопровождается выработкой IgG и IgA как против филаментозного гемагглютинина B.pertussis, так и против слитых с ним гетерологичных антигенов. При этом антитела обнаруживаются не только в сыворотке крови, но и в выделениях генитального тракта мышей [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. PLoS Pathogens. 2006, 2:0662-70; Stevenson A., Roberts M. FEMS Immunol. Med.Microbiol. 2003, 37:121-128].

Направленная аттенуация бактерий B.pertussis путем конструирования мутантов B.pertussis, продуцирующих токсоид КТ, описана ранее [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Однако одним из существенных недостатков указанного аттенуированного штамма является способность продуцировать дермонекротический токсин, кодируемый геном dnt, являющийся одним из факторов патогенности бактерий рода Bordetella, определяющим реактогенность вакцины. Как отмечено выше, дермонекротический токсин, кодируемый последовательностью хромосомы dnt, является второй важной мишенью для снижения токсичности бактерий рода Bordetella. Гены dnt присутствуют в хромосомах практически всех представителей рода Bordetella и почти не отличаются друг от друга [Kashimoto Т., Katahira J., Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Parkhill J., Sebaihia M., Preston A. et al. Nat. Genet. 2003, 35:32-4; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71; Schmidt G., U.M. Goehring, J. Schirmer, et al. J. Bio Chem. 1999, 274:31875-3188]. Исключение составляют некоторые штаммы, так называемого комплекса IV В. bronchiseptica, выделенные от людей и утратившие ген dnt [Diavatopoulos D.A., Craig A. et al. PLOS Pathogens. 2005, 1:373-383]. Синтез ДНТ находится под контролем bvg-локуса. Bvg- клетки B.pertussis не продуцируют ДНТ [Stibitz S., Miller J.F. In V.L.Miller, J.B.Kaper, D.A.Portney, R.R.Isberg (ed.), Molecular genetics of bacterial pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1994, 407-422]. Нет данных, указывающих на участие ДНТ в формировании иммунного ответа. Дермонекротический, термолабильный или летальный мышиный токсин представляет собой белковую молекулу, состоящую из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 140 кДа. ДНТ является эндотоксином, локализован в цитоплазме и клеточной стенке бактерий, инактивируется нагреванием при 56°С [Horiguchi Y, Nakai Т, Kume К.. Infect. Immun. 1991, 59: 1112-1116; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J.Cell Sci. 1995, 108:3243-51; Kashimoto Т, Katahira J, Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71]. При внутрикожном введении животным ДНТ вызывает некрозы. После внутривенного и внутрибрюшинного введения животным ДНТ наблюдаются значительные некрозы, кровоизлияния, отеки и дегенеративные изменения в печени, почках, селезенке. Сообщалось, что ДНТ ингибирует активность щелочной фосфатазы и уменьшает накопление коллагена 1 типа в остеобласто-подобных клетках. Предполагается, что ДНТ может влиять на способность клеток к дифференциации, стимулирует синтез ДНК и белка, что является следствием модификации GTF- связывающего белка RhoA эукариотических клеток [Horiguchi Y., Nakai Т., Kume К. Infect. Immun. 1991, 59:1112-1116; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J. Cell Sci. 1995, 108:3243-51]. Картирована область ферментативного центра и участка, ответственного за связывание ДНТ с рецептором эукариотической клетки [13, 20]. Роль ДНТ в патогенезе коклюша изучена недостаточно. Предполагается, что ДНТ принимает участие в приживлении и колонизации коклюшного микроба [Diavatopoulos D.A., Craig A. et al. PLOS Pathogens. 2005, 1:373-383; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J. Cell Sci. 1995, 108:3243-51].

Известен аттенуированный штамм Bordetella pertussis, содержащий мутацию в гене ptx, делецию гена dnt и гетерологичный ген ampG, продукт которого значительно снижает количество трахеального цитотоксина (WO/2007/104451). В экспериментах на новорожденных мышах показано, что штамм способен индуцировать иммунный ответ у лабораторных животных. Однако защитные свойства аттенуированного тройного мутанта Bordetella pertussis оценивались по способности бактерий вирулентного штамма размножаться в носоглотке и легких мышей после их интраназальной вакцинации аттенуированными бактериями, что не соответствует тесту, рекомендованному Всемирной Организацией здравоохранения и используемому в большинстве стран, включая Россию, для оценки протективности коклюшной вакцины. Несоответствие условий анализа протективности международным стандартам (в значительной степени заниженные дозы заражения бактериями вирулентного штамма, способ заражения и метод оценки протективности) не позволяют оценить пригодность известного аттенуированного тройного мутанта Bordetella в качестве кандидата живой вакцины.

Раскрытие изобретения

Авторами настоящего изобретения впервые предложен штамм аттенуированных бактерий B.pertussis, не проявляющих активности дермонекротического токсина и продуцирующих генетически измененную иммунологически активную нетоксичную, токсоидную форму коклюшного токсина, способный обеспечивать при интраназальном способе вакцинации эффективный иммунитет против вирулентного штамма бактерий B.pertussis.

Другой аспект изобретения касается живой вакцины против возбудителя коклюша B.pertusis на основе аттенуированного двойного мутанта B.pertusis KS. Еще один аспект изобретения касается инактивированной цельноклеточной (корпускулярной) вакцины на основе аттенуированного штамма, содержащего мутантные гены ptx и dnt.

Еще один аспект изобретения касается использования аттенуированного штамма Bordetella в качестве вектора при создании поливалентной вакцины для профилактики или лечения инфекций, вызываемых различными патогенами, в частности возбудителем туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis).

В еще одном аспекте изобретение обеспечивает штамм аттенуированных бактерий В.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, деропонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» № 171/331 B.p KS-4.

Краткое описание чертежей

Фиг.1а. Схема конструирования и структура рекомбинантной плазмиды pKS1.

Стрелками обозначены последовательности генов в составе рекомбинантных плазмид: cat - серая, dnt - черная, bla - незакрашенная, tet - косая штриховка. Ломаными линиями обозначены положения праймеров Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Др (Tcg ttc aac аса tcc aag gc), использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt.

Фиг.1б. Схема конструирования и структура рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3.

Стрелками обозначены последовательности генов в составе рекомбинантных плазмид: cat - серая, dnt - черная, bla - незакрашенная, tet - косая штриховка. Ломаными линиями обозначены положения праймеров Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Др (Tcg ttc aac аса tcc aag gc), использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt.

Фиг.2. Схема аллельного обмена между копиями фрагментов мутантных (плазмида и pKS3) и нативных (хромосома B.pertussis 5) последовательностей гена dnt. Структура фрагмента хромосомы KS B.pertussis, содержащего мутантный ген dnt.

Ломаными линиями обозначены положения праймеров использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt. Длинные линии на верхней части рисунка фланкируют участки последовательности гена dnt, участвующие в гомологичной рекомбинации в процессе аллельного обмена.

Фиг.3. Электрофорез продуктов ПЦР ДНК B.pertussis KS.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение впервые обеспечивает аттенуированные бактерии B.pertussis, не проявляющие активности дермонекротического токсина, коклюшного токсина и общей токсической активности, но сохранивших способность связывания с рецепторами эукариотической клетки (мутацией не затронута область гена dnt, кодирующая участок связывания токсина с рецептором эукариотической клетки) и продуцирующих генетически измененную иммунологически активную нетоксичную, токсоидную форму коклюшного токсина (оперон ptx), причем аттенуированные двойные мутанты B.pertussis являются нереактогененными и обеспечивает эффективную защиту лабораторных животных, вакцинированных интраназально, против интрацеребральной инфекции вирулентным штаммом B.pertussis.

В одном из аспектов изобретение направлено на аттенуированные бактерии В.pertussis KS, несущие нокаутную мутацию в гене dnt, сконструированные на основе описанного ранее мутанта В.pertussis 5, продуцирующего токсоид КТ (Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009). Согласно современной классификации бактерии исходного вирулентного штамма В.pertussis 173 и мутанта В.pertussis 5 относятся к генотипу ptxS1A4, соответствующему генотипу большинства штаммов бактерий B.pertussis, используемых на протяжении последних 60 лет для производства противококлюшных вакцин в РФ и ряде зарубежных стран [Borisova. О; Kombarova S.Y.; Zakharova, N.S. et al. Clin vaccine Immunol. 2007; 14:234-238; Audrey J King, Tamara van Gorkom, Jeroen L.A.; Penningsye at al. BMC Genomics. 2010; 11:196]. В качестве бактерий используемых для конструирования двойных мутантов, содержащих описанные мутации в опероне ptx и гене dnt, могут быть использованы не только бактерии B.pertusis 173 и B.pertusis 5, имеющие генотип ptxS1A4, но и бактерии с другими генотипами, в частности ptxS1 A1, выделяемые от больных коклюшем в настоящее время.

Согласно предложенному изобретению для мутагенеза была выбрана область гена dnt, кодирующая токсический центр белка. В отличие от описанной ранее делеции [Kashimoto Т., Katahira J. Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71] используемая согласно изобретению инсерция последовательности гена cad в Tth2111 сайт гена dnt не затрагивает область гена, кодирующего участок связывания ДНТ с рецептором эукариотической клетки.

Конъюгативная плазмида pKS3, несущая фрагмент последовательности dnt, содержащий инсерцию гена cad и не реплицирующаяся в клетках микроорганизмов рода Bordetella, получена для конструирования аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, согласно изобретению (Фиг.1б, пример 2). Бактерии B.pertussis, содержащие мутации ptxS1 и нокаутную мутацию dnt в хромосоме, сконструированы в результате аллельного обмена между природной копией оперона dnt в составе хромосомы реципиента и мутантной копией в составе плазмиды pKS3 (фиг.2, пример 3). Плазмиду pKS3 передавали в бактерии B.pertussis в результате скрещивания S17 Е.coli/pKS3XKmRRifR и В. pertussis 5. Локализация инсерции последовательности в гене dnt подтверждена путем проведения ПЦР на ДНК хромосомы трансконъюганта с праймерами Дфв (Gct gct ggg caa tgt gtt cg) - Cp (Ctc aat gta cct ata acc aga. ccg ttc) (фиг.3, пример 3).

Таким образом, в соответствии с изобретением сконструированы бактерии B.pertussis KS, содержащие мутантный оперон ptx, инсерцию гена kan, расположенную вблизи мутантного оперона в участке, не оказывающем влияния на экспрессию оперона ptx или транспорт субъединиц рекомбинантного белка через бактериальную стенку, и инактивированную инсерцией гена cad последовательность гена dnt.

В еще одном аспекте изобретение обеспечивает штамм аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, деропонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» под № 171/331 B.p KS-4.

Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого аттенуированными бактериями B.pertussis согласно изобретению, была оценена в экспериментах по определению степени лейкоцитоза и гистаминсенсибилизации у мышей и эффекта образования кластеров клеток СНО, результаты представлены в табл.1.

Из данных, представленных в табл.1, видно, что количество КТ, продуцируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS, практически не отличается от количества КТ, продуцируемого бактериями вирулентного штамма B.pertussis 173. Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS согласно изобретению, напротив, значительно отличается от специфической токсической активности КТ, синтезируемого бактериями вирулентного штамма B.pertussis 173. Аттенуированные бактерии B.pertussis, синтезирующие мутантный КТ, вызывают более низкий лейкоцитоз (ЛСА 21×103 против 63×103), гистаминсенсибилизацию у мышей (ГСД50 2.4×109 против 6,9×103) и эффект образования кластеров клеток СНО при значительно большей концентрации токсоида, чем КТ, продуцируемый природными вирулентными бактериями (одинаковый кластер-эффект при концентрации токсина меньшей в 104 раз, чем токсоида).

Определение токсической активности ДНТ рекомбинантных клеток B.pertussis KS определяли в опытах на животных (морских свинках и мышах), результаты представлены в табл.2.

Данные, представленные в табл.2, демонстрируют, что аттенуированные рекомбинантные бактерии B.pertussis KS, в отличие от бактерий исходного вирулентного штамма 173 и бактерий B.pertussis 5, не вызывают гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах.

Общую токсичность аттенуированных бактерий B.pertussis KS согласно изобретению, характеризующую действие на организм мышей всех токсинов возбудителя коклюша, в том числе и цитотоксина, определяли в соответствии с требованиями РФ после введения инактивированной прогреванием бактериальной суспензии лабораторным мышам внутрибрюшинно [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. Результаты теста изменения массы тела мышей (табл.3) показали, что в отличие от инактивированных бактерий вирулентного штамма B.pertussis 173, живые аттенуированные бактерии B.pertussis KS при внутрибрюшинном введении 10 МОЕ (Международный оптический стандарт микробных клеток, 1 МОЕ соответствует 1 миллиарду микробных клеток) в 0,5 мл 0,85% раствора хлорида натрия проявляли низкую токсичность.

Защитные свойства бактерий определяли по проценту выживаемости мышей при иммунизации их определенным количеством микробных клеток в соответствии с международными стандартами, принятыми в РФ [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов В.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва], результаты представлены в табл.4.

При интраназальной иммунизации мышам вводили от 4 до 500 млн живых микробных клеток в 25 мкл, однократно. Через 14 дней после иммунизации мышей заражали интрацеребрально высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323. В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3 (Отраслевой стандартный образец корпускулярной коклюшной вакцины, ГИСК им.Л.А.Тарасевича), который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве 10 МОЕ. После интрацеребрального заражения мышей высоковирулентным штаммом 18323 наблюдали защиту от гибели от 80 до 100% в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации.

Еще один аспект изобретения касается использования аттенуированных двойных мутантов B.pertusis KS в качестве живой вакцины против возбудителя коклюша B.pertusis. Вакцина согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель, а также адъюванты, например двуокись алюминия. Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются, фосфатным буфером, дистиллированной водой, эмульсиями "масло в воде" и т.п. Предпочтительно вакцина согласно изобретению вводится интраназально в одной дозе.

Еще один аспект изобретение касается инактивированной цельноклеточной вакцины на основе аттенуированных бактерий, содержащих мутантные гены ptx и dnt. Инактивация живых бактерий аттенуированного двойного мутанта B.pertusis KS производится с помощью обработки гексаметилентетрамином (ГМТА) в соответствии с описанным ранее методом (Авт. свид. №1497802). Токсическую активность определяли в опытах на мышах, морских свинках и кроликах, результаты экспериментов приведены в табл.4 и 5 (Пример 5). Данные, представленные в таблицах 4 и 5, демонстрируют, что корпускулярная вакцина, содержащая инактивированные аттенуированные рекомбинантные бактерии B.pertussis KS, не имеет специфической активности коклюшного и дермонекротического токсинов (уровень ЛСА и ГСА ниже, чем у ОСО-3), не вызывает гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах.

Защитные свойства корпускулярной вакцины на основе инактивированных аттенуированных бактерий B.pertussis KS определяли при интрацеребральном заражении высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323 (табл.6, пример 5). В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем опытным образцам - 0,5; 0,1; 0,02×109 микробных клеток. После внутрибрюшинного введения животным инактивированных бактерий B.pertussis KS, в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали защиту мышей от 80 до 100% от последующего интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.

Инактивированная цельноклеточная вакцина согласно изобретению может содержать перечисленные выше фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель, используемые для живой вакцины, а также адъюванты, например двуокись алюминия. Инактивированная цельноклеточная вакцина согласно изобретению вводится подкожно.

В еще одном из аспектов изобретение обеспечивает поливалентную вакцину на основе аттенуированных двойных мутантов Bordetella pertussis в качестве вектора. Поливалентный вакцинный штамм В. pertussis продуцирует антигены возбудителя туберкулеза ESAT-6, CFP-10 и Ag85A (заявки на патент РФ 2010123879, 2010123883, 2010123865, соответственно) в составе слитого комплекса с адгезином FGA или/и автотранспортным белком BrkA возбудителя коклюша. Белки ESAT-6, CFP10 и Ag85A экспонированы на С-конце химерного белка, что обеспечивает их представление на поверхности бактерии-вектора и сохранение их иммуногенных свойств, и, как следствие, индукцию выработки специфических защитных антител против возбудителя коклюша и основных протективных антигенов возбудителя туберкулеза при интраназальном введении человеку.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний.

Пример 1. Бактериальные штаммы E.coli, В.pertussis и условия их культивирования

Штаммы В. Pertussis 173 [Rifr, Серовар 1.2.3.7.13., ЛСА (40-50)], полученный из коллекция штаммов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, и B.pertussis 5 [Rifr, Kmr, Серовар 1.2.0.7.13; ЛСА 17-20 т., ptx(M)], а также бактерии B.pertussis KS [Rifr, Kmr, Cmr, DNT], полученные согласно изобретению, выращивались на среде Борде-Жангу с добавлением 10% дефибринированной крови барана и жидкой питательной среде типа Коен-Уиллер.

Штаммы E.coli S17-1 λpir [TprSmr recA, thi, pro, hsdR-M+ RP4:2-Tc:Mu::Km Tn7 λpir], E.coli Dh5 α [F, Ф80dА (lacZ)ml5, recAl, endAl, gyrA96, thi-1 hsdR17(rk--mk+), supE44, relAl, glnV44, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169], E.coli Dh5 α CmrApr/pBScad, полученные из коллекции штаммов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, и штаммы E.coli Dh5α/pKS1, E.coli Dh5α/pKS2, E.coliS17-1 λpir)/pKnock-Tc и E.coli S17-1 λpir/pKS3, полученные согласно изобретению, выращивались в жидкой или на агаризованной среде «L», казеиновоугольном агаре (КУА). Антибиотики добавляли в концентрациях (мкг/мл): ампициллин - 100; канамицин - 25, рифампицин - 100, хлорамфеникол - 25, тетрациклин - 20.

Пример 2. Конструирование плазмиды для рекомбинационного обмена между копиями нативного и мутантного генов dnt

Для конструирования плазмиды с целью рекомбинационного обмена между копиями нативного и мутантного генов dnt был использован конъюгативный вектор pKnock - Тс [Tet ori-R6K mob RP4], не способный реплицироваться в бактериях рода Bordetella [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Схема конструирования плазмиды pKS3 и ее структура представлены на фиг.1б. Плазмида pKSl [pGEM (dnt)], содержащая последовательность гена dnt, инактивированную инсерцией гена cad (Фиг.1а), получена в результате клонирования продукта ПЦР ДНК B.pertusis-5 с праймерами Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg) и, Дp (Tcg ttc aac аса tcc aag gc) в вектор pGem (PromegaUSA) и последующей интеграции гена cad (фрагмента Acc1 плазмиды pBScad) в TthlllI сайт гена dnt (плазмида pKS2). Структура рекомбинантной плазмиды pKS2 представлена на Фиг.1б. Плазмида pKS3 получена в результате переклонирования (SaeII-NotI) фрагмента плазмиды pKS2 в соответствующие сайты плазмиды pKnock-Tc (фиг.1б). Структура рекомбинантных плазмид подтверждена с помощью рестрикционного анализа и ПЦР с использованием различных сочетаний праймеров

Рестрикционный анализ, лигирование, электрофорез ДНК, клонирование последовательностей ДНК проводили в соответствии с методическим руководством Маниатиса с соавт. [Маниатис Т., Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 1984]. Выделение ДНК плазмид, хромосомы и продуктов ПЦР из геля проводили с помощью систем Wizard Plus SV MiniPrepsDNA purification system (Promega США), Wizard Plus MiniPrepsDNA purification system (Promega США) и Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе «Терцик» (Россия) при использовании праймеров, синтезированных АО "Синтол".

Пример 3. Конструирование бактерий В.pertussis SK, содержащих мутантный ген dnt в составе хромосомы

Трансформацию клеток E.coli ДНК плазмид и лигированной смесью проводили в соответствии с методическим руководством Маниатиса с соавт. [Маниатис Т., Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 1984]. Скрещивание между бактериями E.coli S17 и В.pertussis проводили в соответствии с методическим руководством Миллера [Миллер Дж. В. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир, Москва, 1984. 436]. В качестве реципиента для конструирования аттенуированных бактерий использовался охарактеризованный ранее KmRRifR штамм В.pertussis 5, содержащий мутацию в гене ptx.

Бактерии В.pertussis, содержащие мутации ptxS1 и нокаутную мутацию dnt в хромосоме, сконструированы в результате аллельного обмена между природной копией оперона dnt в составе хромосомы реципиента и мутантной копией в составе плазмиды pKS3 (фиг.2). Плазмиду pKS3 передавали в бактерии В.pertussis в результате скрещивания S17 E.coli/pKS3XKmRRifR  и В.pertussis 5. После трехкратной расчистки на среде КУА с хлорамфениколом бактерии проверяли по маркерам антибиотикоустойчивости, наличию плазмидной ДНК и последовательностей генов kan, cad и dnt в ПЦР с праймерами Все проверенные бактериальные клоны трансконъюгантов имели фенотип СmR KmR RifR, не содержали плазмидного маркера устойчивости к тетрациклину и плазмидной ДНК. В ПЦР ДНК хромосомы, выделенной из бактерий трансконъюгантов, с праймерами Сф-Ср, и Кф-Кр показано наличие последовательностей, кодирующих устойчивости к канамицину и хлорамфениколу. В результате ПЦР ДНК хромосомы трансконъюгантов с праймерами Дфв-Дрв выявлены фрагмент размером 2380 п.о. и фрагмент размером 870 п.о., что соответствует размеру фрагмента dnt, содержащего вставку гена cat (фиг.3).

Для подтверждения локализации инсерции последовательности в гене dnt проведена ПЦР на ДНК хромосомы трансконъюганта с праймерами Дфв-Ср (фиг.3). Так как праймер Дфв (Ccg caa tgg gcc gag ctg tt) расположен за пределами фрагмента dnt, клонированного в составе плазмиды pKS3, то в результате ПЦР с праймерами Дфв-Ср образуется специфический продукт размером 870 п.о. только при наличии инсерции последовательности cad в сайт TthlllI последовательности dnt. Специфичность полученных продуктов подтверждена результатами рестрикции эндонуклеазами АсcI и SalGI. Определение последовательности гeнa ptxS1 в составе хромосомы аттенуированных бактерий B.pertussis KS подтвердило наличие замен Arg9-Lys9 и Glul29-Glyl29 в области, кодирующей ферментативный центр КТ.

Таким образом, в соответствии с изобретением сконструированы бактерии B.pertussis KS, содержащие мутантный оперон ptx, инсерцию гена kan, расположенную вблизи мутантного оперона в участке, не оказывающем влияния на экспрессию оперона ptx или транспорт субъединиц рекомбинантного белка через бактериальную стенку [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009], и инактивированную инсерцией гена cad последовательность гена dnt.

Пример 4. Иммунобиологические свойства аттенуированных бактерий B.pertussis KS

Лейкоцитозстимулирующую (ЛСА) и гистаминсенсибилизирующую (ГСА) активности КТ, а также количество КТ определяли в соответствии с известными методами [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва; Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Из данных, представленных в табл.1 видно, что количество КТ, продуцируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS, практически не отличается от количества КТ, продуцируемого исходными вирулентными бактериями. Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого аттенуированными рекомбинантными бактериями B.pertussis и бактериями вирулентного штамма, напротив, значительно отличается. Аттенуированные бактерии B.pertussis, синтезирующие мутантный КТ, вызывают более низкий лейкоцитоз, гистаминсенсибилизацию у мышей и эффект образования кластеров клеток СНО при значительно большей концентрации токсоида, чем природного КТ. В таблице 1 снижение токсичности КТ приведено в процентах. Эти цифры отображают отношение концентрации природного токсина к мутантному, при добавлении которых к культуральной среде наблюдается одинаковый кластер - эффект монослоя клеток СНО. Значения измеренных параметров практически не отличаются у одиночных и двойных мутантов и близки к специфической активности токсоида, определенной ранее [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009; Pizza M., Covacci A., Bartoloni A., et al. Science, 1989, 246: 497-500].

Токсическую активность ДНТ рекомбинантных клеток определяли в опытах на животных (кроликах, морских свинках и мышах). Кроликам весом 1,5-2,0 кг и морским свинкам весом 300-350 г вводили внутрикожно 2.0 МОЕ, 1 МОЕ и 0,5 МОЕ живых микробных клеток в логарифмической фазе в объеме 0,2 мл. Контроль - ОСО-5 (отраслевой стандартный образец. Тот же, что и ОСО-3, только живые бактерии). Некроз учитывали через 24 и 48 ч.

При определении активности ДНТ в опытах на мышах определяли 50% летальную дозу [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. Животным весом 10-12 г вводили живые бактерии внутрибрюшинно в соответствующих разведениях. Результаты учитывали в течение 48 ч.

Для оценки остаточной токсичности аттенуированные бактерии B.pertussis KS выращивали на среде КУА в течение 36-48 ч, смывали 0.85% раствором хлорида натрия, концентрацию бактериальных клеток доводили до 50-60 МОЕ в 1 мл. Каждой мыши вводили внутрибрюшинно 10 МОЕ в объеме 0,5 мл. Контрольным животным вводили 0.5 мл 0.85% раствора хлорида натрия. За животными наблюдали в течение 7 суток. Массу мышей определяли через 72 ч и через 7 суток после введения. Абсолютный прирост массы тела мышей, которым ввели аттенуированные бактерии, на седьмые сутки был 100% и выше. Относительный прирост массы мышей по сравнению с контрольными мышами, которым вводили 0,85% раствор хлорида натрия, был более 80%. Через 72 ч масса мышей, которым вводили аттенуированные бактерии, была не ниже их массы до введения препарата и составляла 20% относительного прироста массы контрольных мышей.

Защитные свойства бактерий определяли по проценту выживаемости мышей при иммунизации их определенным количеством микробных клеток в соответствии с международными стандартами, принятыми в РФ [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. При интраназальной иммунизации мышам вводили от 4 до 500 млн живых микробных клеток в 25 мкл, однократно. Через 14 дней после иммунизации мышей заражали интрацеребрально высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323. В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО 3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем 1000 млн микробных клеток. После внутрибрюшинного и интраназального введения животным живых бактерий B.pertussis 5 и KS, в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали от 80 до 100% их защиту от интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.

Стабильность структуры генома и свойств рекомбинантных бактерий B.pertussis KS определяли после 15 пассажей на среде КУА, лиофильного высушивания в сахарозо-желатинозной среде и хранения при 4°С (срок наблюдения более 1 года), а также после высева бактерий из легочной ткани мышей, инфицированных живыми аттенуированными бактериями. Для изучения приживаемости штаммов и развития инфекционного процесса суспензии микробных клеток в концентрации 1×109 в казеиновом гидролизате рН 7.0 вводили в каждую ноздрю мыши в объеме 0.3 мл, параллельно в том же объеме вводили внутривенно. Через 72 ч проверяли ЛСА и проводили посевы из легких. В посевах из легких мышей на среде КУА с кровью через 3 и 6 дней после их заражения не регистрировали бактериальных колоний. В группе мышей, зараженных внутривенно вирулентным штаммом B.pertussis 173, наблюдали высокий лейкоцитоз (около 100000), тогда как у мышей, зараженных аттенуированными бактериями, значение ЛСА находилось в пределах 17.000-23.000 лейкоцитов/мл, что соответствует ЛСА при иммунизации мышей коммерческой ККВ. ЛСА исходных и мутантных бактерий B.pertussis при интраназальном введении микробных клеток не превышал 10-15000. К 8-му дню после интраназального введения микробной суспензии исходного штамма и мутантных бактерий B.pertussis KS и 5 число выросших колоний при посеве гомогената легких мышей достигало 150-200, в то время как после внутривенного введения мышам бактерий B.pertussis KS и 5 высевалось не более 40 колоний. При внутривенном заражении бактериями исходного штамма и посеве на среду КУА гомогената из легких мышей роста отдельных колоний не наблюдали. К 14-му дню после заражения количество колоний при посеве гомогената легких мышей, зараженных интраназально бактериями B.pertussis 173 и мутантами B.pertussis 5 и B.pertussis KS, достигало 3×103, 104 и 3×104, соответственно, и продолжало сохраняться в таком количестве до конца третьей недели после заражения. Различия между числом бактерий дикого штамма и двойного мутанта B.pertussis KS - статистически значимы (Р=0,95). К концу четвертой недели после интраназального и внутривенного заражения животных исходными и аттенурованными бактериями B.pertussis в высевах гомогената легких мышей не выявили бактериальных колоний на индикаторных чашках. Отдельные колонии аттенуированных бактерий B.pertussis KS, выросших на индикаторных чашках после посева гомогенатов легких мышей на четвертой неделе инфекции, перепечатывали на селективные чашки, содержащие антибиотики канамицин и хлорамфеникол и определяли стабильность маркеров в процессе размножения бактерий в организме животных. Все 100 проверенных колоний сохраняли оба маркера устойчивости к антибиотикам. Три отдельные колонии были размножены на среде КУА и использованы для проверки ЛСА и дермонекротической активности. Аналогичные исследования выполнены с бактериями B.pertussis KS после 15 пассажей на среде КУА и лиофильного высушивания штаммов в сахарозо-желатинозной среде и хранении при 4°С в течение не менее 12 месяцев. Показано, что бактерии, выделенные из легких спустя три недели после инфицирования мышей, бактерии после пассажей на искусственной питательной среде КУА и бактерии, прошедшие процедуру лиофилизации, не имеют дермонекротической активности и проявляют ЛСА в пределах, зарегистрированных у бактерий B.pertussis KS до пассажа в организме животных и лиофильного высушивания.

Параллельно с высевом на селективную среду гомогената легких мышей, зараженных интраназально, препараты ДНК анализировали с помощью ПЦР на праймерах, специфичных для последовательностей генов ptx, kan, cad и инактивированной последовательности гена dnt. Результаты ПЦР не выявили ДНК бактерий дикого типа в легких мышей уже на пятой недели после заражения. Результаты ПЦР подтвердили, что все тестированные последовательности присутствовали в гомогенатах, выделенных от животных, инфицированных аттенуированными бактериями B.pertussis KS и B.pertussis 5 на протяжении 4-х недель, в течение которых удавалось выделять бактерии B.pertussis из легких инфицированных животных, и далее вплоть до десятой недели. Результаты ПЦР разведения ДНК возбудителя коклюша из препаратов, выделенных в конце 10-й недели, выявили значимые различия в количестве ДНК бактерий B.pertussis KS и B.pertussis 5. В легких мышей, зараженных бактериями двойного мутанта B.pertussis KS, обнаружено в 5-10 раз больше ДНК возбудителя коклюша, чем у мышей, зараженных одиночным мутантом В.pertussis 5. Полученные результаты указывают на лучшую переживаемость бактерий B.pertussis KS, чем бактерий В.pertussis 5 и, тем более, бактерий дикого типа. B.pertussis 173, в легких лабораторных животных, зараженных интраназально.

Таким образом, аттенуированные бактерии B.pertussis согласно изобретению не имеют дермонекротической активности и проявляют низкую общую токсическую активность, соответствующую требованиям, предъявляемым к противококлюшным вакцинам, производимым в РФ. Более того, аттенуированные бактерии B.pertussis согласно изобретению продуцируют иммунологически активную, нетоксичную производную коклюшного токсина и сохраняют структуру мутантных генов ptx и dnt после, по крайней мере, 15 пассажей на искусственных питательных средах, хранения и при размножении в легких лабораторных животных. Интраназальная иммунизация лабораторных мышей живыми бактериями аттенуированного штамма B.pertussis KS обеспечивает защиту от внутримозгового заражения мышей высоковирулентным штаммом 18323 возбудителя коклюша, близкую по защитному эффекту после иммунизации отраслевым стандартным образцам коклюшной корпускулярной вакцины (ОСО-3).

Пример 5. Корпускулярная вакцина на основе аттенуированных бактерий B.pertussis KS, инактивированных гексаметилентетрамином (ГМТА)

Препараты готовили согласно описанному ранее методу (Авт. свид. №1497802). Бактерии В. pertussis выращивают на средах КУА или Коен-Уиллер при 35°С 36 часов, смывают 0,85% раствором хлорида натрия (рН 7,0-7,2) до концентрации 50-60 МОЕ/мл. В суспензию добавляют 10% раствор ГМТА. Выдерживают при 35°С 48-96 часов. Оценку токсичности и защитных свойств образца вакцины согласно изобретению определяли в соответствии с инструкцией по отбору, проверке и хранению штаммов коклюшных бактерий для производства коклюшных вакцин и коклюшного компонента АКДС-вакцин (М., 1987). Образцы вакцины на основе аттунуированных бактерий B.pertussis KS проверяли через 3 месяца после приготовления. Токсическую активность определяли в опытах на мышах, морских свинках и кроликах.

Данные, представленные в табл.4 и 5, демонстрируют, что корпускулярная вакцина, приготовленная инактивированием аттенуированных рекомбинантных бактерий B.pertussis KS, не имеет специфической активности коклюшного и дермонекротического токсинов (уровень ЛСА и ГСА ниже, чем у ОСО-3, не вызывает гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах). Результаты теста изменения массы мышей (табл.4) показали, что испытуемая корпускулярная вакцина проявляет низкую токсичность в сравнении с ОСО-3 (прирост массы тела мышей через 72 ч составил 20% и через 7 суток составил более 80%) (табл.6).

В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем опытным образцам - 0,5; 0,1; 0,02×109 микробных клеток. После внутрибрюшинного введения животным инактивированных бактерий B.pertussis KS в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали защиту мышей от 80 до 100% от последующего интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.

1. Аттенуированные бактерии Bordetella pertussis, содержащие мутантные гены ptx и dnt, не проявляющие активности дермонекротического токсина, но сохранившие способность связывания с рецептором эукариотической клетки, и продуцирующие генетически измененную иммунологически активную нетоксичную токсоидную форму коклюшного токсина.

2. Штамм аттенуированных бактерий Bordetella pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, депонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития российской Федерации» под №171/331 В.р KS-4, для использования в качестве вакцины.

3. Вакцина против возбудителя коклюша, содержащая аттенуированные бактерии B.pertussis по п.1.

4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что она содержит живые аттенуированные бактерии или инактивированные аттенуированные бактерии B.pertussis.

www.findpatent.ru

Медкомиссия в Ташкенте (TIMC)

Резидент

Медкомиссия в Ташкенте (TIMC)

Может, где-то повторюсь, но вдруг кому-то окажется нужной наша история. 16 апреля. Сегодня прошли медкомиссию в Ташкенте. Когда записывалась по телефону, то уточнила что нужно иметь при себе. Итого взяли следующие документы: - паспорта - ксерокопии паспорта каждого члена семьи – 3 экз. - фотографии 3х4 каждого члена семьи – 1 шт. - ксерокопия вклейки фото ребенка - 3 экз. - письмо-приглашение на интервью - 3 экз. - прививочные сертификаты (если вы сделали прививки заранее) Стоимость осмотра на взрослого – 125$ и на ребенка - 75$ без учета прививок. Нашли клинику TIMC очень легко, от Северного вокзала (станция метро «Ташкент») ходит маршрутка №3. Охранники спросили, по какому вопросу и попросили предъявить паспорта. Сверили по своим данным и, вручив нам инструкцию по прохождению медкомиссии (в ней было написано какие документы нужно предоставить и что можно и нельзя делать на территории клиники), проводили в комнату ожидания, откуда нас должны были вызвать по громкой связи. Не прошло и двух минут, мы услышали свою фамилию. Прошли в регистратуру и отдали девушке имеющиеся документы. Она попросила остаться кого-нибудь одного, осталась я, а муж с ребенком удалились в комнату ожидания. Девушка сказала, чтобы я вырезала аккуратно без рамочек фотографии и возращалась в комнату ожидания. Первого вызвали мужа, почти следом пошла я с ребенком. Сначала проверили зрение у ребенка, затем у меня. Взвесили, замерили рост. Пока у меня проверяли зрение, ребенка увела другой врач. Она только спросила, болел ли он ветрянкой? Я честно сказала, что нет. Затем в другом кабинете измерили давление, взяли кровь из вены (у меня никогда не могут найти вену с первого раза, поэтому взяли из вены на запястье, было немного больно) и потом отвели в соседний кабинет. Там врач измерила пульс, температуру у моего сына и сказала, что необходимо сделать ему три прививки, в том числе от ветрянки. Врач попросила посадить сына на себя и держать его покрепче, чтобы он не дернулся. Врач и медсестра одновременно на раз, два, три сделали по одной прививке в обе руки, затем еще одну в правую руку. При этом они весело улыбались и хвалили сына, какой он смелый и не плачет. Только они это сказали, сын начал всхлипывать, тогда врач схватила приличного размера жестяную банку и со словами алей-оп, открыла крышку, а там полно чупа-чупсов. Выбирай! Естественно, слезы сразу исчезли. Беспокоит только, как бы он перенес такое количество прививок без температуры и реакции организма . Медсестра повела меня на рентген, в коридоре я встретилась с мужем. Спросила о прививках, он сказал, что обследующий его врач говорил о паротите. Мы действительно упустили ее из вида, у нас в прививочных сертификатах было указано ККВ (корь-краснуха-ветрянка). Я вспомнила об этом уже после, а сначала подошла к врачу, который обследовал мужа и сказала ему, что не нужно делать от паротита, что у нас есть эта прививка. Я думала, что прививка ККВ и есть та самая. Врач просто согласился и сказал, что не будем тогда делать. Затем мужа позвали на рентген, а меня с ребенком в очередной раз попросили пройти в комнату ожидания. Вскоре к нам присоединился муж. С нами одновременно проходила семья из Самарканда, муж, жена и двое детей лет 18 и 20. Они очень переживали, когда можно будет забрать результаты медкомиссии, так как им пришлось бы где-нибудь останавливаться на сутки, а они очень хотели вернуться домой в этот же день. Но результаты выдаются только на следующий день. Наконец, освободилась врач-терапевт, которая должна была осмотреть меня. Ряд стандартных вопросов: о болезнях почек, сердца, печени, перенесенных операциях, травмах, параличах, принимаю ли наркотики, алкоголь, курю, жалуюсь на потоотделение, судороги, были ли пробы суицида, обращалась ли я к психиатру. Все мои ответы она вносила сразу же в форму на компьютере и ставила галочки в моей карте. Так как я переболела в детстве гепатитом В, она спросила проверяла ли я недавно его наличие. Я сказала, что нет. Тогда мы проверим. Ок. Пощупала живот, грудь, затем дышите - не мышите, посмотрела ухо-горло-нос. И все, про прививки ни слова. Вы свободны. Я спрашиваю, все ли в порядке? Да, все хорошо. Идите в регистратуру. Девушка направила в кассу, там я оплатила ровно 400$ (за ребенка 150$ с учетом 3 прививок). Во-общем, больше всего досталось сыночку. Врачи без исключения вежливые и предупредительные, но уж очень молчаливые. В инструкциях по медкомиссии был пункт, что врач не влияет на выдачу визы и что задавать ему подобные вопросы не следует. Забыла сказать, что у мужа подскочило давление, наверное, переволновался. Я сама, когда вырезала фотки, чувствовала, как у меня ножницы в руках трясутся. Что же будет на интервью? Завтра поеду забирать пакеты с заключениями врачей, затем следующий этап… интервью.

Всем желаю, удачи и не нервничайте, все будет хорошо!!!

16.04.2008 Бронирование Отелей в США

Circuit advertisement

Гражданин

Re: Медкомиссия в Ташкенте (TIMC)

Поздравляю с прохождением медкомиссии! Еще один этап позади, всё будет ОК.

Новичок

Ответ: Медкомиссия в Ташкенте (TIMC)

ОГРОМНОЙ ВАМ УДАЧИ НА ИНТЕРВЬЮ!!! У ВАС ВСЁ ПОЛУЧИТСЯ! У МЕНЯ У САМОЙ ЗАВТРА МЕД.ОБСЛЕДОВАНИЕ. НЕМНОГО НЕРВНИЧАЮ. НА КАКОЕ ЧИСЛО У ВАС НАМЕЧЕНО СОБЕСЕДОВАНИЕ?

Америка - это страна, где за доллар можно купить запас аспирина на всю жизнь, и этого запаса хватает на две недели... (Джон Барримор)

Резидент

Ответ: Медкомиссия в Ташкенте (TIMC)

Новичок

Ответ: Медкомиссия в Ташкенте (TIMC)

я одиночка, заполняла только на себя. обследование прошло на самом деле мило и не так ужасно, как я себе представляла. хотя вначале нервиначала и мандражировала..всё прошла очень быстро, буквально за 20 мин. у меня собеседование 24 апреля..так что удача мне не помешает..

Америка - это страна, где за доллар можно купить запас аспирина на всю жизнь, и этого запаса хватает на две недели... (Джон Барримор)

Гражданин

Ответ: Медкомиссия в Ташкенте (TIMC)

rimati, умничка! Отличный рассказ! Я вспомнила как мы проходили медкомиссию. Удачи на интервью! Вперед и только вперед! я верю в тебя!

www.govorimpro.us

Смотрите также

• 
  Вакцина havrix
• 
  Вакцина гриппферон
• 
  Твинрикс вакцина
• 
  Вакцина нековак
• 
  Вакцины мерк
• 
  Вакцина глобфел
• 
  Ад вакцина
• 
  Вакцина токсоплазмоз
• 
  Вакцина перевод
• 
  Титр вакцины
• 
  Вакцина ппд