 |
|
|
|||||||||
|
Справочник химика 21. Пептидные вакциныПептидные вакцины - Справочник химика 21Изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований. [c.233] Как работник Всемирной организации здравоохранения вы должны найти оптимальный способ искоренения бешенства в популяциях диких животных. Предположим, что у вас есть пептидная вакцина и вакцина на основе вируса коровьей оспы выберите одну из них и обоснуйте ваше решение. [c.246]I Каким образом знание механизмов презентации антигена может помочь при конструировании пептидных вакцин [c.166] Разработка методов генетической инженерии позволила поставить вопрос о возможности получения высокоиммуногенных молекулярных вакцин против различных патогенных микроорганизмов, т. е. субъединичных или пептидных вакцин, синтезируемых в прокариотических или эукариотических клетках за счет экспрессии введенных в них чужеродных генов. Методы генетической инженерии обеспечивают принципиальную возможность наработки в больших количествах индивидуальных вирусных белков. [c.435] Какие подходы применяются при создании пептидных противовирусных вакцин [c.246] Пептиды имеют очень большое биомедицинское значение особенно велика их роль в эндокринологии. Пептидами являются многие важнейшие гормоны человека. Их часто назначают больным для коррекции соответствующей недостаточности. Самый известный пример—введение инсулина больным сахарным диабетом. Пептидами являются также различные антибиотики (валиномицин, грамицидин А) и некоторые противоопухолевые препараты (например, блеомицин). Разработанные в последние годы методы быстрого химического синтеза пептидов позволили наладить производство пептидных гормонов в значительных количествах это разрешило многие проблемы, поскольку обычно гормоны присутствуют в организме животных в очень малых концентрациях и их трудно выделить в количествах, достаточных для терапевтических целей. По той же технологии осуществляется синтез и других пептидов, которые ввиду их малого содержания тоже трудно выделять из природных источников в частности, это относится к вирусным пептидам, используемым в качестве вакцин. [c.33] Имея все это в виду, синтезировали химическими методами домены VP1 FMDV и проверили возможность создания на их основе пептидных вакцин. Каждый из пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 141—160, 151—160 и 200—213 С-концевого участка VP1 и аминокислотным остаткам 9—24, 17—32 и 25—41 N-конце-вого участка, сшили по отдельности с инертным [c.232] Пептидная вакцина (Peptide va ine) Короткая цепочка из аминокислот, индуцирующая образование антител к специфическому инфекционному агенту. [c.555]В последние пять лет были получены многие важные результаты в связи с чем неуклонно возрастала вера в то, что проблема укладки белковой молекулы будет решена уже в ближайшем будуш,ем. В настоящем обзоре оказалось невозможным обсудить в полном объеме перспективы указанной проблемы выскажем лишь некоторые соображения на этот счет. Необходимо заметить, что не все исследователи придерживаются одной точки зрения относительно главного направления предстоящих исследований. Например, Левитт и Шерага считают, что для успешного моделирования пространственной укладки белка весьма полезно использовать экспериментальные сведения о конформационных возможностях объекта. Очень информативны в этом отношении данные ЯМР, из которых легко можно получить многие межатомные расстояния в молекулах белков. В этом случае проблема заключается в том, чтобы обойтись минимумом экспериментальных сведений для достижения результата. Ясно также, что с развитием теории таких сведений будет требоваться все меньше и меньше. Во-вторых, в лаборатории автора было показано, что метод предсказания третичной структуры полностью применим к минибелкам , т. е. биологическим пептидам, содержащим до десяти аминокислотных остатков. Качество предсказания для белков длиной 100—200 остатков должно находиться в соответствии с назначением результата. Например, было показано, что достаточно приближенные расчеты вполне применимы для целей конструирования искусственных пептидных вакцин, которые после присоединения к молекуле-носителю приобретают имму-ногенные свойства и начинают производить антитела против изучаемого пептида. Можно надеяться также, что предварительное моделирование пространственной структуры задолго до получения исчерпывающих кристаллографических данных об объектах окажется полезным в биотехнологических исследованиях. Поэтому появление все большего числа работ, по-священных белкам с неизвестной третичной структурой, представляет гораздо больший интерес по сравнению с академическими, методическими работами, касающимися бе лков с уже имеющимися подробными данными о конформации. Фармакологов, нейрохимиков, иммунологов и генных инженеров как раз весьма мало интересуют расчеты белков с хорошо известной из эксперимента пространственной структурой для этих групп ученых крайне важны предсказательные расчеты белков, которые ими изучаются. [c.599] В том случае, когда главная (наиболее им-муногенная) антигенная детерминанта протек-тивного вирусного белка представлена непрерывной аминокислотной последовательностью, можно осуществить ее химический синтез и полученным синтетическим пептидом провести иммунизацию. Многочисленные эксперименты, выполненные в данном направлении, показали, что в некоторых случаях пептидные вакцины обеспечивают специфическую защиту организма от соответствующего вируса. [c.435] Пептидный синтез служит надежным средством доказательства строения природных пептидно-белковых веществ. Синтетические пептиды широко используются для структурно-функциональных исследований. С помощью химических методов удается получать аналоги биологически активных пептидов, в том числе циклические производные с заданными свойствами (например, с пролонгированным, усиленным или избирательным действием), а также аналоги с остатками небелковых аминокислот. Синтетические пептидные фрагменты белков применяются для изучения их антигенных свойств и получения специфичных к отдельным участкам полипептидных цепей антител, используемых в структурно-функщюналь-ном анализе и в создании диагностикумов и вакцин. Методами пептидного синтеза получаются (в том числе и в промышленном масштабе) многие практически важные препараты для медицины и сельского хозяйства. [c.124] Одним из многообещающих приложений клонотек пептидов является идентификация пептидных лигандов, имитирующих структурные эпитопы, образующиеся на поверхности белковых глобул в результате сворачивания полипептидных цепей, что сопровождается пространственным сближением аминокислотных остатков, расположенных в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга. С помощью пептидных клонотек возможна идентификация пептидных аналогов различных эпитопов небелковой природы. По-видимому, в ближайшем будущем возможно использование пептидных клонотек для получения новых лекарственных препаратов, создания диагностических средств и производства эффективных вакцин. В области конструирования новых лекарственных препаратов усилия исследователей могли бы быть направлены на создание пептидных лигандов, специфически взаимодействующих с рецепторами, представляющими медико-биологический интерес. Знание структуры таких лигандов позволило бы упростить получение на этой основе лекарственных препаратов небелковой природы. [c.344] Дальнейшее приближение к вакцинам против практически важных заболеваний получено на примере вируса гриппа [223]. Синтетический пептид, соответствующий последовательности 91-108 гемагглютинина этого вируса, присоединен к столбнячному токсоиду и полученный конъюгат введен животным в полном адъюванте Фрейнда. Продуцируемые в ответ антитела показали заметную кросс-реактивность к интактному вирусу штамма А/Тех/77 и ингибировали гемагглютинацию эритроцитов вирусом. Эти, а также некоторые другие результаты указывают на эффективность конъюгата в стимуляции противогриппозного иммунного ответа. Аналогично построенная вакцина получена на основе синтетических пептидных фрагментов субъединицы В холерного токсина и столбнячного ток- [c.146] Короткие пептиды Пептидные гормоны Ферменты Вирусные антигены Другие белки Лндивидуальные гены Контроль системы кровообращения Лечение нарушений метаболизма Диагностические и терапевтические процедуры Вакцины Терапевтические средства человеческие интерферон, серумальбумин и др. Лечение наследственных заболеваний [c.441] Исходно цель опытов с использованием рекомбинантных ДНК состояла в получении важных с медицинской и экономической точек зрения белков, например вакцин и межклеточных пептидных посредников (инсулина, гормона роста и оксигоцина). Идея заключалась в клонировании гена, кодирующего данный полипептид, встраивании его в плазмиду, которая реплицируется в Е. соИ таким образом, чтобы промотор Е. соИ регулировал транскрипцию, а затем в синтезе на рибосомах Е. соИ больших количеств нужного белка. Почему эта довольно прямолинейная схема оказалась сложнее, чем вначале предполагалось (разд. 7.8) Во-первых, в большинстве эукариотических генов имеются интроны, а в генах Е. соИ их нет у бактерий отсутствует механизм сплайсинга, и поэтому невозможно получить соответствующую данному эукариотическому гену мРНК. Во-вторых, из первичных продуктов трансляции многих эукариотических генов, в частности из предшественников полипептидных гормонов, может образоваться активный генный продукт лишь в результате специфического посттрансляционного процессинга, который в клетках Е. соИ не осуществляется. Наконец, успешному получению больших количеств многих эукариотических белков мешает их токсичность для бактериальных клеток, деградация бактериальными протеазами и нерастворимость в цитоплазме бактериальной клетки. [c.359] chem21.info Пептидные вакцины : Молекулярная биотехнология_Принципы и применение : Юридическая библиотекаДалее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны
Рис. 11.3. Обобщенный мембраносвязанный белок, внешние эпитопы (1—5) которого могут индуцировать иммунный ответ. для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конфор- мацию иммуногенного домена (рис. 11.3). Если это предположение верно, то короткие пептиды, имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин. Имея все это в виду, синтезировали химическими методами домены VP! FMDV и проверили возможность создания на их основе пептидных вакцин. Каждый из пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 141—160, 151—160 и 200—213 С-концевого участка VP1 и аминокислотным остаткам 9—24, 17—32 и 25—41 N-конце- вого участка, сшили по отдельности с инертным
Рис. 11.4. Короткие пептиды, сшитые с белком-переносчиком и служащие основой пептидной вакцины. белком-переносчиком (гемоцианином моллюска фиссурелии), чтобы предотвратить их разрушение, и ввели морским свинкам (рис. 11.4). Синтез антител в количестве, достаточном для зашиты животного от последующих FMDV-инфекций, наблюдался только при введении пептида 141—160. Введение же целого VP1 или пептидов 9—24, 17—32 и 25—41 индуцировало синтез антител в меньших количествах. Более длинный пептид, состоящий из аминокислотных остатков 141—158 и 200—213, которые были соединены двумя пролиновыми остатками, индуцировал эффективный синтез антител у морских свинок даже в том случае, когда он не был сшит с белком-носителем. Эта «двухпептидная» молекула оказалась эффективнее любого изолированного пептида и блокировала пролиферацию FMDV у крупного рогатого скота и морских свинок. Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой FMDV-вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142—160 VP1 FMDV, сшили с геном, кодирующим кбро- вый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы — в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP1 FMDV. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных FMDV-вакцин, содержащих домен 142—160 VPl-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуноген- ность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инакти- вированных FMDV-частиц, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего Р-галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP] FMDV, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142—160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сход ные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия. И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин. • Эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда. • Конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице. • Изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований. Генная иммунизация Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животно- го-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli- плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 103—104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для соз дания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами- хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных. Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. со//-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или ци- томегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы (рис. 11.5). Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигень ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена. Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в 100 80 60 40 20
10 12 14 Время, сут геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицирую- щегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В) у животных, но не у человека. Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент ас партат-р-полу- альдегид—дегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диами- нопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в 16 Рис. 11.5. Выживание мышей, иммунизированных вирусной ДНК. Тестируемых мышей иммунизировали Е. coli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А под контролем промотора вируса саркомы Рауса. Контрольным мышам вводили только плаз- мидную ДНК. По оси абсцисс отложено время, прошедшее после контакта животных с вирусом гриппа. asd-тене растут только в присутствии диамино- пимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не про- лиферируют. Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовалась Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения вакцин. bookzie.com пептидные вакцины | bloodjournalВ.А. Мисюрин ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Каширское ш., д. 24, Москва, Российская Федерация, 115478 Для переписки: Всеволод Андреевич Мисюрин, канд. биол. наук, Каширское ш., д. 24, Moсква, Российская Федерация, 115478; тел.: +7(985)436-30-19; e-mail: [email protected] Для цитирования: Мисюрин В.А. Теория и практика иммунотерапии, направленной против антигена PRAME. Клиническая онкогематология. 2018;11(2):138-49. DOI: 10.21320/2500-2139-2018-11-2-138-149 РЕФЕРАТ Антиген PRAME, представляющий собой значимую мишень для моноклональных антител, является онкоспецифическим маркером, который активен на всех стадиях дифференцировки опухолевых клеток, и вызывает спонтанный T-клеточный ответ. Поскольку белок PRAME экспрессируется примерно у каждого второго больного с солидными опухолями и онкогематологическими заболеваниями, иммунотерапия против данного антигена имеет значительные перспективы. В настоящем обзоре обсуждается механизм развития спонтанного иммунного ответа против PRAME и роль данного антигена в иммунном надзоре. Рассматривается процесс развития PRAME-специфических T-клеток. Оцениваются риски применения иммунотерапии против PRAME-экспрессирующей клетки. Обсуждаются достоинства и недостатки различных подходов в иммунотерапии, в т. ч. использование дендритноклеточных вакцин, вакцинирование антигеном PRAME, выведение специфических T-клеток и разработка специфических моноклональных антител. Объяснены возможные причины неудач некоторых видов иммунотерапии, представлены пути их преодоления. Поиск литературы, на которой основан данный обзор, проводился в базах данных Pubmed, Scopus и eLibrary по ключевому слову «PRAME». Рассмотрены только те публикации, в которых изучались различные аспекты или создавались средства иммунотерапии, направленной против антигена PRAME. Ключевые слова: PRAME, иммунотерапия, дендритноклеточные вакцины, пептидные вакцины, T-клеточные вакцины, терапевтические антитела. Получено: 19 декабря 2017 г. Принято в печать: 5 февраля 2018 г. Читать статью в PDF ЛИТЕРАТУРА
bloodjournal.ru Пептидные вакцины : Молекулярная биотехнология_Принципы и применение : Юридическая библиотекаДалее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны
Рис. 11.3. Обобщенный мембраносвязанный белок, внешние эпитопы (1—5) которого могут индуцировать иммунный ответ. для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конфор- мацию иммуногенного домена (рис. 11.3). Если это предположение верно, то короткие пептиды, имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин. Имея все это в виду, синтезировали химическими методами домены VP! FMDV и проверили возможность создания на их основе пептидных вакцин. Каждый из пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 141—160, 151—160 и 200—213 С-концевого участка VP1 и аминокислотным остаткам 9—24, 17—32 и 25—41 N-конце- вого участка, сшили по отдельности с инертным
Рис. 11.4. Короткие пептиды, сшитые с белком-переносчиком и служащие основой пептидной вакцины. белком-переносчиком (гемоцианином моллюска фиссурелии), чтобы предотвратить их разрушение, и ввели морским свинкам (рис. 11.4). Синтез антител в количестве, достаточном для зашиты животного от последующих FMDV-инфекций, наблюдался только при введении пептида 141—160. Введение же целого VP1 или пептидов 9—24, 17—32 и 25—41 индуцировало синтез антител в меньших количествах. Более длинный пептид, состоящий из аминокислотных остатков 141—158 и 200—213, которые были соединены двумя пролиновыми остатками, индуцировал эффективный синтез антител у морских свинок даже в том случае, когда он не был сшит с белком-носителем. Эта «двухпептидная» молекула оказалась эффективнее любого изолированного пептида и блокировала пролиферацию FMDV у крупного рогатого скота и морских свинок. Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой FMDV-вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142—160 VP1 FMDV, сшили с геном, кодирующим кбро- вый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы — в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP1 FMDV. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных FMDV-вакцин, содержащих домен 142—160 VPl-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуноген- ность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инакти- вированных FMDV-частиц, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего Р-галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP] FMDV, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142—160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сход ные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия. И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин. • Эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда. • Конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице. • Изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований. Генная иммунизация Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животно- го-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli- плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 103—104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для соз дания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами- хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных. Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. со//-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или ци- томегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы (рис. 11.5). Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигень ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена. Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в 100 80 60 40 20
10 12 14 Время, сут геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицирую- щегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В) у животных, но не у человека. Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент ас партат-р-полу- альдегид—дегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диами- нопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в 16 Рис. 11.5. Выживание мышей, иммунизированных вирусной ДНК. Тестируемых мышей иммунизировали Е. coli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А под контролем промотора вируса саркомы Рауса. Контрольным мышам вводили только плаз- мидную ДНК. По оси абсцисс отложено время, прошедшее после контакта животных с вирусом гриппа. asd-тене растут только в присутствии диамино- пимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не про- лиферируют. Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовалась Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения вакцин. bookzie.com Презентация на тему: Субъединичные пептидные вакцины •Химическими методами синтезировали белковые домены, идентичные поверхностным белкам патогенного для морских свинок вируса, и сшили их поотдельности с инертным белкомпереносчиком (для предотвращения их разрушения) •Ввели морским свинкам. •Наблюдался ярковыраженный иммунный ответ. Но доза такой вакцины 2. Генетически аттенуированные вакциныВакцины, содержащие целые живые м/о, но с удаленными генами, кодирующими домены вирулентности Создание генетически аттенуированных вакцин•Патогенный м/о подвергают генетической модификации: –делетируют (delet - удалять) гены, ответственные за вирулентность или за жизненноважные функции м/о; –но (ВАЖНО!!!) сохраняют АГкодирующие домены ДНК Создание генетически аттенуированных вакцинОсновное требование: эти вакцины, являясь живыми, не должны ревертировать и становиться патогенными. Для предупреждения ревертирования необходимо: –Делетировать, как минимум, 2 области ДНК: кодирующую вирулентность м/о и какую-либожизненно важную функцию; –вероятность их одновременного восстановления очень мала. Генетически аттенуированная противосальмонеллезная вакцина•Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, брюшной тиф, пищевую токсикоинфекцию. •Аттенуированные штаммы сальмонеллы получают путем делеции отдельных доменов в генах ARO, кодирующих ферменты биосинтеза ароматических соединений и генахPUR, кодирующих ферменты метаболизма пуринов. •Такие штаммы вызывают легкую форму инфекции и обладают в 1 000 000 раз меньшей вирулентностью. Генетически аттенуированная вакцина вибриона холеры•Находится в стадии разработки •Актуально, т.к. используемая в настоящее время – на основе холерных вибрионов, убитых фенолом, обеспечивает частичную защиту на ограниченное время – не более 3-6месяцев
3. Векторные вакциныЖивые вакцины, полученные путем клонирования генов, кодирующих основные АГ патогенного м/о, и встраивания их в геном непатогенного носителя (обычно вируса)  В качестве непатогенного носителя используют ВКО – вирус коровьей оспы
 Встраивание в ДНК ВКО гена, кодирующего АГ• Если в геном ВКО встроить чужеродный ген, кодирующий АГ, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем клетки-хозяина. • Можно встроить ДНК, кодирующую несколько АГ. • Таким образом получают векторные ПОЛИвакцины на основе ВКО, которые позволяют провести Векторные вакцины на основе ВКО•В геном ВКО уже удалось встроить и экспрессировать в культуре животных клеток несколько генов антигенных белков: АГ-белкавируса бешенства, АГ гепатита В, белков вируса гриппа. •ВКО остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды через замораживание) и не обладает онкогенными свойствами. Поэтому широко используется для создания векторных вакцин. •С его помощью в организм-хозяина(человека) доставляют и экспрессируют гены, кодирующиеАГ-белки,которые в свою очередь индуцируют выработку АТ. studfiles.net |
.jpg)
 г.Самара, ул. Димитрова 131 [email protected] |
 |