bio.fizteh.ru

Противоопухолевые ДНК-вакцины - vechnayamolodost.ru

Frontiers in Bioscience 11, 1189-1198, January 1, 2006DNA VACCINES FOR CANCERDenise R. Shaw, Theresa V. StrongМедицинский факультет, кафедра гематологии и онкологии и комплексный онкологический центр университета штата Алабама (Бирмингем).

Перевод: Евгения Рябцева, портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru

Оглавление 1. Резюме 2. Введение 3. Перенос генов для иммунизации  4. Механизм развития иммунного ответа при ДНК-вакцинации 5. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа  6. Стратегии усиления иммунного ответа 7. Клинический опыт использования ДНК-вакцин 8. Перспективы 9. Благодарность10. Литература

1. Резюме

ДНК-вакцины, также называемые генетическими, плазмидными или полинуклеотидными вакцинами, представляют собой относительно простой и экономичный метод применения переноса генов для иммунизации против опухолеспецифических антигенов. В данном обзоре обсуждаются потенциальные преимущества ДНК-вакцин для иммунотерапии рака по сравнению с традиционными белковыми вакцинами и вирусными векторами. Кроме того, в статье описаны предполагаемые механизмы индукции иммунного ответа, развивающегося в ответ на ДНК-иммунизацию. Проанализированы также имеющиеся на настоящий момент результаты доклинических разработок ДНК-вакцин и клинический опыт ДНК-иммунизации в лечении рака. Низкий уровень токсичности, присущий ДНК-вакцинам, свидетельствует в пользу продолжения работы в этом направлении, однако для успешного внедрения этого подхода в клиническую практику необходима разработка дополнительных стратегий повышения эффективности существующих препаратов.

2. Введение

При производстве первых противоопухолевых вакцин в качестве агентов, вызывающих иммунный ответ на ассоциированные с опухолями антигены, использовали белки или клетки. Методики переноса генов предоставили новые возможности стимуляции иммунного ответа. Среди спектра методик, разрабатываемых для клинического применения, ДНК-вакцины (также называемые нуклеиновыми, полинуклеотидными, плазмидными или генетическими вакцинами) появились как эффективный новаторский метод запуска антигенспецифичного противоопухолевого иммунного ответа.

ДНК-вакцинация основана на использовании плазмидных (кольцевых) молекул ДНК, кодирующих целевой антиген. Этот метод доставки обладает рядом преимуществ, наиболее важным из которых, возможно, является то, что он запускает как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Синтез закодированного в плазмиде белка in vivo обеспечивает его дальнейший процессинг для презентации в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) I класса, что способствует формированию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) I класса. Цитотоксические Т-лимфоциты считают важными медиаторами противоопухолевого иммунного ответа, а их активация в ответ на опухолевые антигены играет решающую роль в эффективности противоопухолевых вакцин. Кроме того, в отличие от белковых вакцин, производимых с помощью бактерий, синтез антигена in vivo обеспечивает правильный фолдинг (сворачивание в трехмерную структуру) и посттрансляционное модифицирование белковой молекулы. Вакцины на основе ДНК также вызывают долговременную экспрессию антигена и, соответственно, стойкий иммунный ответ.

К дополнительным факторам, благоприятствующим разработке плазмидных стратегий ДНК-иммунизации, относятся относительная простота и низкая стоимость производства таких вакцин, а также их стабильность. Как более детально описано ниже, ДНК-вакцины, производимые с помощью бактерий, по своей природе являются иммуностимуляторами, что обусловлено присутствием в их структуре неметилированных цитозин-гуаниновых динуклеотидов (cytosine guanine (CpG) dinucleotides). Эта последовательность стимулирует неспецифический иммунный ответ, не препятствующий повторным введениям вакцины. Такая особенность выгодно отличает ДНК-вакцины от вакцин на основе вирусов, эффективность которых может сильно снижаться из-за предсуществовавшего или индуцированного вектором иммунного ответа (1,2). Параметры безопасности также свидетельствуют в пользу полинуклеотидных вакцин по сравнению с вирусными, так как при работе с ними не существует риска рекомбинации с вирусами дикого типа и очень низок риск инсерционного мутагенеза. И, наконец, ДНК-вакцины можно использовать для быстрой доставки нескольких эпитопов и даже нескольких антигенов в одной инъекции, что, учитывая склонность опухолей к уклонению от иммунного распознавания путем утраты антигенных вариантов, является очень важным фактором (3).

Несмотря на эти потенциальные преимущества и многообещающие результаты доклинических исследований, в клинических условиях противоопухолевые ДНК-вакцины до сих пор демонстрировали минимальную активность. Многие опухолевые антигены не содержат мутаций, поэтому развитие направленного против них иммунного ответа подразумевает способность иммунной системы распознавать и запускать эффективный ответ против «собственного» антигена организма. Результаты предварительных исследований свидетельствуют о том, что этого достаточно сложно добиться в отношении опухолей человека. Поэтому повышение активности и, соответственно, клинической эффективности полинуклеотидных вакцин стало основной целью работы в этой области исследований. Предлагаемый вашему вниманию обзор дает представление о ряде подходов, разработанных с целью преодоления этих ограничений и в настоящее время тестируемых на доклинических моделях.

3. Перенос генов для иммунизации

Предпосылкой к разработке вакцин на основе нуклеиновых кислот послужило наблюдение Wolff и др., которые установили, что внутримышечное введение депротеинизированной ДНК ведет к экспрессии закодированного в ней гена клетками мышечных волокон (4). Последующие работы продемонстрировали применимость этого подхода к экспрессии чужеродных генов в клетках различных видов, начиная от рыб (5) и заканчивая приматами (кроме человека) (6). Несмотря на низкую эффективность процесса, введенная внутримышечно ДНК проникает внутрь мышечных волокон через ямки на поверхности миоцитов и Т-канальцы (7,8). ДНК сохраняется в ядрах клеток-рецепторов в экстрахромосомной форме, однако ее экспрессия регистрируется в течение длительного периода времени (9), продолжительность которого зависит от иммуногенности закодированного в ней белка. Используя плазмиду, кодирующую белок вируса гриппа – нуклеопротеин А, – Ulmer и др. впервые продемонстрировали способность внутримышечного введения ДНК, кодирующей вирусный белок, презентируемый антигенпрезентирующими клетками (АПК) в комплексе с антигенами MHC класса I, вызывать опосредуемый CD8+ Т-лимфоцитами защищающий от инфицирования иммунный ответ (10). Результаты этого исследования послужили доказательством целесообразности разработки ДНК-вакцин для лечения различных заболеваний, в том числе рака.

Индукция клеточного и гуморального иммунного ответа при введении ДНК-вакцин не ограничена внутримышечным введением. Кожа содержит много АПК, таких как незрелые клетки Лангерганса в эпидермисе и зрелые дендритные клетки (ДК) в дерме. Tang и др. продемонстрировали способность проникающей через кожу ДНК запускать иммунный ответ на закодированный в ней белок (11). В рамках этой работы ДНК осаждали на золотые микрочастицы, которые наносили на кожу под давлением с помощью баллистического устройства (12). Этот процесс, обычно называемый доставкой генов с помощью генной пушки, не травмирует кожный покров и для формирования иммунного ответа требует гораздо меньше ДНК, чем внутримышечное введение (13,14). Индукцию эффекторных ЦТЛ, опосредующих отторжение опухолей, впоследствии продемонстрировали на мышиной модели перевиваемых опухолей (15). Внутрикожную иммунизацию можно также осуществлять посредством инъекций депротеинизированной ДНК или введения покрытых ДНК наночастиц с помощью систем для безыгольного впрыскивания (16). Рассматривают также вариант нанесения ДНК-вакцин на слизистые оболочки, что, в первую очередь, актуально для иммунизации против инфекционных заболеваний (17), однако может быть применимо и для лечения рака (18). И, наконец, несмотря на относительно короткое время полураспада в кровотоке, работы по внутриселезеночному введению ДНК-вакцин (19) продемонстрировали, что стратегии, способствующие поглощению внутривенно введенной ДНК спленоцитами, могут приводить к формированию гуморального и клеточного иммунного ответа. То, что все эти методы доставки приводят к синтезу антигенов и индукции антигенспецифичного иммунного ответа, указывает на универсальность ДНК-вакцинации. Важным моментом является также то, что различные методы введения вакцин могут приводить к развитию качественно отличающихся иммунных реакций (20,21), а их относительную эффективность для человека еще предстоит определить.

4. Механизм развития иммунного ответа при ДНК-вакцинации

Изучение способности ДНК-вакцин вызывать развитие клеточного иммунного ответа подготовило почву для их разработки в качестве средства противоопухолевой терапии. Механизмы индукции иммунного ответа при ДНК-иммунизации до сих пор не до конца ясны, однако, судя по всему, они включают процессинг антигена с помощью эндо- и экзогенных механизмов, обеспечивающих презентацию антигена в комплексе с белками MHC I и II класса. ДНК может трансфектировать как клетки-мишени (например, миоциты при внутримышечном введении), так и входящие в состав ткани АПК. Несмотря на то, что миоциты синтезируют закодированный в ДНК белок, только АПК обеспечивают костимуляторный сигнал, необходимый для эффективной активации ЦТЛ. Результаты ряда работ указывают на то, что центральная роль в индукции иммунного ответа на ДНК-иммунизацию принадлежит АПК костномозгового происхождения (22-25). Эти данные предполагают «перекрестную презентацию» антигена антигенпрезентирующими клетками. Антиген синтезируется миоцитами и переносится в АПК таким образом, что процессированные пептиды презентируются на их поверхности в комплексе с белками MHC I класса, наделяя АПК способностью непосредственно активировать ЦТЛ. Это противоречит обычной ситуации, когда белки, попадающие в АПК экзогенным путем, перемещаются в эндолизосомальную систему для деградации и презентации в комплексе с молекулами MHC II класса. Альтернативно либо дополнительно может происходить трансфекция самих АПК нуклеиновой кислотой (26,27). In vivo синтез антигенов в цитоплазме АПК обеспечивает презентацию пептидов в комплексе с молекулами MHC I класса. Презентация антигена совместно с молекулами MHC I и II класса в присутствии соответствующих костимуляторных молекул, экспрессируемых АПК, ведет к активации как CD4+, так и CD8+ T-клеток, обеспечивая одновременное развитие клеточного и гуморального иммунного ответа.

Создание с помощью нокаута генов мышиных моделей с избирательными нарушенными элементами иммунной системы позволило сформулировать более четкое определение факторов, критичных для индукции эффективного иммунного ответа (28). Изучение механизмов отторжения опухолей, опосредованное терапевтической ДНК-вакциной в трансгенной мышиной модели рака молочной железы, продемонстрировало скоординированное функционирование CD4+ и CD8+ клеток, антител, Fc-рецепторов, перфоринов, гамма-интерферона, CD1d-рестриктированных Т-лимфоцитов с активностью неспецифических киллеров (NKT) и макрофагов, а также важную роль активированных нейтрофилов, способных непосредственно лизировать опухолевые клетки и повреждать питающую опухоли сосудистую сеть (29,30).

5. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа

Ряд характеристик ДНК-вакцин определяет характер и выраженность вызываемого ими иммунного ответа. Состав ДНК является первоочередным параметром, характеризующим плазмидные вакцины. Динуклеотид CpG относительно слабо представлен в геноме млекопитающих, и богатые CpG зоны ДНК часто метилированы в результате функционирования механизма регуляции транскрипции. Синтезируемые бактериями ДНК-плазмиды, напротив, содержат неметилированные динуклеотиды CpG, распознаваемые механизмами врожденного иммунитета как показатель присутствия патогена (31). Эти последовательности распознаются toll-подобными рецепторами-9 (toll-like receptor 9, TLR9) и запускают активацию ДК, макрофагов, натуральных киллеров и NKT-клеток (32,33). В результате последовательности CpG, входящие в состав плазмид либо очищенных олигодеоксинуклеотидов (ОДН), являются мощными адъювантами и могут запускать иммунный ответ, опосредованный Т-хелперами 1 типа (Тх1) (34). ОДН, содержащие CpG, также оказывают антиапоптотический эффект на CD4+ и CD8+ клетки (35). Присутствие CpG-последовательностей значительно усиливает общую иммуногенность ДНК-вакцин.

Кроме состава нуклеиновых кислот, важным фактором, определяющим иммунный ответ, является уровень экспрессии трансгена. В целом, повышенная экспрессия иммуногена усиливает иммунный ответ. Поэтому для обеспечения эффективной транскрипции закодированного в плазмиде гена необходим сильный промотор, а оптимизированные сигналы полиаденилирования и наличие нетранслируемых регионов могут способствовать экспрессии трансгена (36). Активность цитомегаловирусного раннего промотора/энхансера, широко используемого для запуска экспрессии закодированной последовательности, можно усилить путем встраивания дополнительных последовательностей, например, выделенных из ДНК аденоассоциированного вируса (37).

При создании оптимизированного вектора метод его введения также влияет на развивающийся иммунный ответ. В предыдущем разделе обсуждалось, что различные методы ДНК-иммунизации ведут к развитию клеточного и гуморального иммунного ответа, однако природа иммунного ответа, развивающегося при использовании различных подходов к иммунизации, может отличаться качественно (20,21,38,39,40). В целом, введение ДНК с помощью генной пушки запускает иммунный ответ с более выраженным участием Т-хелперов-2 (Тх2), характеризующийся сильным гуморальным компонентом, не очень эффективным при лечении опухолей. Однако этот эффект можно модифицировать посредством одновременного введения цитокинов, стимулирующих активность Тх1 (41). На характер иммунного ответа можно также повлиять путем подбора оптимальных доз и схем вакцинации (13,42).

Антигенность закодированного белка чрезвычайно важна для формирования эффективного иммунного ответа. То, что большинство опухолевых антигенов являются «собственными», является труднопреодолимым барьером на пути к разработке эффективных методов иммунотерапии рака. Изменение антигенности белка или стимуляция его поглощения АПК являются ключевыми моментами, рассматриваемыми в аспекте решения этой проблемы. Локальный профиль цитокинов также играет важную роль в формировании окончательного иммунного ответа. Оптимизация всех этих факторов с целью максимального повышения эффективности иммунного ответа при ДНК-иммунизации стала основной целью исследований.

6. Стратегии усиления иммунного ответа

ДНК-вакцины продемонстрировали свою перспективность в отношении стимуляции эффективной реакции ЦТЛ в ответ на неоантигены, однако слабые антигенные характеристики многих опухолей требуют большей эффективности противоопухолевых вакцин для обеспечения целесообразности их клинического применения. Поэтому многие исследования посвящены усилению вызываемого ДНК-вакцинами иммунного ответа. Ученые проанализировали каждый аспект вакцинации, от введения нуклеиновой кислоты до модификации закодированного в ней антигена и изменения микроокружения для максимального усиления иммунного ответа и его сдвига в сторону участия Тх1 (табл. 1). Универсальность ДНК-вакцин является важным преимуществом, так как и с нуклеиновой кислотой, и с закодированным антигеном можно проводить различные манипуляции.

Таблица 1. Стратегии усиления эффективности полинуклеотидных противоопухолевых терапевтических вакцин.

Ваша корзина В корзине 0 товаров Заказать Очистить Каталог товаров Масла REDLINE Масла MOTUL AVS продукция

ГлавнаяВакциныДнк вакцины Противоопухолевые ДНК-вакцины. Днк вакцины Днк вакцина ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И.ПИРОГОВА» (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России) Реферат на тему: « ДНК-вакцины » Выполнил: студент 212 группы лечебного факультета Киселёв Олег Содержание 1 История создания 2 Конструирование ДНК-вакцины 3 Способы доставки ДНК-вакцин в клетку 3.1 Микроинъекция 3.2 Электропорация 3.3 Сонопорация 3.4 Баллистическая трансфекция 3.5 Под действием высокого давления 3.6 В составе живого бактериального вектора 3.7 Упаковка в липосомы 3.8 В составе полиплексов 4 Механизм развития иммунного ответа 5 Стратегии повышения эффективности ДНК-вакцины 5.1 Оптимизация транскрипционных элементов 5.2 Оптимизация антигена 5.3 Включение адъювантов 5.3.1 Иммуностимулирующее действие бактериальных CpG динуклеотидов 5.3.2 Экспрессия цитокинов и других иммуномодуляторов 6 Преимущества и недостатки ДНК-вакцин 7 Применение ДНК-вакцин 8 Перспективы ДНК-вакцинации 8.1 Противоопухолевые ДНК-вакцины 8.2 ДНК-вакцины против вирусных и бактериальных возбудителей 8.3 ДНК-вакцины и лечение аутоиммунных заболеваний 9 Примечания 10 Литература 11 Ссылки ДНК-вакцина (также генная вакцина, вакцина на основе нуклеиновых кислот) — генно-инженерная конструкция, которая после введения вклетку обеспечивает продуцирование белков патогенов или опухолевыхантигенов и вызывает иммунную реакцию. Введение ДНК-вакцин в организм называют генетической иммунизацией. ДНК-вакцинация имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными вакцинами. В частности, показано, что такие вакцины обеспечивают не только выработку антител (гуморальный иммунитет), но и специфический цитотоксичный ответ(клеточный иммунитет), что ранее было достижимо только с помощью живых вакцин. Сегодня ДНК-вакцины не применяют для лечения человека, однако прогнозируется, что генетическая иммунизация поможет преодолеть целый ряд заболеваний. История создания Идея использовать фрагменты ДНК для вакцинации появилась в 50-60-е годы. После серии опытов было установлено, что генетическая информация ДНК сохраняет способность транскрибироваться и транслироваться после переноса в другую клетку. В том же году обнаружили, что введение животным генома вируса полиомиелита стимулирует выработку антител. Позже активацию гуморального иммунитета показали для молекул ДНК, полученных из неинфекционных агентов. Начиная с 90-х годов научные лаборатории начали всё активнее исследовать иммуностимулирующие свойства ДНК. В 1992 году Танг вместе с коллегами показал, что ген гормона роста человека, встроенный в плазмиду, стабильно экспрессируетсяв организме мыши, а синтезированный гормон распознаётся иммунной системой как антиген и стимулирует выработку антител. Процесс ввода плазмидной ДНК для стимуляции гуморального иммунитета был назван Тангом «генетическая иммунизациия». Однако уже в следующем году другая группа учёных заявила, что введение плазмиды, кодирующей белки вируса гриппа, вызывает как гуморальный, так и клеточный ответ. Индуцирование обеих ветвей иммунитета в том же году обнаружили и для плазмиды, содержавшей гены ВИЧ. С 1995 года начали появляться данные, что ДНК-вакцинация способна активировать иммунную систему против раковых заболеваний. Около 20 лет назад состоялись первые клинические испытания ДНК-вакцин, которые прежде всего должны были продемонстрировать безопасность нового метода. Пациентам вводили гены ВИЧ, вируса гриппа, герпеса, гепатита B, возбудителя малярии. Результаты всех тестов оказались вполне обнадеживающими: ДНК-вакцины стабильно экспрессировались, провоцировали иммунный ответ и не вызвали серьезных побочных эффектов, что стало толчком для их дальнейшего исследования. Конструирование ДНК-вакцины Структура ДНК-вакцины, созданной на основе плазмидного вектора. Ориджин (с англ. origin) — точка начала репликации. По структуре ДНК-вакцина — это встроенная в вектор нуклеотидная последовательность, кодирующая определённый антиген или антигены. Вектором в генной инженерии называют молекулунуклеиновой кислоты, которая служит для доставки генетического материала в клетки и обеспечивает его репликацию или экспрессию. Ранее для транспортировки генов в клетку применяли векторы на основе вирусов: модифицированного (ослабленного) вирусанатуральной оспы, аденовирусов и ретровирусов. Вирусные векторы являются достаточно эффективными, однако имеют значительную вероятность развития побочных эффектов, связанную с относительно высокой иммуногенностью самого вектора. Поэтому на сегодня в качестве вектора чаще используют бактериальную плазмиду — небольшую стабильную кольцевую молекулу ДНК, способную к автономной репликации. Сама по себе плазмида не вызывает нужного специфического иммунного ответа, для этого в неё вшивают гены иммуногенных белков. Также ДНК-вакцина должна содержать регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках эукариот. Готовую ДНК-конструкцию доставляют в бактериальную клетку, где наращивается количество её копий. После этого проводят выделение и очистку плазмид, которые несут нужную вставку. Дизайн плазмидного вектора Важным этапом создания ДНК-вакцин является дизайн (конструирование) вектора. Обязательными структурами плазмидного вектора являются сайты рестрикции, селективный маркер и точка начала репликации ДНК-вакцины вбактериальной клетке. Чтобы осуществлялся синтез антигена, ДНК-вакцина должна содержать промотор и сигнал полиаденилирования. Промотор является важным фактором эффективности вакцины, поскольку определяет силуиммунного ответа: чем больше экспрессия гена, кодирующего вирусный или опухолевый антиген, тем сильнее иммунный ответ. Чаще всего используют промотор вируса SV40 или цитомегаловируса (CMV). Для стабилизации мРНК-транскриптов в плазмиду встраивают сигнал полиаденилирования, чаще всего полученный из гена гормона роста быка (BGH) или вируса SV40. В качестве селективных маркеров выбирают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам; часто это ген устойчивости к канамицину. При конструировании ДНК-вакцин наиболее популярна точка начала репликации Escherichia coli. Выбор гена для иммунизации Вектор является важным компонентом ДНК-вакцины, однако её иммуногенность определяется именно вставкой — последовательностью ДНК, которая кодирует антиген. Среди вирусных антигенов для иммунизации лучше всего подходят белки слияния — это относительно консервативные белки, которые обеспечивают проникновение вируса в клетку. Для вакцинации против граммположительных бактерий в плазмидный вектор целесообразно встраивать гены тех бактериальных белков, которые определяют патогенез заболевания. Среди белков грамотрицательных бактерий высокую иммуногенностьимеют порины. Для терапевтических противоопухолевых ДНК-вакцин используют белки-маркеры раковых клеток[15]. Способы доставки ДНК-вакцин в клетку Готовую вакцину нужно доставить в организм человека или животного, где её точка азначения — антигенпредставляющие клетки (АПК) — макрофаги, дендритные клетки, B-лимфоциты. Здесь будет происходить синтез и посттрансляционная модификация антигена, после чего он будет встроен в мембрану клетки, чтобы привлечь внимание иммунной системы. Основная проблема заключается в доставке достаточного количества плазмиды в АПК. Методы доставки генетического материала в клетку обычно разделяют на 2 группы: вирусные и невирусные. Поскольку вирусные векторы имеют ряд существенных недостатков, в данном разделе представлены лишь невирусные методы доставки ДНК-вакцин. Микроинъекция В начале 1990-х для введения ДНК в клетку наиболее распространёнными были внутримышечные микроинъекции, что обусловлено простотой метода. Для этого ДНК растворяют в воде или изотоническом растворе, при необходимости добавляют адъювант (вещество, которое усиливает иммунный ответ). Далее с помощью тонкой стеклянной трубки раствор вводят в мышечную ткань, где роль АПК выполняют дендритные клетки. Попав в ядро дендритной клетки вакцина начинает экспрессировать, и происходит синтез белков-антигенов. С помощью микроинъекций ДНК также можно вводить подкожно, втимус, печень, опухолевую ткань, однако именно в мышечной ткани наблюдается наиболее длительная (до года) экспрессия ДНК-вакцины. Благодаря высокой концентрации клеток Лангерганса (подтип дендритных клеток), привлекательной мишенью для ДНК-вакцинации является кож]. Для интрадермального (подкожного) введения используют массив из микроигл, длина которых несколько сотен микрон. Существуют различные варианты интрадермальной вакцинации. Простейший включает разрыхление массивом микроигл рогового слоя кожи (внешний слой кожи, обычно 10-20 мкм), чтобы увеличить её проницаемость для дальнейшего местного введения раствора ДНК. Более эффективно использование микроигл, покрытых сухой вакциной, которая растворяется уже под кожей. Эффективность этого метода обычно низкая, поскольку сначала ДНК попадает в межклеточное пространство, а уже потом включается в клетки. Электропорация Принцип действия электропорации. Электрический ток перегруппировываетлипиды плазмалеммы таким образом, что образуется гидрофильный (сверху) илигидрофобный (снизу) канал. Прохождение гидрофильной молекулы ДНК возможно только через верхний вариант поры. Электропорация — традиционный подход для доставки ДНК в бактериальные клетки и культуры клеток, который базируется на применении электрического импульса. Такой импульс создает поры в клеточной мембране, что способствует вхождению отрицательно заряженной ДНК. Этот способ был заимствован для доставки ДНК-вакцины в организм животных и человека и позволяет значительно повысить эффективность обычной инъекции. Прибор для электропорации имеет источник электрического тока и одноразовую сетку, которая состоит из шприца и игл-электродов. Шприц вводит вакцину в мышечную ткань, а электроды создают электрическое поле, которое облегчает вхождение ДНК в миоциты и дендритные клетки. На сегодня разработаны устройства, которые позволяют повысить эффективность вакцинации в 1000 раз по сравнению с обычной инъекцией. Электропорацию можно применять как для внутримышечного, так и для подкожного введения ДНК-вакцины. Недостатками являются незначительная болезненность в месте инъекции, потребность в специализированных устройствах. Вместо электрического поля можно использовать магнитное. Такие устройства действуют по тому же принципу, однако в этом случае процедура является полностью безболезненной и менее повреждает клетки]. Действие электрического поля не только усиливает поглощение ДНК-вакцины клетками, но и стимулирует выработку иммунного ответа. Применение электропорации приводит к незначительному повреждению ткани — развивается локальный воспалительный процесс. Поврежденные клетки выделяют хемокины, поэтому к ним направляются макрофаги, лимфоциты и дендритные клетки. Увеличение концентрации иммунных клеток в месте введения вакцины повышает её эффективность. Сонопорация Сонопорация — метод переноса чужеродной ДНК в клетки с помощью ультразвука. Ультразвук увеличивает проницаемость клеточной мембраны, вследствие чего экзогенная ДНК легче проникает в клетку. Впервые сонопорация для переноса генов в клетку была применена в 1986 году. Этот метод применяется для ввода молекул ДНК в клетки роговицы, мозга, костнойткани, почек, поджелудочной железы, эмбриональной ткани, скелетной и сердечной мышц. Относительно других методов сонопорация является малоисследованной, необходимо ещё немало усилий, чтобы повысить её эффективность, особенно на уровне целого организма. Баллистическая трансфекция Баллистическая трансфекция основывается на обстреливании (бомбардировке) органов и тканей микрочастицами тяжёлых металлов (золото, вольфрам) диаметром 1-3 мкм, покрытых молекулами ДНК. Введённая таким образом ДНК-вакцина экспрессируется в клетках-мишенях, а их продукты попадают в кровь. Для придания ускорения частицам используются похожее на стрелковое оружие устройство — генный пистолет, или генную пушку. Микрочастицы проходят через клеточные мембраны и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядро клетки. Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика — до 1 мм, поэтому метод применяют преимущественно для трансфекции кожи или прилегающейхрящевой ткани. Особые условия обстрела позволяют микрочастицам проникать на глубину до 4-5 мм и переносить генные конструкции в волокна поперечно-полосатых мышц. Обычно клетки, находящиеся непосредственно по центру выстрела, погибают, в то время когда в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Эту технологию называют также биобаллистикою или биолистикой. Первый генный пистолет был создан группой учёных в период 1983 и 1986 годами с целью трансформации клеток растений. Это был пистолет, разработанный на основе устройства для автоматического забивания гвоздей. На вольфрамовый шар наносили ДНК с репортёрным (маркерным) геном и выстреливали им чашку Петри. Экспрессия репортёрного гена свидетельствовала об эффективности иммунизации. На сегодня для доставки ДНК используют частицы из золота илисеребра, так как они не являются токсичными для клетки, в отличие от вольфрамовых. Под действием высокого давления В 1999 году были разработаны инъекционные приборы, которые способны вводить ДНК-вакцину без использования иглы. Такие устройства работают благодаря силе Лоренца: небольшой мощный магнит создаёт значительное давление, проводит в действие поршень, который выбрасывает лекарственный препарат со скоростью звука. Изменяя силу тока, можно выбирать глубину инъекции и дозировать лекарства. Процедура совершенно безболезненна и раньше использовалась для введения инсулина больным диабетом и при проведении масштабных вакцинацийй[25]. Существенным недостатком этого метода является то, что высокое давление теоретически может изменять структуру вводимых молекул. Тем не менее, данную технологию ввода продолжают совершенствовать, и на сегодня разработаны приборы, которые могут доставить ДНК на глубину до 16 мм. В составе живого бактериального вектора Живые бактериальные векторы — это штаммы сальмонелла, шигеллы или листерия, которые несут мутации в генахбиосинтеза или инвазии, что устраняет их патогенность и способность сохранять свою жизнеспособность в организме хозяина или окружающей среде. Взамен в геном бактерий встраивают нужные гены иммуногенных протеинов. Ослабленная бактерия вводится в организм пероральным путем (через рот, путём проглатывания) или интроназально (путем впрыска вносовое отверстие), поэтому этот способ вакцинации не требует никакого оборудования. Кроме того, такое введение стимулирует иммунный ответ слизистой оболочки, что важно, поскольку большинство патогенов попадают в организм через ротовое и назальное отверстия. Минуя желудок ослабленная бактерия попадает в тонкий кишечник. Далее бактерия проникает в Пейеровы бляшки — лимфоузлы кишечника. Оказавшись в середине Пейеровых бляшек, бактерии становятся мишенью для макрофагов и подвергаются фагоцитозу. В цитоплазме макрофагов происходит высвобождение бактерией ДНК-вакцины, после чего ДНК попадает в ядро, а бактерия обезвреживается иммунной системой[18][28]. Упаковка в липосомы Липосома — шарообразное образование (около 100 нм в диаметре), состоящее из двойного липидного слоя. Липосомы имеют полость внутри, которая обычно заполнена растворителем, но может использоваться для доставки разнообразных веществ, в том числе и ДНК-вакцин. Их гидрофобная оболочка позволяет им сливаться с клеточными мембранами и переносить своё содержимое внутрь клетки. Использование липосом началось в 1965 г., и это стало мощным двигателем развития бионанотехнологий. Перспективным способом прямого введения ДНК-конструкции в клетки-мишени является доставка генетической конструкции в составе катионных липосом, построенных из положительно заряженных липидов. Катионные липосомы с отрицательно заряженной молекулой ДНК образуют ДНК-липидный комплекс — липоплекс. Преимущества применения таких комплексов — способность нести большой объём информации, неинфекционность, кроме того, они просты и недороги в изготовлении. В 2003 г. были созданы чрезвычайно малые — миллимикронные липосомы, покрытые полимером полиэтиленгликолем, которые способны проносить терапевтическую ДНК сквозь гемато-энцефалический барьер и доставлять её в нейроны головного мозга, что до этого было невозможным. В составе полиплексов Для введения в клетку ДНК-конструкций больших размеров (>10 т.п.н.) используют полиплексы — системы, состоящие из положительно заряженных полимеров (поликатионов) и отрицательно заряженных молекул ДНК. Размер таких комплексов составляет менее 100 нм, что, с одной стороны, не отдаёт их на переваривание макрофагам (поскольку они реагируют на частицы более 200 нм), а с другой стороны, они достаточно большие, чтобы не фильтроваться в почках. Поликатионы конденсируют молекулу ДНК в комплексы, и таким образом обеспечивают её стабильность и защиту от действия нуклеаз. В качестве ДНК-связующих полимеров могут служить катионные белки, синтетическиегомополимеры аминокислот (полилизины, полиаргинины), полисахарид хитозан, полиэтиленамин. Обычно в составе полиплексов поликатион находится в избытке, в результате чего данный комплекс является растворимым и положительно заряженным. Если к полиплексу пришить лиганд к определённому клеточному рецептору, то ДНК-вакцину можно направлять в конкретный тип клеток. Процесс доставки генетического материала в составе полиплексов включает два этапа: внеклеточный (путь от места введения к клеткам-мишеням) и внутриклеточный (взаимодействие с клетками-мишенями,эндоцитоз, выход из эндосом, доставка в ядро). Первым барьером, который необходимо преодолеть комплексу, являетсякровь и внеклеточный матрикс. Поэтому подбираются такие физико-химические параметры полиплекса, чтобы увеличить его стабильность, избежать нежелательных взаимодействий с белками крови и иммунной реакции, вызванной химической природой поликатиона. Попав в клетки-мишени, полиплекс адсорбируется на плазматической мембране, поглощается путём эндоцитоза, после чего он должен покинуть эндосому и диссоциировать на катионный полимер и молекулу ДНК. Свободная ДНК направляется в ядро, а катионый полимер покидает клетку и выводится из организма. Характеристика наиболее распространённых методов доставки ДНК-вакцин[18][16] Метод Преимущества Недостатки Внутримышечные или подкожные инъекции Не требуется специального оборудования Постоянная или длительная экспрессия ДНК разносится по близлежащим тканям Электропорация Генный пистолет Введение за счёт высокого давления Относительно простой метод Отсутствует потребность в микрочастицах ДНК может проникать на глубину от нескольких мм до 1,5 см Влияет на структуру ДНК Низкая эффективность иммунизации Требует большого количества ДНК (до 300 мкг) Упаковка в липосомы Высокая эффективность in vitro Простота изготовления Большая ёмкость Можно сочетать с другими методами При внутривенном введении вакцина потенциально может попадать во все ткани Интроназальный ввод обеспечивает экспрессию вакцины в слизистой оболочке носа и выработку иммуноглобулинов класса А (IgA) Механизм развития иммунного ответа[ Синтезированный в клетке антиген поддаётся процессингу, после чего происходит его представление иммунокомпетентным клеткам. Процессинг — это расщепление антигенного протеина на иммуногенные пептидные фрагменты. Представление означает подачу фрагмента антигена, соединённого с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) иммунокомпетентным клеткам. Различают два наиболее значимых класса этих молекул: ГКГ класса I (ГКГ-I) и ГКГ класса II (ГКГ-II). Для связывания с молекулами каждого класса антиген проходит подготовку в специализированных компартментах клетки. Эндогенные белки-антигены направляются на деградацию в протеасому, после чего представляются в комплексе с ГКГ-I на поверхности клетки. Здесь при встрече их распознают CD8+ T-клетки(Т-киллеры), которые реализуют цитотоксический иммунный ответ. Экзогенные белки расщепляются лизосомными протеазами, включаются в состав ГКГ-II и распознаются рецепторами CD4+ Т-клеток (Т-хелперов). Последние вызывают как клеточный, так игуморальный ответ. Пути процессинга антигена и формы иммунного ответа Локализация антигена Основной инструмент процессинга Антигенпредставляющий комплекс Клетки, которые распознают комплекс антиген-ГКГ Иммунный ответ В клетке Протеасома ГКГ-I Т-киллеры Цитотоксический Вне клетки Лизосома ГКГ-II Т-хелперы Клеточный, гуморальный Презентация антигена по пути ГКГ-I[ Схема презентации антигена по пути ГКГ-I ДНК-вакцинация предполагает эндогенный синтез антигена, поэтому этот путь является преобладающим. Процессинг антигена по пути ГКГ-I проходит в несколько этапов. Синтезированный в ядре белок транспортируется в цитоплазму, расщепляется протеасомой на короткие пептиды — эпитопы, которые специальными белками-транспортёрами антигенов (англ. ТАР, transporter associated with antigen processing) переносятся в эндоплазматический ретикулум(ЭПР). В ЭПР каждый эпитоп соединяется с молекулой ГКГ-I, после чего образованный комплекс направляется в аппарат Гольджи на гликозилирование. Оттуда комплекс в составе везикулы направляется к плазматической мембране. После слияния везикулы с плазмалеммой комплекс оказывается на поверхности клетки, где распознается рецепторами Т-киллеров, которые обладают цитотоксической активностью. Презентация антигена по пути ГКГ-II[ Основным источником пептидов, которые связываются с ГКГ-II, являются экзогенные белки, которые попали в клетку с помощью эндоцитоза. Однако показано, что некоторые внутриклеточные белки также могут быть представлены в комплексе с ГКГ-II. При этом новосинтезированные белки после попадания в цитоплазму переносятся в лизосомы, где антиген расщепляется под действием кислых протеаз. После этого лизосома, которая содержит эпитопы, сливается с везикулой, которая несёт молекулу ГКГ-II. Внутри объединённой везикулы образуется комплекс эпитоп-ГКГ-II, который после слияния везикулы с плазмалеммой выносится на поверхность клетки. Здесь этот комплекс распознается рецепторами Т-хелперов, в результате чего происходит их активация. Это приводит к стимуляции как клеточного (активация Т-киллеров), так и гуморального иммунитета (активация В-лимфоцитов). Традиционная вакцинация растворимыми белковыми антигенами нацелена на мобилизацию T-хелперов. Сравнительно низкий ответ Т-хелперов является одним из недостатков ДНК-вакцин. Также нынешнее поколение ДНК-вакцин не способно индуцировать продукцию высоких титров антител. Чтобы повысить активацию Т-хелперов, антиген нужно перенаправить на путь ГКГ-II. Для этого в ДНК-вакцину встраивают сигнал лизосомной локализации: синтезированный антиген будет направляться в лизосомы, а значит ступать на путь ГКГ-II. Стратегии повышения эффективности ДНК-вакцины Главный вопрос относительно будущего ДНК-вакцин касается повышения их эффективности. На сегодня проводится большое количество исследований, посвящённых оптимизации разработанных ДНК-вакцин. Поиск решения ведётся в двух направлениях: повышение экспрессии вакцины и увеличение иммуногенности закодированного антигена. Оптимизация транскрипционных элементов Важным компонентом ДНК-вакцины является промотор. Бактериальные промоторы не подходят для экспрессии антигена в клетках млекопитающих, поэтому вместо них использовали промоторы онкогенных вирусов. Сейчас, для повышения безопасности вакцин, их заменили на промоторы от неканцерогенных объектов, например, человеческого цитомегаловируса(CMV). Для большинства ДНК-вакцин этот промотор является оптимальным выбором: он характеризуется высокой экспрессией в широком диапазоне клеток. Для экспрессии гена в конкретных тканях, перспективным является использование промоторов, специфических для данного типа тканей. Например, использование промотора мышечнойкреатинкиназы при внутримышечном введении приводит к десятикратному увеличению синтеза антител и индукции Т-клеточного ответа, чем использование аналогичной ДНК-вакцины с CMV промотором. Также высокую эффективность вмиоцитах показал промотор гена десмина, который кодирует один из белков цитоскелета. Для повышения экспрессии ДНК-вакцины в кератиноцитах (клетки эпителиальной ткани) используют промоторы гена металлотионеина (белок, который связывает тяжёлые металлы) или гена гидроксилазы витамина D3. studfiles.net ДНК-вакцины (полинуклеотидные вакцины) Последние достижения генной инженерии и биотехнологии привели к бурному развитию совершенно нового направления вакцинологии — к ДНК-вакцинам. Основой ДНК-вакцины является бактериальная плазмида (автономная кольцевая ДНК из 4—6 тыс. пар нуклеотидов), способная эффективно размножаться в клетках Е. coli. В плазмиду генно-инженерными методами (используя ферменты рестриктазы, лигазы и т. д.) встраивают «смысловой» ген, кодирующий иммуногенный белок того вируса, от которого будет защищать ДНК-вакцина. На практике в качестве исходной плазмиды используют модифицированную плазмиду, содержащую эукариотический промотор (обеспечивает высокий уровень экспрессии генов) цитомегаловируса или обезьяньего вируса 40, или вируса саркомы Рауса, и сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования, позволяющие продуцировать иммуногенный белок вируса в клетках животных. Кроме того, в плазмиде есть ген устойчивости к антибиотику (например, к ампициллину), необходимому для ее селекции при клонировании и выращивании. Таким образом получают рекомбинантную плазмиду, которую выращивают (реплицируют) в необходимых количествах в бактериальных клетках Е. coli в присутствии ампициллина и после соответствующей очистки плазмиды используют для иммунизации животных. Обычно используют физиологический раствор, в котором во взвешенном состоянии находятся полученные плазмиды (это снимает проблему реактогенности препарата). Результаты исследования на лабораторных животных показали, что количество рекомбинантной плазмиды, необходимой для вакцинации при внутримышечном введении, может колебаться в пределах 0,001 — 10 мкг на 1 кг живой массы. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,01 — 1,0 %), а большая часть ее быстро разрушается. Проникшая в клетку ДНК транспортируется в ядро и транскрибируется (клеточной ДНК-зависимой PHK-полимеразой II) с образованием иРНК, которая в цитоплазме на рибосомах клетки обеспечивает синтез полноценного иммуногенного белка возбудителя, что приводит к образованию гуморального и клеточного иммунного ответа и, следовательно, к формированию напряженного иммунитета. Плазмидная ДНК функционирует в клетках до 3—6 мес. ДНК-вакцины можно вводить внутрикожно, внутримышечно, подкожно, внутривенно, интраназально, орально. Наиболее перспективными считают внутрикожный и внутримышечный методы. Заслуживают внимания результаты по так называемому баллистическому методу введения (gene gun), когда частички золота диаметром 1—2 мкм, покрытые плазмидной ДНК, с помощью специального прибора доставляют в клетки кожи. Для получения одинакового эффекта требуется ДНК в 100—5000 раз меньше, чем при внутримышечном способе введения. Механизм иммунного ответа при ДНК-вакцинации пока не совсем ясен. Однако имеющиеся данные позволяют предположить, что это выглядит следующим образом. Синтезированный в клетках белок расщепляется в плазматических протеосомах на короткие пептиды (8—16 аминокислот), представляющие собой отдельные эпитопы или антигенные детерминанты. Пептиды транспортируются белками-переносчиками в эндоплазматический ретикулум. Там они связываются с молекулами белков главного комплекса гистосовместимости класса I (ГКГС I) — мембранными гликопротеидами и транспортируются на поверхность клеток, где распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами. Последние активируются, размножаются, и образуется пул цитотоксических Т-лимфоцитов, способных обеспечить гибель клеток-мишеней, т. е. клеток, зараженных вирусом. Синтезированный в клетках иммуногенный белок может транспортироваться из клетки в межклеточное пространство. Он связывается с антигенпрезентирующими клетками (макрофагами), проникает в них путем эндоцитоза, расщепляется на короткие фрагменты (10—20 аминокислот) белка, которые объединяются с молекулами ГКГС класса II и транспортируются к поверхности клетки, где они узнаются соответствующими клонами Т-хелперов и В-клеток, что приводит к активации В-клеток и дифференцировке их в плазматические клетки, секретирующие антитела. Действие цитотоксических Т-лимфоцитов также стимулируется Т-хелперами посредством продукции ими цитокинов — медиаторов межклеточных взаимодействий. Таким образом, плазмидная ДНК с встроенным геном иммуногенного белка вируса индуцирует у животных полноценный гуморальный и клеточный иммунный ответ. Для усиления иммуногенных свойств ДНК-вакцин их вводят совместно с плазмидами, в которые встроены гены цитокинов (регуляторы иммунного ответа). Кроме того, введение ДНК-вакцин в липосомах или в микрокапсулах обеспечивает высокий уровень гуморального и клеточного иммунного ответа. В настоящее время сконструировано более 20 ДНК-вакцин против различных вирусных болезней животных и человека: бешенства, болезни Ауески, болезни Ньюкасла, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, лейкоза крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей, синдрома снижения яйценоскости, парвовирусной инфекции собак, СПИДа, герпесвирусных инфекций человека и др. ДНК-вакцины наиболее перспективны для профилактики болезней, склонных к длительному хроническому течению. Они обладают безопасностью инактивированных и эффективностью живых вакцин. Однако пока нет полных сведений о том, какова эффективность ДНК-вакцин при иммунизации ими людей. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) разработала унифицированные требования к ДНК-вакцинам. Эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, однако технология разработки этих вакцин находится в стадии становления и интенсивного изучения. Потребуется еще немало усилий для практической реализации нового подхода к профилактике вирусных болезней животных и человека. Примечание. Репликация плазмидной ДНК происходит только в бактериальных клетках, тогда как транскрипция гена иммуногенного белка осуществляется только в клетках млекопитающих. Опыты на животных показали, что плазмидная ДНК не реплицируется, не встраивается в хромосомы и на нее не образуется антител в организме животных. Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter. www.activestudy.info Днк вакцина Уровень инициации транскрипции, как правило, повышается за счёт использования сильного промотора и энхансеров, а особенности терминации могут стать ограничивающим фактором. Эффективность полиаденилирования и процессингапервичного РНК-транскрипта меняется в зависимости от последовательности polyA-сигнала. То есть, последовательность полиаденилирования влияет на синтез антигена. Например, широко используемый polyA-сигнал вируса SV40 имеет меньшую эффективность, чем сигнал полиаденилирования гена β-глобина кролика или гена гормона роста быка. Для эффективной трансляции мРНК млекопитающих должна иметь так называемую последовательность Козак. Вставка этой последовательности в ДНК-конструкцию может существенно увеличивать уровень синтеза антигена. Чтобы РНК-полимераза не проскочила стоп-кодон гена и не состоялся синтез удлинённого протеина, который не сможет потом получить правильную укладку, ген можно заканчивать двойным стоп-кодоном[36]. При конструировании ДНК-вакцины также пытаются оптимизировать её кодоны. Процедура оптимизации означает замену границ в последовательности гена таким образом, чтобы аминокислотная последовательность белка не менялась, но увеличивалась эффективность трансляции его мРНК. Причиной является то, что большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном. Каждый кодон имеет свою тРНК, и представленность различных тРНК в клетке неодинакова, причём она также варьирует в зависимости от вида организма. Кодоны подбирают таким образом, чтобы наличие нужной тРНК при синтезе антигена не стало лимитирующим фактором. Оптимизация антигена Хотя сила иммунного ответа коррелирует с уровнем экспрессии ДНК-вакцины, однако для каждого антигена существует определённое плато, после которого увеличение количества антигенного протеина не будет повышать продукцию антител. В то же время, достичь более сильной иммунной реакции можно за счёт оптимизации антигена. Например, путём объединения антигена с лигандом до определённого рецептора антигенпредставляющей клетки (АПК). Таким лигандом может быть маркерный белок CD40, внеклеточный домен Fms-подобной тирозинкиназы-3 или антиген-4 Т-киллеров. За счёт взаимодействия лиганд-рецептор повышается эффективность захвата антигенного протеина АПК. Облегчение деградации антигена в протеасоме или лизосоме также будет стимулировать иммунную реакцию. Для усиления протелиотического расщепления антигена, в его последовательность встраивают сигнал убиквитинирования[34]. Использование кодирующих ДНК-вакцин вместо целого антигена, нескольких эпитопов различного происхождения, позволяет значительно расширить спектр иммунного ответа. Для противоопухолевых ДНК-вакцин эффективной является комбинация «опухолевый антиген + вирусный или бактериальный антиген». Например, сочетание опухолевого антигена с эпитопом токсина столбняка значительно повышает активацию Т-киллеров против раковых клеток. Включение адъювантов При применении традиционных вакцин для повышения иммунного ответа к ним добавляют адъюванты. ДНК-вакцина имеет бактериальное происхождение, поэтому она сама является иммуностимулятором. Для усиления иммунного ответа в ДНК-вакцину встраивают гены адъюванта или применяют дополнительную плазмиду, которая кодирует иммуностимулирующие белки[41]. Иммуностимулирующее действие бактериальных CpG динуклеотидов Функция плазмиды не ограничивается доставкой генов в клетки. Еще в 1893 году было обнаружено, что смесь бактериальных лизатов уменьшает прогрессирование раковых опухолей, однако лишь в 1983 установили, что иммуностимулирующие свойства лизата обусловлены молекулами ДНК бактерии[42]. В 1995 году показали, что стимуляция иммунитета вызвана CpG-мотивами бактериальной ДНК. У бактерий, а также ДНК-вирусов, эти мотивы являютсянеметилированными. В организме человека и высших приматов, наоборот, цитозин в составе большинства CpG-динуклеотидов содержит метильную группу. Поэтому неметилированные CpG-мотивы воспринимаются человеческим организмом как патагенассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП) (PAMP, pathogen-associated molecular patterns). ПАМП-соединения распознаются толл-подобными рецепторами, которых, в зависимости от типа лиганда, разделяют на несколько типов. Неметилированные CpG-мотивы распознаёт рецептор TLR-9, расположенный на мембранахэндоплазматического ретикулума В-лимфоцитов, дендритных клеток и натуральных киллеров. Связывание рецептора с неметилированными CpG-мотивами запускает каскад реакций, в результате которого индуцируется синтез провоспалительных цитокинов — интерферона-1 и IL-12. Экспрессия цитокинов и других иммуномодуляторов Для ДНК-вакцинации в качестве адъювантов чаще всего применяют гены цитокинов. Цитокины — это класс белковыхмолекул, регулирующих межклеточные и межсистемные взаимодействия в организме, в частности, функционированиеиммунной системы. Все цитокины, а их известно более 30, могут модулировать иммунный ответ. Цитокины IL2, IL-12, интерферон γ, IL-15, IL-18 и IL-23 имеют стимулирующее влияние на Т-хелперы первого класса. К цитокинам, которые модулируют действие Т-хелперов второго класса, относятся: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 И IL-13. Тип цитокина подбирают согласно тому, какой тип иммунного ответа хотят усилить. Различия иммунного ответа Т-хелперов 1 и 2 класса Отличия Т-хелперы 1 Т-хелперы 2 Главная клетка-партнер Макрофаг В-клетка Иммунный ответ Клеточный. Усиливает действие макрофагов Повышает пролиферацию Т-киллеров Гуморальный. Стимулирует пролиферацию В-клеток Повышает выработку нейтрализующих антител. Достичь повышения иммунного ответа можно с помощью хемокинов. Хемокины — это семейство цитокинов, которые способны вызвать хемотаксис чувствительных к ним клеток, в том числе и иммунных. В частности, рецепторы к хемокинам есть на антигенпредставляющих клетках хемокинов. Связывание хемокина со своим рецептором приводит к эндоцитозу комплекса антиген-хемокин внутрь АПК. Эта стратегия эффективно используется как при разработке противовирусных ДНК-вакцин, так и противоопухолевых[47]. Функцию адъюванта также может выполнять белок БТШ70 (белки теплового шока, англ. heat-shock proteins, HSP). Иммуностимулирующее действие БТШ70 основано на его способности выходить во внеклеточное пространство и связываться с рецепторами АПК. Механизм транспорта БТШ70 наружу пока окончательно не выяснен, но, скорее всего, существует несколько путей — экзоцитоз, секреция наружу или выход через канал. Связывание БТШ70 со своим рецептором приводит к активации дендритных клеток, опосредует представление антигена и стимулирует продукцию хемокинов. Поскольку антиген слит с БТШ70, он также попадает во внеклеточное пространство, поэтому может представляться по пути ГКГ-II и активировать В-клетки. Во избежание аутоиммунных реакций для ДНК-вакцин используют бактериальный ген БТШ70. Преимущества и недостатки ДНК-вакцин Метод ДНК-вакцинации обладает рядом преимуществ, наиболее важным из которых является запуск как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Вакцины на основе ДНК обеспечивают долговременную экспрессию антигена и, соответственно, устойчивый иммунный ответ. К дополнительным факторам, способствующим развитию ДНК-иммунизации, относят простоту и низкую стоимость производства вакцины. Преимущества Недостатки Антиген получает нативную конформацию Активация обеих ветвей иммунитета: гуморальной и клеточной Синтезированный антиген можно избирательно направлять на путьГКГ-I или ГКГ-II Могут избирательно действовать на разные популяции Т-хелперов Обеспечивают долговременную экспрессию антигена Просты и быстры в изготовлении Низкая цена производства Не требуют особых условий хранения Могут применяться как для профилактики, так и для лечения болезней Потенциально эффективны против широкого спектра болезней: бактериальных, вирусных, аутоиммунных и раковых заболеваний Слабая иммуногенность Для вирусных векторов существует опасность интеграции чужеродной ДНК в геном клетки Возможно развитие аутоиммунных реакций Плазмидные и вирусные векторы могут вызвать неспецифический иммунный ответ Применение ДНК-вакцин ДНК-вакцины в ветеринарии Все четыре одобренные Управлением США по контролю над продуктами питания и лекарственными препаратами вакцины созданы на основе плазмид. Для трёх из них рекомендован производителем способ введения — внутримышечно, для вакцины «ЛайфТайд» — внутримышечная инъекция, совмещённая с электропорацией. Если остальные вакцины направлены на активацию иммунитета, то для вакцины «ЛайфТайд» иммуностимулирующее действие является дополнительным. Продукт вакцины — соматолиберин, гормон, который стимулирует высвобождение гипофизом гормона роста и пролактина. Действие последних двух гормонов у свиней приводит к росту массы животных и увеличению численности выводка. Вместе с тем, введение животным плазмиды, которая кодирует соматолиберин, стимулирует выработку Т-лимфоцитов, натуральных киллеров следовательно, увеличивает иммунную сопротивляемость организма. Торговое название вакцины Год лицензирования Мишень Животное Продукт вакцины Цель создания вакцины «Вэст Найл-Инноватор» (США) 2005 Вирус лихорадки Западного Нила Кони Структурный белок вируса PreM-E Защита против вируса «Апекс-ай-эйч-эн» (Канада) 2005 Возбудитель инфекционного некроза гемопоэтической ткани (ИНГТ) Рыбы семействалососёвые Вирусный гликопротеин Повышение количества и качества продовольствия рыбы «ЛайфТайд Эс-Даблъю 5» (Австралия) 2008 Гормон роста Свиньи и другой домашний скот Соматолиберинсвиньи Увеличение выводка у свиноматок; значительно уменьшает перинатальную смертность и заболеваемость «ОНСЕПТ» (США) 2010 Меланома Собаки Тирозиназачеловека Как альтернатива лучевой терапии и операционному вмешательству при лечении меланомы Перспективы ДНК-вакцинации Распределение открытых клинических исследований ДНК-вакцин в зависимости от заболевания по состоянию на 2011 год. Общее количество испытаний — 43 Противоопухолевые ДНК-вакцины В то время как индукция клеточного и гуморального иммунного ответаубедительно продемонстрирована для чужеродных антигенов, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, применение ДНК-вакцин для лечения рака до сих пор было менее успешным. Индукция эффективного противоопухолевого иммунитета является сложной задачей. Клинические исследования подтвердили общую безопасность и низкую токсичность противоопухолевых ДНК-вакцин, однако эффективность вызванного ими иммунного ответа оказалась слабой, а противоопухолевая активность, в некоторых случаях, вообще сомнительной. ДНК-вакцины против вирусных и бактериальных возбудителей[ ДНК-вакцина против кариеса Причиной кариеса является локальная смена pH вследствие брожения(гликолиза) углеводов, осуществляемого бактериями[54]. Учеными изУханьского Института вирусологии (Китай) была разработана ДНК-вакцина, направленная против одного из возбудителей кариеса — Streptococcus mutans. Вакцина построена на основе плазмиды и кодирует два белка: поверхностный протеин St. mutans PAc и флагеллин, полученный из бактерии сальмонелла, который выполняет роль адъюванта[55]. На стадии доклинических исследований вакцину через нос вводили лабораторным грызунам, после чего у животных проверяли уровень иммуноглобулинов G в сыворотке крови и секреторных иммуноглобулинов А в слюне. После проведённых исследований учёные выяснили, что уровень иммунных белков и в крови и в слюне повышался, но, что важнее, при этом тормозился рост колоний Streptococcus mutans на зубной эмали. То есть, зубы вакцинированных животных были лучше защищены от кариеса. ДНК-вакцины и лечение аутоиммунных заболеваний ДНК-вакцина против диабета 1 типа Сахарный диабет 1-го типа характеризуется потерей инсулин-продуцирующих бета-клеток, расположенных на островках Лангерганса поджелудочной железы. Главная причина потери бета-клеток — аутоиммунное поражение Т-киллерами. Для того, чтобы защитить бета-клетки от гиперактивной функции иммунной системы, учёные из Стэнфордского (США)иЛейденского (Нидерланды) университетов, разработали ДНК-вакцину BHT-3021. Вакцина создана на основе плазмиды и кодирует предшественник инсулина — проинсулин. Это вакцина обратного действия: если обычные вакцины должны активировать иммунные реакции, то BHT-3021, наоборот, нейтрализует цитотоксическое действие Т-киллеров, направленную против островков Лангерганса. В первой фазе клинических испытаний BHT-3021 показала свою эффективность на группе из 80 человек. Половина из них каждые семь дней в течение 12 недель получала внутримышечные инъекции BHT-3021, а вторая половина — плацебо. После окончания этого срока группа, которая получала вакцину, продемонстрировала повышение уровня С-пептидов в крови, что свидетельствует о восстановлении функции бета-клеток. Никаких серьезных побочных эффектов у одного из участников зафиксировано не было. Действие вакцины сохранялось в течение 2 месяцев. studfiles.net ДНК-вакцины - Med24info.com Новой потенциально полезной стратегией иммунизации явилось внутримышечное или внутрикожное введение плазмидной ДНК, кодирующей вирусныепротективные антигены. Открытые возможности использования ДНК в качестве вакцины явились наиболее революционным достижением стремительно развивающейся технологии рекомбинантной ДНК. Создание ДНК-вакцин стало возможным благодаря разработке вирусных векторных систем. Повышению эффективности доставки ДНК в клетки и установлению длительной экспрессии чужеродной ДНК в трансфицированных клетках организма. Новое направление в иммунопрофилактике называют «генетической иммунизацией» или «иммунизацией нуклеиновыми кислотами» [1493, 1677]. Хотя способность ДНК и РНК вызывать синтез соответствующих белков после их проникновения в клетку известна давно, только недавно была осознана возможность данной технологии для создания специфического иммунитета. Новый принцип иммунизации состоит в том, что в организм вводят не вирусный антиген, а ДНК, кодирующую синтез этого антигена (белка). Оказалось, что вирусная ДНК сама по себе может быть использована как вакцина. Детальный анализ развития исследований в этом направлении показал, что такое не является сюрпризом. Было известно, что ДНК и РНК многих вирусов, инфицируя клетки, могут осуществлять полный цикл репликации. В 1990 г. Вульф и сотр. [1677] обнаружили, что плазмидная конструкция ДНК, включающая ген галактозидазы, введенная в скелетную мышцу мыши, длительно (до 60 дней) экспрессирует фермент. Вскоре после этого было показано, что после ДНК-вакцинации у животных образуются специфические антитела [1493], развивается клеточный иммунитет и защита от вирусной инфекции [1558]. Экспрессия чужеродных генов in vivo может обходиться без сложных систем, используя прямое введение плазмидной ДНК. ДНК-экспрессируюшие векторы для этих целей могут быть реализованы несколькими путями. Простейшим и неожиданно одним из наиболее эффективных методов является введение ДНК в солевом растворе («голая» ДНК). Введение плазмидной ДНК, содержащей репортерные гены, в солевом растворе вызывает экспрессию белков in vivo [1677]. ДНК-вакцины обычно содержит плазмиду E.coli с сильным промотором и репортерный ген. Плазмида амплифицируется обычно в E.coli, очищается, суспендируется в буферном растворе, а затем просто вводится в организм. Рекомбинантные плазмиды представляют собой конструкции, содержащие гены, способные экспрессировать нужные вирусные антигены. Клетки организма, по крайней мере вначале, в месте инъекции трансформируются плазмидой, ДНК транспортируется к ядру, где транслируется интересующий (репортерный) белок. Экспрессия репортерных генов обнаружена в мышцах, селезенке, печени, коже, легких и мозге. Однако наиболее выраженная экспрессия обнаружена в мышцах. Ее можно было обнаружить в течение минуты после инъекции. Она максимально проявлялась через 1—2 недели, а затем постепенно снижалась, но могла быть обнаружена, по крайней мере, через 19 месяцев. Механизм интернализации ДНК клетками еще не выяснен и неизвестно, почему мышечные клетки являются наиболее эффективной клеточной мишенью трансфекции при прямом введении ДНК. Простое объяснение, состоящее в том, что ДНК просачивается в клетки в результате повреждения при введении, не подтверждено экспериментально. Скорее можно предположить, что в этом могут участвовать физиологические процессы включения ДНК. Так как внутримышечная иммунизация оказалась наиболее эффективной, вначале думали, что трансфицированные ми- оциты ответственны за поддержание продукции антигена и функционируют как антиген-презентирующие клетки. Сейчас считают, что для этого требуются «профессиональные» антиген-презентирующие клетки, происходящие из костного мозга, эти клетки инфильтрируют место присутствия антигена и играют роль местного лимфоузла. Также может иметь место прямая трансфекция анти- ген-презентирующнх клеток, особенно клеток лангерганса при внутрикожном введении [1130]. Иммунизация ДНК имеет некоторые преимущества перед иммунизацией очищенными вирусными антигенами. Наиболее важным преимуществом является то, что вирусные антигены, такие как вирусные гликопротеины, могут экспрессироваться на поверхности трансфецированных клеток и представляться иммунной системе в нативном виде. В процессе очистки вирусных белков, сборки и очистки ВПЧ или химической инактивации вирусов структура эпитопов на протективных белках может быть нарушена и вызовет ослабление иммуногенности. ДНК-иммунизация устраняет эти проблемы и больше напоминает иммунизацию живыми вирусными вакцинами, чем неживыми вирусными антигенами. Вирусные антигены, кодируемые ДНК, эффективно презентируются и вместе с антигенами МНС I вызывают индукцию Тх- и Тц-лимфоцитов. Таким путем они способны вызывать сбалансированный иммунный ответ, более сходный с по- стинфекционным иммунитетом, чем с иммунитетом на преформированные вирусные антигены. Другим преимуществом иммунизации ДНК является способность трансфицировать клетки без интерференции с вирусными антителами. Наконец, чужеродные антигены могут экспрессироваться in vivo в течение нескольких месяцев после ДНК-иммунизации. Однако иммунный ответ при этом может развиваться медленно. Этот метод иммунизации еще не оптимизирован, хотя предложены различные усовершенствования [1493, 1677]. Значительное усиление ответа на вакцинацию достигнуто включением плаз- мидной ДНК в микрочастицы диаметром 1—3 мкм, покрытые золотом и вводимые путем «бомбардировки» с помощью гелевого газового «пистолета» (генный пистолет). Введение таким образом 1 мкг ДНК является достаточным. В опытах с другими рекомбинантными вакцинами включали гены, кодирующие иммуностимулирующие белки, такие как интерлейкин-2, интерлейкин 12 и интерферон гамма [1245]. Преимущества ДНК-вакцин заключаются в чистоте, физико-химической стабильности, относительно низкой стоимости производства, простоте доставки, включении в одну плазмиду генов, кодирующих множество антигенов, и экспрессии антигенов в их нативной форме (что облегчает процессинг и презентацию иммунной системе). Повторное введение не сопровождается интерференцией, но сопровождается гуморальным и клеточным (Тц и Тх) ответом. Одна из особенностей ДНК-иммунизации состоит в том, что она эффективна в присутствии материнских антител. Главным недостатком ДНК-вакцин является возможная опасность, связанная с введением чужеродной генетически измененной ДНК, интеграпия которой в хромосомную ДНК может привести к связанному с инсерцией мутагенезу или онкогенезу, индукцией аутоиммунного состояния или толератности. Плазмиды используют из-за отсутствия репликации и, более того, отсутствия саморепликации ДНК при использовании ее в качестве вакцины. Плазмиды, содержащие вирусную ДНК, конструируются без последовательностей, которые способны интегрировать ее в хромосомальную ДНК. В последнее время введением ДНК-вакцин различным видам животных экспрессирован широкий спектр антигенов, в результате чего установлено развитие длительного гуморального и клеточного иммунитета. На различных животных моделях с использованием метода контрольного заражения показано, что ДНК- вакцины, кодирующие вирусные антигены, эффективно защищают от соответствующих инфекций [670]. Таблица 27. Показательные результаты испытания ДНК вакцин [670] (В скобках указан вид животных, на которых использовали вакцины) Вирус Белки Индукция антител Индукция Тц лимфоцитов Защита от экспериментального заражения Вирус Ринотрахеита КРС gD + + + (КРС) Вирус гепатита В Структурные антигены + (обезьяны) + (обезьяны) + (обезьяны) Вирус гепатита С Нуклеокапсид + + + (мыши) Вирус простого герпеса тип 1 gD, gB + + + (мыши) ВИЧ тип 1 Env, Gag, Rev + + + (обезьяны) Вирус гриппа HA, Ml,Np + + + (цыплята, мыши) Вирус лимфоцитарного хориоменингита NP + + + (мыши) Вирус бешенства NP, гликопротеин + + + (обезьяны) Респираторно- сипцитиальный вирус гликопротеин + + + (мыши) www.med24info.com создание и перспективы. Московский физико-технический институт.

Оригинал статьи опубликован на сайте Solvay-pharma.ru , с использованием xTerra.Ru Традиционные вакцины, избавившие человека от десятков инфекционных заболеваний, во многих случаях остаются неэффективными либо слишком небезопасными. Возможность преодолеть присущие им ограничения появилась с развитием генной инженерии. В качестве альтернативы обычным методам иммунизации разрабатываются ДНК-вакцины. Массовая вакцинация привела к исчезновению оспы, почти уничтожила полиомиелит и невероятным образом снизила число случаев заболевания тифом, корью, гепатитом A и B, столбняком, дифтерией... Тем не менее возможности традиционных вакцин далеко не безграничны. Не возымели успеха попытки иммунизации против таких давно и хорошо известных болезней, как туберкулез и малярия. Двадцать лет назад список пополнился СПИДом. Кроме того, все более опасными становятся инфекции, с которыми, казалось бы, уже научились бороться, создав эффективные методы предупреждения и лечения. Появление устойчивых штаммов возбудителей, активно мутирующих и адаптирующихся к действию даже самых новых лекарственных препаратов, вынуждает постоянно обновлять медицинскую практику. Применение ДНК-вакцин, уже очевидно, займет в ней не последнее место. В последние 10 лет ДНК-вакцины из сомнительной идеи превратились в чрезвычайно перспективное направление биомедицинских исследований. Впервые предположение, что гены могут быть использованы для вакцинации, появилось почти полвека назад, после серии исследований, проведенных в 50-60-е гг. Эксперименты, к слову, вовсе не имевшие отношения к созданию вакцин, продемонстрировали один интересный эффект, который сегодня, впрочем, кажется очевидным. Ученые обнаружили, что фрагменты «чужой» ДНК, имплантированные в клетки животных, способны в некотором количестве синтезировать собственные белки. Сами клетки, получившие гены другого организма, в ответ начинают вырабатывать антитела. Позднее результаты этих экспериментов подтвердились в ходе других исследований, проводившихся с целью создания новых методов лечения различных заболеваний, прежде всего наследственного характера. Имеется в виду генная терапия, первые попытки применения которой были не слишком удачными. Опыты на животных показали, что «терапевтические» гены, имплантируемые с благим намерением исправить то или иное нарушение, провоцируют иммунную реакцию и потому долго не живут. Такое наблюдение, с одной стороны, несколько разочаровало ученых, однако вскоре пришлось убедиться, что нет худа без добра. Иммунный ответ на появление чужеродных генов стали всерьез, хотя поначалу и не без некоторых сомнений, рассматривать как принцип действия вакцин нового типа. С начала 90-х гг. научные лаборатории начали все активнее работать в этом направлении. Вводя вакцины лабораторным грызунам и приматам, ученые зафиксировали возникновение иммунной реакции, противодействующей многим различным патогенам. Более того, было доказано, что вакцины имеют некоторый эффект при терапии определенных видов рака. Хотя злокачественные опухоли вовсе не являются инфекционными заболеваниями, исследования показали, что с их развитием можно бороться за счет повышения активности иммунной системы. Позднее состоялись первые клинические испытания на человеке, которые прежде всего должны были продемонстрировать безопасность нового метода. Эксперименты состояли в том, что гены ВИЧ вносили в клетки пациентов, уже зараженных вирусом. Еще позднее аналогичные операции проделали со здоровыми людьми. Помимо генов вируса иммунодефицита им пересаживали гены гриппа, а в ходе дальнейших исследований – герпеса и гепатита B. Результаты всех тестов оказались вполне обнадеживающими: вакцины стабильно провоцировали иммунный ответ. Что касается соображений в духе «не навреди», то серьезных побочных эффектов, способных привести к неприятным последствиям, отмечено не было. Эксперименты по созданию ДНК-вакцин преимущественно ведутся с бактериальными плазмидами – небольшими стабильными кольцевыми ДНК, которые содержатся вне хромосом. Плазмиды хороши в том плане, что сами по себе не провоцируют инфекцию. Фактически их используют только в качестве вектора – средства доставки. Чтобы вызвать необходимую иммунную реакцию, выделенные из бактерий плазмиды модифицируют, внося определенные изменения в структуру ДНК. А именно вшивают гены, которые кодируют один или несколько определенных белков-антигенов, вырабатываемых конкретной бактерией или вирусом. Также встраиваются гены, необходимые для обеспечения экспрессии (активности) всей конструкции. В то же время фрагменты ДНК, ответственные за воспроизводство и размножение инфекции, в плазмиды не переносятся. Вводится вакцина обычно либо путем инъекции, либо с помощью так называемой «генной пушки». Этот аппарат, выпуская струю сжатого гелия, пробивает клеточные мембраны микроскопическими металлическими частицами, покрытыми ДНК. Попав тем или иным способом внутрь клеток, плазмиды провоцируют синтез белков-антигенов. Их появление вакцинируемый организм воспринимает как полноценное инфицирование и реагирует обычным образом, в итоге вырабатывая иммунитет против соответствующей бактерии или вируса. Уже первые успешные испытания, в ходе которых была продемонстрирована перспективность самой идеи создания ДНК-вакцин, привлекли немалое внимание как государственных структур, действующих в сфере здравоохранения, так и крупнейших частных компаний. Многие из них подключились на самых ранних этапах исследований, либо разработав собственные научные программы, либо заключив соглашения с академическими центрами и лабораториями. Сегодня Aventis, Merck, Pfizer и другие фармацевтические и биотехнологические гиганты рассматривают создание новых методов иммунизации как одно из приоритетных направлений работы. ДНК-вакцины в разных отношениях выглядят намного предпочтительнее традиционных средств. Стойкость иммунитета, который вырабатывается в ответ на введение ДНК-вакцин, определяется принципиально важным обстоятельством. Поскольку антигены синтезируются внутри самого организма, а не поступают с него извне, вызывается комплексная реакция. Активизируются все типы белых кровяных телец: B-лимфоциты вырабатывают антитела, нейтрализующие антигены в жидких межклеточных тканях (гуморальный иммунный ответ), а цитотоксические Т-лимфоциты разрушают болезнетворные агенты внутри клеток (клеточный иммунный ответ). Аналогичным образом действуют вакцины, содержащие живые аттенуированные (ослабленные) вирусы или бактерии. Однако их применение может быть связано с некоторыми рисками. Хотя вводится лишь ослабленный патоген, вероятность инфицирования и развития болезни при определенных условиях не исключена. Даже ослабленные вирусы или бактерии не являются стопроцентно безопасными, что подтверждают медицинские отчеты, описывающие отдельные случаи заболевания при вакцинации. Особенно рискуют люди с иммунной недостаточностью, такие как больные СПИДом и раковые пациенты, проходящие курсы химиотерапии. Кроме того, ослабленные живые бактерии и вирусы в некоторых случаях могут мутировать, восстанавливая весь свой патогенный потенциал. Более безопасны вакцины, которые содержат убитый патоген либо отдельный очищенный его компонент – белок или полисахарид. Однако такие препараты менее эффективны: они в основном вызывают только гуморальный иммунный ответ и, кроме того, нередко требуют проведения повторных вакцинаций. К недостаткам обычных вакцин относится и то, что они достаточно дороги в производстве (применяются разнообразные технологии изготовления, зависящие от особенностей конкретных микробов), а также нуждаются в особых условиях хранения и транспортировки – прежде всего, постоянной низкой температуре. Два этих обстоятельства существенно осложняют возможность массового применения самых необходимых лекарств во многих не особенно благополучных странах. ДНК-вакцины заметно превосходят по своим характеристикам обычные препараты. В целом результаты многочисленных лабораторных исследований и клинических испытаний указывают на то, что ДНК-вакцины обладают всеми положительными свойствами традиционных вакцин, при этом не имея их недостатков. Введение фрагментов ДНК бактерий или вирусов вызывает полноценную иммунную реакцию, но совершенно исключает возможность заражения, поскольку в клетки не попадают гены, необходимые для развития инфекции. ДНК-вакцины сравнительно просто синтезировать в значительных количествах, используя уже ставшую обычной рекомбинантную технологию. Причем весь производственный процесс предельно унифицирован – меняются только гены, которые включаются в плазмиду. Кроме того, поскольку вакцины способны содержать фрагменты ДНК сразу нескольких различных штаммов возбудителей, их можно использовать для противодействия целому ряду инфекций одновременно. Что было бы чрезвычайно полезно, особенно в случае, если дело касается таких изменчивых и многоликих микроорганизмов, как вирус гриппа. Наконец, ДНК-вакцины чрезвычайно устойчивы и могут, в растворе или в сухом виде, храниться при обычных условиях, выдерживая высокие и низкие температуры и разный уровень влажности. Разумеется, столь многообещающий метод иммунизации не лишен недостатков, самый очевидный из которых вытекает из самой природы ДНК-вакцин. Поскольку вводятся гены, кодирующие белковые молекулы, вырабатывается иммунный ответ только на появление белковых компонентов вирусов и бактерий. Иначе говоря, традиционным вакцинам, в которых используются полисахариды, пока нет альтернативы. Другие потенциально слабые места ДНК-вакцин активно проверяются. Существовало опасение, что чужеродная ДНК может каким-то образом повредить ДНК человека. Другая неприятность, которую подозревали при первых испытаниях, - возникновение аутоиммунного ответа, т. е. реакции, направленной против собственных клеток. Также не исключалась вероятность развития толерантности к препарату и, как следствие, быстрого снижения эффекта от вакцинации. Хотя все эти проблемы не проявились при проведении тестов, ученые продолжают оценивать риски, связанные с применением нового метода иммунизации. Используя одно из принципиальных генетических отличий человека от бактерии, ученые надеются победить все инфекции. Результаты некоторых исследований позволяют предположить, что функции плазмид-векторов на самом деле не ограничиваются доставкой «инфекционных» генов. Иммунная реакция, вызываемая этими генами (точнее, соответствующими им белками) самими плазмидами дополнительно усиливается. Такой эффект, вероятно, связан с тем принципиальным обстоятельством, что в ДНК микроорганизмов, в том числе в кольцевых плазмидах, часто встречается определенный фрагмент, а именно связка цитозина (C) и гуанина (G). Эти два нуклеотидных основания намного реже соседствуют в ДНК позвоночных. Кроме того, если у позвоночных цитозин и гуанин расположены последовательно в одной цепочке двойной спирали, к ним обычно прикрепляется метиловая химическая группа. Бактерии обходятся без этого дополнения. Ученые предполагают, что клетки позвоночных воспринимают часто повторяющиеся неметилированные CG-фрагменты как сигнал опасности. В ответ активизируется так называемая «первичная» часть иммунной системы, работа которой не связана с распознаванием специфичных белков-антигенов. Эта гипотеза лежит в основе особого направления исследований в рамках работы над ДНК-вакцинами. Несколько научных групп сегодня пытаются создать препарат, способный на короткое время активизировать иммунную систему таким образом, чтобы она немедленно и мощно реагировала на вторжение любой инфекции. Такой препарат, к примеру, обезопасил бы людей, которым предстоит дальняя поездка, особенно по неблагополучным в санитарном отношении районам. Вакцину могли бы принимать пациенты, ожидающие хирургическую операцию и желающие максимально исключить вероятность заражения и развития инфекции, очевидную при пониженной активности иммунной системы. Кроме того, возникает возможность обезопасить людей, вынужденных находиться на зараженных территориях. Последний пункт становится особенно актуальным в связи с известными событиями, напугавшими растущей угрозой применения биологического оружия. Принцип, который разрабатывается при создании универсальной вакцины, подразумевает использование не генов, кодирующих белки-антигены микробов, а бактериальных последовательностей CG в качестве активного компонента вакцины. Идея в том, что когда иммунная система человека обнаруживает часто встречающиеся CG-фрагменты ДНК, лишенные метиловой группы, немедленно вызывается общий иммунный ответ, который защищает от инфекции. Нужно подчеркнуть, что поскольку эта реакция является неспециализированной, она направлена против многих видов бактерий одновременно, в том числе штаммов, которые не поддаются воздействию обычных вакцин. Такое действие, как подтверждают начальные исследования, существует не только чисто теоретически. Предварительные испытания дают вдохновляющие результаты как в плане проверки препаратов на наличие неблагоприятных побочных эффектов, так и в отношении развития стойкого иммунитета. Эксперименты на мышах показали, что ДНК-вакцина такого типа предотвращает развитие сибирской язвы. Также продемонстрирована эффективность препарата при борьбе с лихорадкой Эбола и другими инфекциями, в том числе теми, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия. Кроме того, вакцина способна защитить и от паразитов. В частности, тесты показали ее противомалярийное действие. Как отмечают ученые, синтетические препараты, содержащие CG бактерий в качестве активного компонента, прежде всего ограничивают рост и размножение патогенов на ранних стадиях развития инфекции. О воздействии вакцины на человека и тем более о перспективах ее терапевтического применения ученые пока говорят осторожно. Первые лабораторные эксперименты с человеческими клетками оказались вполне успешными, однако полный цикл клинических испытаний еще предстоит провести. С другой стороны, особенных неприятных неожиданностей, как кажется, ожидать вряд ли следует. Многочисленные бактериальные последовательности цитозина и гуанина содержатся в любой ДНК-вакцине, в том числе в тех, которые уже были протестированы на людях. Проводились и более предметные исследования, в ходе которых оценивалось действие именно CG-фрагментов. В частности, испытания проводили специалисты компании Coley Pharmaceuticals. Правда, они использовали соединение гуанина и цитозина в соответствии с первоначальной идеей, т. е. только в качестве средства, усиливающего действие других вакцин. Пока неясно, планируют ли Coley и другие фармацевтические компании расширить исследования и взяться за разработку полнофункционального самостоятельного препарата. Вполне возможно, что планируют или даже уже делают. В том числе, не исключено, с прицелом на применение вакцины против искусственно созданных штаммов. Во всяком случая, в одном из заявлений Артур Криг (Arthur Krieg), глава научного отдела Coley, высказался в том плане, что использование CG бактерий может быть чрезвычайно эффективным способом активизации естественной иммунной системы с целью обеспечения защиты от биологического оружия различного типа. Ссылки по теме:

Так как процесс доставки нуклеиновой кислоты внутрь клеток-мишеней неэффективен, подходы к улучшению доставки и/или повышению стабильности ДНК in vivo могут приводить к более выраженной и продолжительной экспрессии закодированного антигена, что способствует повышению силы иммунного ответа. Одним из вариантов является внедрение нуклеиновой кислоты в липосомы, что может защитить ее от действия эндогенных нуклеаз, а также способствовать проникновению внутрь клеток (43). Адсорбция ДНК на катионные микрочастицы из поли(DL-лактид-ко-гликолида), ПЛГ – poly(DLlactide-co-glycolide), PLG – обеспечивает медленное высвобождение ДНК и приводит к формированию более мощного иммунного ответа, чем использование депротеинизированной ДНК (44). Обеспечивающая физическое облегчение транспорта нуклеиновых кислот внутрь клеток-мишеней электропорация в кожу(45) или мышечную ткань (46) оказалась перспективным подходом повышения эффективности переноса генов. Еще одним применимым к вакцинам методом повышения эффективности трансфекции является гидродинамическая доставка плазмидной ДНК (47). Применение этих подходов в клинических условиях требует тщательной оптимизации с учетом особенностей человеческого организма.

Легкость манипулирования рекомбинантной ДНК позволяет изменять закодированный в ней антиген для повышения его иммуногенности, при этом существует огромное количество различных типов манипуляций. Так как усвоение и адекватная презентация антигена являются обязательными условиями индукции эффективного иммунного ответа, некоторые группы исследователей модифицировали закодированные антигены таким образом, чтобы повысить эффективность их поглощения специализированными АПК (48). Комплексы антигенов с CD40-лигандом (49), внеклеточным доменом лиганда Fms-подобной тирозинкиназы-3 (flt-3) (50) или антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) (51) являются примерами, в которых рецепторы к каждому из лигандов присутствуют на поверхности ДК и обеспечивают поглощение антигена клетками и формирование усиленного иммунного ответа. Внутри клетки закодированный антиген может модифицироваться для облегчения деградации с помощью эндосомально-лизосомального механизма (52,53), что усиливает презентацию антигена в комплексе с молекулами MHC II класса и стимулирует CD4+ Т-клеточные реакции. Сходный метод, влияющий на другой механизм, – протеолитическую обработку закодированного антигена – обеспечивается его слиянием с последовательностями, приводящими к его убиквитинизации (54). Встраивание гетерологичных иммуногенных последовательностей, таких как ЦТЛ-эпитоп столбнячного токсина, в последовательность опухолевого антигена приводило к быстрой стимуляции ЦТЛ против опухолевого антигена с одновременной защитой от опухолевой стимуляции (55). Для опухолей, ассоциированных с вирусом папилломы человека, таких как рак шейки матки, кодонная оптимизация гена вирусного антигена показала себя как эффективное средство повышения экспрессии белка в клетках млекопитающих и усиления иммунного ответа (56).

Другим подходом к повышению иммуногенности ДНК-вакцин является одновременное введение ДНК, кодирующей цитокины, обосновываемое тем, что более мощный иммунный ответ возможен в случае презентации антигена в благоприятном цитокинном микроокружении. Поэтому цитокины, стимулирующие опосредуемый Тх1 иммунный ответ, в том числе гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), интерферон-гамма (ИФН-гамма), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-12 (ИЛ-12) и интерлекин-18 (ИЛ-18), активно изучались на доклинических моделях инфекционных заболеваний (57) и рака (58-60). Результаты исследований продемонстрировали способность этого подхода положительно воздействовать на природу и выраженность иммунного ответа. На основе утверждения, что более эффективное введение антигена внутрь АПК усилит иммунологическую реактивность, для привлечения АПК в зону синтеза антигенов использовали хемокины. Это достигалось либо путем слияния генов антигена и воспалительных хемокинов (61), либо путем одновременного введения генов антигена и хемокинов (62). К дополнительным стратегиям относятся одновременное введение антиапоптотических генов, способствующих выживанию ДНК-трансформированных ДК (63), и совместное введение кодирующей антиген ДНК и растворимого белка, кодируемого геном активатором лимфоцитов-3 (lymphocyte activating gene-3, LAG3), с целью усиления перекрестной презентации антигена (64). Увеличение количества ДК in vivo с целью повышения иммунологической реактивности стимулируют введением плазмиды, кодирующей flt-3-лиганд (65). Использование этого подхода в комбинации с традиционными пептидными вакцинами усиливает клеточный иммунный ответ (66).

Концепция перекрестно-видовой гомологичной иммунизации, также называемая ксеногенной или ортологичной иммунизацией, продемонстрировала свою эффективность при устранении толерантности к слабоиммуногенным опухолеспецифическим антигенам. Эта стратегия подразумевает выделение генов опухолевых антигенов из организмов другого вида с целью индукции перекрестно-видового иммунного ответа на аутологичный белок реципиента вакцины. Для многочисленных изученных на сегодняшний день белков ортологичный белок других видов обладает более выраженной иммуногенностью, чем аутологичный или собственный антиген. Этот подход ведет к развитию иммунитета, перекрестно реагирующего с собственным антигеном и устраняющим толерантность к нему. Ортологичную иммунизацию успешно использовали на животных моделях для индукции противоопухолевых иммунных реакций как против эндогенных опухолевых антигенов (67-70), так и против коканцерогенных факторов (71). Предварительные клинические исследования белково-дендритноклеточной вакцины против рака предстательной железы продемонстрировали стимуляцию иммунного ответа на собственный антиген, что свидетельствует о возможности переноса этого подхода в клиническую практику (72). Простота приготовления и отсутствие ассоциированного с ДНК-вакцинами иммунного ответа, направленного против вирусных векторов, привела к созданию на основе этого подхода ряда стратегий ксеногенного запуска и стимуляции иммунного ответа, которые в ряде доклинических моделей продемонстрировали более высокую эффективность по сравнению с ДНК-иммунизацией в чистом виде. К ним относятся использование ДНК-вакцин в комбинации с другими генетическими векторами (73,74) или с белками, например, абсорбированными на микрочастицы из ПЛГ (75). Несмотря на то, что подобные подходы несколько сложнее внедрять в клиническую медицину, повышение эффективности комбинированных вакцин может послужить решающим фактором.

7. Клинический опыт использования ДНК-вакцин

В то время как индукция как Т-, так и В-клеточного иммунного ответа на чужеродные антигены убедительно продемонстрирована на человеке по отношению к чужеродным антигенам, ассоциированным с инфекционными заболеваниями (76-79), применение ДНК-вакцин для лечения рака до сих пор было гораздо менее успешным. Индукция эффективного противоопухолевого иммунного ответа является сложной задачей, и на настоящий момент попытки клинического использования ДНК-вакцин приводили к противоречивым результатам. Клинические исследования подтвердили общую безопасность и низкую токсичность векторов, однако эффективность вызываемого ими иммунного ответа оказалась слабой, а противоопухолевая активность – сомнительной.

На сегодняшний день завершено уже несколько клинических исследований. Кодирующую клонированный опухолевый антиген (карциноэмбриональный антиген) ДНК вводили внутримышечно пациентам с поздними стадиями рака толстого кишечника (80). Пациентов иммунизировали плазмидами, одновременно экспрессирующими карциноэмбриональный антиген и, в качестве контроля, поверхностный антиген вируса гепатита В. В результате у некоторых пациентов регистрировались защитные уровни антител к вирусу гепатита, однако практически не развивался иммунитет против карциноэмбрионального антигена. Rosenberg и др. опубликовали сходные данные, полученные при введении ДНК, кодирующей антиген меланомы gp100, в рамках фазы I клинических исследований с участием пациентов с метастазирующей меланомой (81). При проведении этих исследований только у одного из 22 пациентов, перенесших внутримышечную или внутрикожную иммунизацию, наблюдалось развитие слабого неполноценного специфичного иммунного ответа против антигена gp100. Авторы пришли к выводу, что иммунизация не вызывала развития значимого клинического или иммунологического ответа. Этот факт противоречит результатам более ранних клинических исследований, при проведении которых антиген gp100 вводили в виде трансгена в составе вакцины на основе вируса оспы домашней птицы или в форме пептидов, и указывает на необходимость разработки стратегий усиления иммунного ответа на ДНК-вакцины на основе плазмид. Альтернативный метод введения – внутрь лимфоузлов – оценили на 26 пациентах с прогрессирующей меланомой (82). Введение плазмидной ДНК, кодирующей эпитопы тирозиназы, привело к развитию антигенспецифичного иммунного ответа у 11 пациентов. При этом у пациентов не наблюдалось никаких клинических изменений, кроме неожиданно высокой средней продолжительности жизни. Плазмидную ДНК, кодирующую простатоспецифический антиген (ПСА), вводили пациентам с гормонорезистентным раком предстательной железы в комбинации с цитокинами ГМ-КСФ и ИЛ-2 (83). При этом у двух из трех пациентов когорты, получившей наиболее высокую дозу, регистрировался клеточный и гуморальный иммунный ответ на ПСА и снижение уровня этого антигена.

Levy и др. оценили иммуногенность плазмидной ДНК-вакцины в исследованиях на пациентах с В-клеточной лимфомой (84). Более ранние клинические исследования с использованием для активной иммунизации белков, представляющих собой опухолеспецифические идиотипы иммуноглобулинов, продемонстрировали положительные клинические эффекты для пациентов (85, 86), однако приготовление индивидуальной вакцины для каждого пациента очень трудоемко и неприемлемо для широкого применения. ДНК-вакцинация обладает преимуществом сравнительно быстрого и малозатратного изготовления. Пациентов иммунизировали ДНК-вакциной, кодирующей химерную молекулу, состоящую из специфичного для пациента идиотипа, соединенного с а- и k-цепями константной области мышиного иммуноглобулина G2 (IgG2). Когорты пациентов иммунизировали внутримышечно и внутрикожно с помощью безыгольных устройств типа Biojector с добавлением или без добавления плазмидной ДНК, кодирующей ГМ-КСФ. У большинства пациентов всех когорт наблюдалось развитие иммунного ответа на белок-носитель мышиного иммуноглобулина, что послужило доказательством синтеза закодированного белка и его способности вызывать иммунный ответ. Индукция иммунного ответа на опухолеспецифический идентификационный фрагмент закодированного гена также регистрировалась, хотя и у меньшего количества пациентов. Клиническую эффективность вакцины было трудно оценить из-за предварительной и проводимой во время исследований химиотерапии и отсутствия невакцинированной группы контроля. Тем не менее, отсутствие токсичности и развитие регистрируемого иммунного ответа свидетельствуют в пользу целесообразности дальнейшего усовершенствования этого подхода к вакцинации.

Следует отметить, что упомянутые клинические исследования проводили в условиях поздних стадий заболеваний, на которых индукция иммунного ответа не является оптимальным подходом к лечению. Тем не менее, в целом полученный опыт использования депротеинизированной ДНК для иммунотерапии указывает на то, что введения плазмидных ДНК-вакцин недостаточно для формирования клинически эффективного иммунного ответа на немутировавшие собственные антигены. Перенос наиболее перспективных из перечисленных в табл. 1 стратегий в клиническую практику может помочь в преодолении ограничений, присущих существующим методам.

Опубликованы результаты двух фаз I клинических исследований вакцины против злокачественных заболеваний, ассоциированных с папилломавирусом человека. Иммунотерапию таких опухолей облегчает тот факт, что их клетки экспрессируют чужеродные вирусные антигены. Плазмидную ДНК, кодирующую пептидные эпитопы (фрагменты белка, распознаваемые антителами) белка Е7 человеческого папилломавируса 16 типа, презентируемые АПК в комплексе с антигенами MHC класса I, инкапсулировали в микрочастицы из биоразрушаемого полимера ПЛГ и вводили внутримышечно (87). Анализ с помощью тест-систем ELISPOT показал усиленные Т-клеточные реакции у 10 из 12 пациенток с дисплазиями. В то же время, у некоторых пациентов из когорт, получивших наибольшие дозы вакцины, наблюдалось развитие неполноценных тканевых реакций. Внутримышечное и подкожное ведение того же препарата женщинам с интраэпителиальной цервикальной неоплазией приводило к формированию у большинства пациенток (73%) регистрируемого иммунного ответа на белок Е7 человеческого папилломавируса 16 типа и у 33% пациенток – полноценного тканевого ответа (88). При этом не наблюдалось никаких связанных с вакцинацией серьезных побочных эффектов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ДНК-вакцины против антигенов папилломавируса могут играть важную роль в борьбе с ассоциированными с ним злокачественными заболеваниями.

8. Перспективы

За последние несколько лет скорость идентификации опухолевых антигенов значительно увеличилась (89) и будет продолжать расти, поскольку внедрение новых методик, таких как профилирование экспрессии (90, 91), технология SEREX (serological identification of antigens by recombinant expression cloning) (92) и протеомный анализ (93), обеспечивает идентификацию новых потенциальных мишеней для активной иммунотерапии. Использование ДНК-вакцин в доклинических моделях является сравнительно быстрым методом оценки потенциальной пригодности таких антигенов-кандидатов для стимуляции отторжения опухолей. Кроме традиционных опухолеспецифических антигенов, в качестве мишеней для ДНК-вакцин могут выступать антигены сосудистой сети опухолей (94, 95). Работа над созданием ДНК-вакцин в области борьбы с инфекционными заболеваниями не потеряет свою ценность с точки зрения разработки новых стратегий, пригодных для использования при создании противоопухолевых вакцин. Результаты недавно проведенного клинического исследования инфекционного заболевания (малярии) свидетельствуют о том, что различные стратегии иммунизации, направленной на запуск и усиление иммунного ответа, с использованием ДНК в комбинации с другими типами вакцинации может потенцировать иммунный ответ у человека (96). Несмотря на то, что окончательные клинические доказательства эффективности ДНК-вакцин в терапии рака еще предстоит получить, есть поводы сохранять оптимизм по поводу их потенциала в борьбе с широким спектром злокачественных новообразований. Как сравнительно нетоксичная терапия, ДНК-иммунизация может найти свое клиническое применение в качестве дополнительной меры при лечении минимальной резидуальной болезни для предотвращения рецидивов заболевания. Со временем ДНК-вакцины могут стать средством профилактики рака. Значительные преимущества ДНК-иммунизации и ее доказанная в клинических исследованиях безопасность являются вескими доводами в пользу продолжения разработки таких вакцин и их внедрения в практику борьбы со злокачественными заболеваниями.

9. Благодарность

Исследование проведено за средства грантов NCI 1 P50 CA89019 и NCI 1 P50 CA83591, выделенных Национальными институтами здравоохранения США.

10. Литература

1. Rosenberg S. A., Y. Zhai, J. C. Yang, D. J. Schwartzentruber, P. Hwu, F. M. Marincola, S. L.Topalian, N. P. Restifo, C. A. Seipp, J. H. Einhorn, B.Roberts & D. E. White: Immunizing patients with metastatic melanoma using recombinant adenoviruses encoding MART-1 or gp100 melanoma antigens. J Natl Cancer Inst 90, 1894-1900 (1998) 2. Conry R. M., M. B. Khazaeli, M. N. Saleh, K. O. Allen, D. L. Barlow, S. E. Moore, D. Craig, R. B. Arani, J. Schlom & A. F. LoBuglio: Phase I trial of a recombinant vaccinia virus encoding carcinoembryonic antigen in metastatic adenocarcinoma: comparison of intradermal versus subcutaneous administration. Clin Cancer Res 5, 2330-2337 (1999) 3. Dunn G. P., A. T. Bruce, H. Ikeda, L. J. Old & R. D. Schreiber: Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3, 991- 998 (2002) 4. Wolff J. A, R. W. Malone, P. Williams, W. Chong, G. Acsadi, A. Jani & P. L. Felgner: Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247, 1465-1468 (1990) 5. Hansen E., K. Fernandes, G. Goldspink, P. Butterworth, P. K. Umeda & K. C. Chang: Strong expression of foreign genes following direct injection into fish muscle. FEBS Lett 290, 73-76 (1991)6. Jiao S., P. Williams, R. K. Berg, B. A. Hodgeman, L. Liu, G. Repetto & J. A. Wolff: Direct gene transfer into nonhuman primate myofibers in vivo. Hum Gene Ther 3, 21-33 (1992) 7. Danko I. & J. A. Wolff: Direct gene transfer into muscle. Vaccine 12, 1499-1502 (1994) 8. Wolff J. A., M. E. Dowty, S. Jiao, G. Repetto, R. K. Berg, J. J. Ludtke, P. Williams & D. B. Slautterback: Expression of naked plasmids by cultured myotubes and entry of plasmids into T tubules and caveolae of mammalian skeletal muscle. J Cell Sci 103, 1249-1259 (1992)9. Wolff J. A., J. J. Ludtke, G. Acsadi, P. Williams & A. Jani: Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle. Hum Mol Genet 1, 363- 369 (1992) 10. Ulmer J. B., J. J. Donnelly, S. E. Parker, G. H. Rhodes, P. L. Felgner, V. J. Dwarki, S. H. Gromkowski, R. R. Deck, C. M. DeWitt, A. Friedman, L. A. Hawe, K. R. Leander, D. Martinez, H. C. Perry, J. W. Shiver, D. L. Montgomery & M. A. Liu: Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 259, 1745-1749 (1993) 11. Tang D. C., M. DeVit & S. A. Johnston: Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356, 152-154 (1992) 12. Williams R. S., S. A. Johnston, M. Riedy, M. J. DeVit, S. G. McElligott, & J. C. Sanford: Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc Natl Acad Sci USA 88, 2726-2730 (1991) 13. Barry M. A. & S. A. Johnston: Biological features of genetic immunization. Vaccine 15, 788-1791 (1997) 14. Fynan E. F., R. G. Webster, D. H. Fuller, J. R. Haynes, J. C. Santoro & H. L. Robinson: DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. Proc Natl Acad Sci USA 90, 11478-11482 (1993) 15. Ross H. M., L. W. Weber, S. Wang, G. Piskun, R. Dyall, P. Song, Y. Takechi, J. Nikolic-Zugic, A. N. Houghton & J. J. Lewis: Priming for T-cell-mediated rejection of established tumors by cutaneous DNA immunization. Clin Cancer Res 3, 2191-2196 (1997) 16. Cui Z., L. Baizer & R. J. Mumper: Intradermal immunization with novel plasmid DNA-coated nanoparticles via a needle-free injection device. J Biotechnol 102, 105-115 (2003) 17. Eriksson K. & J. Holmgren: Recent advances in mucosal vaccines and adjuvants. Curr Opin Immunol 14, 666-672 (2002) 18. Rocha-Zavaleta L., J. E. Alejandre & A. Garcia- Carranca: Parenteral and oral immunization with a plasmid DNA expressing the human papillomavirus 16-L1 gene induces systemic and mucosal antibodies and cytotoxic T lymphocyte responses. J Med Virol 66, 86-95 (2002) 19. White S. A., A. F. LoBuglio, R. B. Arani, J. F. Pike, S. E. Moore, D. L. Barlow & R. M. Conry: Induction of antitumor immunity by intrasplenic administration of a carcinoembryonic antigen DNA vaccine. J Gene Med 2, 135-140 (2000) 20. Pertmer T. M., T. R. Roberts & J. R. Haynes: Influenza virus nucleoprotein-specific immunoglobulin G subclass and cytokine responses elicited by DNA vaccination are dependent on the route of vector DNA delivery. J Virol 70, 6119-6125 (1996) 21. Feltquate D. M., S. Heaney, R. G. Webster & H. L. Robinson: Different T helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. J Immunol 158, 2278-2284 (1997) 22. Doe B., M. Selby, S. Barnett, J. Baenziger & C. M. Walker: Induction of cytotoxic T lymphocytes by intramuscular immunization with plasmid DNA is facilitated by bone marrow-derived cells. Proc Natl Acad Sci USA 93, 8578-8583 (1996) 23. Iwasaki A., C. A. Torres, P. S. Ohashi, H. L. Robinson & B. H. Barber: The dominant role of bone marrowderived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites. J Immunol 159, 11-14 (1997) 24. Fu T. M., J. B. Ulmer, M. J. Caulfield, R. R. Deck, A. Friedman, S. Wang, X. Liu, J. J. Donnelly & M. A. Liu: Priming of cytotoxic T lymphocytes by DNA vaccines: requirement for professional antigen presenting cells and evidence for antigen transfer from myocytes. Mol Med 3, 362-371 (1997) 25. Corr M., A. von Damm, D. J. Lee & H. Tighe: In vivo priming by DNA injection occurs predominantly by antigen transfer. J Immunol 163, 4721-4727 (1999) 26. Condon C., S. C. Watkins, C. M. Celluzzi, K. Thompson & L. D. Falo, Jr.: DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nat Med 2, 1122- 1128 (1996) 27. Casares S., K. Inaba, T. D. Brumeanu, R. M. Steinman & C. A. Bona: Antigen presentation by dendritic cells after immunization with DNA encoding a major histocompatibility complex class II-restricted viral epitope. J Exp Med 186, 1481-1486 (1997) 28. Song K., Y. Chang & G. J. Prud’homme: IL-12 plasmid-enhanced DNA vaccination against carcinoembryonic antigen (CEA) studied in immune-gene knockout mice. Gene Ther 7, 1527-1535 (2000) 29. Dranoff G: Coordinated tumor immunity. J Clin Invest 111, 1116-1118 (2003) 30. Curcio C., E. Di Carlo, R. Clynes, M. J. Smyth, K. Boggio, E. Quaglino, M. Spadaro, M. P. Colombo, A. Amici, P. L. Lollini, P. Musiani & G. Forni: Nonredundant roles of antibody, cytokines, and perforin in the eradication of established Her-2/neu carcinomas. J Clin Invest 111, 1161-1170 (2003) 31. Klinman D. M., A. K. Yi, S. L. Beaucage, J. Conover & A. M. Krieg: CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. Proc Natl Acad Sci USA 93, 2879-2883 (1996) 32. Ashkar A. A. & K. L. Rosenthal: Toll-like receptor 9, CpG DNA and innate immunity. Curr Mol Med 2, 545-556 (2002) 33. Agrawal S. & E. R. Kandimalla: Medicinal chemistry and therapeutic potential of CpG DNA. Trends Mol Med 8, 114-121 (2002) 34. Dalpke A., S. Zimmermann & K. Heeg: Immunopharmacology of CpG DNA. Biol Chem 383, 1491-1500 (2002)35. Davila E., M. G. Velez, C. J. Heppelmann & E. Celis: Creating space: an antigen-independent, CpG-induced peripheral expansion of naive and memory T lymphocytes in a full T-cell compartment. Blood 100, 2537-2545 (2002) 36. Zinckgraf J. W. & L. K. Silbart: Modulating gene expression using DNA vaccines with different 3'-UTRs influences antibody titer, seroconversion and cytokine profiles. Vaccine 21, 1640-1649 (2003) 37. Xin K. Q., T. Ooki, N. Jounai, H. Mizukami, K. Hamajima, Y. Kojima, K. Ohba, Y. Toda, S. Hirai, D. M. Klinman, K. Ozawa & K. Okuda: A DNA vaccine containing inverted terminal repeats from adeno-associated virus increases immunity to HIV. J Gene Med 5, 438-445 (2003) 38. Hanke T., V. C. Neumann, T. J. Blanchard, P. Sweeney, A. V. Hill, G. L. Smith & A. McMichael: Effective induction of HIV-specific CTL by multi-epitope using gene gun in a combined vaccination regime. Vaccine 17, 589-596 (1999) 39. Smith B. F., H. J. Baker, D. T. Curiel, W. Jiang & R. M. Conry: Humoral and cellular immune responses of dogs immunized with a nucleic acid vaccine encoding human carcinoembryonic antigen. Gene Ther 5, 865-868 (1998) 40. Ito K., K. Ito, N. Shinohara & S. Kato: (2003) DNA immunization via intramuscular and intradermal routes using a gene gun provides different magnitudes and durations on immune response. Mol Immunol 39, 847-854 (2003) 41. Tuting T., A. Gambotto, P. D. Robbins, W. J. Storkus & A. B. DeLeo: Co-delivery of T helper 1-biasing cytokine genes enhances the efficacy of gene gun immunization of mice: studies with the model tumor antigen beta-galactosidase and the BALB/c Meth A p53 tumor-specific antigen. Gene Ther 6, 629-636 (1999) 42. Leitner W. W., M. C. Seguin, W. R. Ballou, J. P. Seitz, A. M. Schultz, M. J. Sheehy & J. A. Lyon: Immune responses induced by intramuscular or gene gun injection of protective deoxyribonucleic acid vaccines that express the circumsporozoite protein from Plasmodium berghei malaria parasites. J Immunol 159, 6112-6119 (1997) 43. Gregoriadis G., A. Bacon, W. Caparros-Wanderley & B. McCormack: A role for liposomes in genetic vaccination. Vaccine 20, Suppl 5:B1-9 (2002) 44. Singh M., M. Briones, G. Ott & D. O'Hagan: Cationic microparticles: A potent delivery system for DNA vaccines. Proc Natl Acad Sci USA 97, 811-816 (2000) 45. Drabick J. J., J. Glasspool-Malone, A. King & R. W. Malone: Cutaneous transfection and immune responses to intradermal nucleic acid vaccination are significantly enhanced by in vivo electropermeabilization. Mol Ther 3, 249-255 (2001) 46. Paster W., M. Zehetner, M. Kalat, S. Schuller & T. Schweighoffer: In vivo plasmid DNA electroporation generates exceptionally high levels of epitope-specific CD8+ T-cell responses. Gene Ther 10, 717-724 (2003) 47. Chen H.-W., Y.-P. Lee, Y.-F. Chung, Y.C. Shih, J.-P Tsai, M.-H. Tao, & C.-C Ting. Inducing long-term survival with lasting anti-tumor immunity in treating B-cell lymphoma by a combined cell-based and hydrodynamic plasmid-encoding IL-12 gene therapy. Internal Immunol 15:427-435 (2003) 48. Hung C. F. & T. C. Wu: Improving DNA vaccine potency via modification of professional antigen presenting cells. Curr Opin Mol Ther 5, 20-24 (2003) 49. Xiang R., F. J. Primus, J. M. Ruehlmann, A. G. Niethammer, S. Silletti, H. N. Lode, C. S. Dolman, S. D. Gillies & R. A. Reisfeld: A dual-function DNA vaccine encoding carcinoembryonic antigen and CD40 ligand trimer induces T cell-mediated protective immunity against colon cancer in carcinoembryonic antigen-transgenic mice. J Immunol 167, 4560-4565 (2001) 50. Hung C. F., K. F. Hsu, W. F. Cheng, C. Y. Chai, L. He, M. Ling & T. C. Wu: Enhancement of DNA vaccine potency by linkage of antigen gene to a gene encoding the extracellular domain of Fms-like tyrosine kinase 3-ligand. Cancer Res 61, 1080-1088 (2001) 51. Boyle J. S., J. L. Brady & A. M. Lew: Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction. Nature 392, 408- 411 (1998) 52. Su Z., J. Vieweg, A. Z. Weizer, P. Dahm, D. Yancey, V. Turaga, J. Higgins, D. Boczkowski, E. Gilboa & J. Dannull: Enhanced induction of telomerase-specific CD4(+) T cells using dendritic cells transfected with RNA encoding a chimeric gene product. Cancer Res 62, 5041- 5048 (2002)53. Ji H., T. L. Wang, C. H. Chen, S. I. Pai, C. F. Hung, K. Y. Lin, R. J. Kurman, D. M. Pardoll & T. C. Wu: Targeting human papillomavirus type 16 E7 to the endosomal/lysosomal compartment enhances the antitumor immunity of DNA vaccines against murine human papillomavirus type 16 E7-expressing tumors. Hum Gene Ther 10, 2727-2740 (1999)54. Xiang R., H. N. Lode, T. H. Chao, J. M. Ruehlmann, C. S. Dolman, F. Rodriguez, J. L. Whitton, W. W. Overwijk, N. P. Restifo & R. A. Reisfeld: An autologous oral DNA vaccine protects against murine melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 97, 5492-5497 (2000) 55. Rice J., S. Buchan & F. K. Stevenson: Critical components of a DNA fusion vaccine able to induce protective cytotoxic T cells against a single epitope of a tumor antigen. J Immunol 169, 3908-3918 (2002) 56. Cid-Arregui A., V. Juarez & H. zur Hausen: A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies. J Virol 77, 4928-4937 (2003) 57. Scheerlinck J. P., G. Casey, P. McWaters, J. Kelly, D. Woollard, M. W. Lightowlers, J. M. Tennent & P. J. Chaplin: The immune response to a DNA vaccine can be modulated by co-delivery of cytokine genes using a DNA prime-protein boost strategy. Vaccine 19, 4053-60 (2001) 58. Conry R. M., G. Widera, A. F. LoBuglio, J. T. Fuller, S. E. Moore, D. L. Barlow, J. Turner, N. S. Yang & D. T. Curiel: Selected strategies to augment polynucleotide immunization. Gene Ther 3, 67-74 (1996) 59. Irvine K. R., J. B. Rao, S. A. Rosenberg & N. P. Restifo: Cytokine enhancement of DNA immunization leads to effective treatment of established pulmonary metastases. J Immunol 156, 238-245 (1996) 60. Kim J. J., J. S. Yang, K. Dang, K.H. Manson, & D. B. Weiner. Engineering enhancement of immune responses to DNA-based vaccines in a prostate cancer model in rhesus macaques through the use of cytokine adjuvants. Clin Cancer Res 7:882s-889s (2001) 61. Biragyn A., M. Surenhu, D. Yang, P. A. Ruffini, B. A. Haines, E. Klyushnenkova, J. J. Oppenheim & L. W. Kwak: Mediators of innate immunity that target immature, but not mature, dendritic cells induce antitumor immunity when genetically fused with nonimmunogenic tumor antigens. J Immunol 167, 6644-6653 (2001)62. Kim J. J., J. S. Yang, T. Dentchev, K. Dang & D. B. Weiner: Chemokine gene adjuvants can modulate immune responses induced by DNA vaccines. J Interferon Cytokine Res 20, 487-498 (2000) 63. Kim T. W., C. F. Hung, M. Ling, J. Juang, L. He, J. M. Hardwick, S. Kumar and T. C. Wu: Enhancing DNA vaccine potency by coadministration of DNA encoding antiapoptotic proteins. J Clin Invest 112, 109-117 (2003) 64. Cappello P., F. Triebel, M. Iezzi, C. Caorsi, E. Quaglino, P. L. Lollini, A. Amici, E. Di Carlo, P. Musiani, M. Giovarelli & G. Forni: LAG-3 Enables DNA vaccination to persistently prevent mammary carcinogenesis in HER-2/neu transgenic BALB/c Mice. Cancer Res 63, 2518-25 (2003) 65. He Y., A. A. Pimenov, J. V. Nayak, J. Plowey, L. D. Falo, Jr. & L. Huang: Intravenous injection of naked DNA encoding secreted flt3 ligand dramatically increases the number of dendritic cells and natural killer cells in vivo. Hum Gene Ther 11, 547-554 (2002) 66. Fong C. L. & K. M. Hui: Generation of potent and specific cellular immune responses via in vivo stimulation of dendritic cells by pNGVL3-hFLex plasmid DNA and immunogenic peptides. Gene Ther 9, 1127-1138 (2002) 67. Weber L. W., W. B. Bowne, J. D. Wolchok, R. Srinivasan, J. Qin, Y. Moroi, R. Clynes, P. Song, J. J. Lewis & A. N. Houghton: Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA. J Clin Invest 102, 1258-1264 (1998) 68. Su J. M., Y. Q. Wei, L. Tian, X. Zhao, L. Yang, Q. M. He, Y. Wang, Y. Lu, Y. Wu, F. Liu, J. Y. Liu, J. L. Yang, Y. Y. Lou, B. Hu, T. Niu, Y. J. Wen, F. Xiao, H. X. Deng, J. Li & B. Kan: Active immunogene therapy of cancer with vaccine on the basis of chicken homologous matrix metalloproteinase-2. Cancer Res 63, 600-607 (2003) 69. Hawkins W. G., J. S. Gold, N. E. Blachere, W. B. Bowne, A. Hoos, J. J. Lewis & A. N. Houghton: Xenogeneic DNA immunization in melanoma models for minimal residual disease. J Surg Res 102, 137-143 (2002) 70. Bergman P. J., J. McKnight, A. Novosad, S. Charney, J. Farrelly, D. Craft, M. Wulderk, Y. Jeffers, M. Sadelain, A. E. Hohenhaus, N. Segal, P. Gregor, M. Engelhorn, I. Riviere, A. N. Houghton & J. D. Wolchok: Long-term survival of dogs with advanced malignant melanoma after DNA vaccination with xenogeneic human tyrosinase: a phase I trial. Clin Cancer Res 9, 1284-1290 (2003) 71. Wei Y.-Q., M.-J. Huang, L. Yang, X. Zhao, L. Tian, Y. Lu, J.- M. Shu, C.-J. Lu, T. Niu, B. Kang, Y.-Q. Mao, F. Liu, Y.-J. Wen, S. Lei, F. Luo, L.-Q. Zhou, F. Peng, Y. Jiang, J.-Y. Liu, H. Zhou, Q.-R. Wang, Q.-M. He, F. Xiao, Y.-Y. Lou, X.-J. Xie, Q. Li, Y. Wu, Z.-Y. Ding, B. Hu, M. Hu & W. Zhang: Immunogene therapy of tumors with vaccine based upon Xenopus homologous vascular endothelial growth factor as a model antigen. Proc Natl Acad Sci USA 98, 11545-11550 (2001) 72. Fong L., D. Brockstedt, C. Benike, J. K. Breen, G. Strang, C. L. Ruegg & E. G. Engleman: Dendritic cellbased xenoantigen vaccination for prostate cancer immunotherapy. J Immunol 167, 7150-7156 (2001) 73. Woodberry T., J. Gardner, S. L. Elliott, S. Leyrer, D. M. Purdie, P. Chaplin & A. Suhrbier: Prime boost vaccination strategies: CD8 T cell numbers, protection, and Th2 bias. J Immunol 170, 2599-2604 (2003) 74. Pasquini S., S. Peralta, E. Missiaglia, L. Carta & N. R. Lemoine: Prime-boost vaccines encoding an intracellular idiotype/GM-CSF fusion protein induce protective cellmediated immunity in murine pre-B cell leukemia. Gene Ther 9, 503-510 (2002) 75. Otten G., M. Schaefer, C. Greer, M. Calderon-Cacia, D. Coit, J. Kazzaz, A. Medina-Selby, M. Selby, M. Singh, M. Ugozzoli, J. Zur Megede, S. W. Barnett, D. O'Hagan, J. Donnelly & J. Ulmer: Induction of broad and potent antihuman immunodeficiency virus immune responses in rhesus macaques by priming with a DNA vaccine and boosting with protein-adsorbed polylactide coglycolide microparticles. J Virol 77, 6087-6092 (2003) 76. Wang R., D. L. Doolan, T. P. Le, R. C. Hedstrom, K. M. Coonan, Y. Charoenvit, T. R. Jones, P. Hobart, M. Margalith, J. Ng, W. R. Weiss, M. Sedegah, C. de Taisne, J. A. Norman, & S. L. Hoffman: Induction of antigenspecific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria DNA vaccine. Science 28, 476-480 (1998) 77. Roy M. J., M. S. Wu, L. J. Barr, J. T. Fuller, L. G. Tussey, S. Speller, J. Culp, J. K. Burkholder, W. F. Swain, R. M. Dixon, G. Widera, R. Vessey, A. King, G. Ogg, A. Gallimore, J. R. Haynes & D. Heydenburg Fuller: Induction of antigen-specific CD8+ T cells, T helper cells, and protective levels of antibody in humans by particlemediated administration of a hepatitis B virus DNA vaccine. Vaccine 19, 764-778 (2000) 78. MacGregor R. R., R. Ginsberg, K. E. Ugen, Y. Baine, C. U. Kang, X. M. Tu, T. Higgins, D. B. Weiner & J. D. Boyer: T-cell responses induced in normal volunteers immunized with a DNA-based vaccine containing HIV-1 env and rev. AIDS 16, 2137-2143 (2002) 79. Calarota S., G. Bratt, S. Nordlund, J. Hinkula, A. C. Leandersson, E. Sandstrom & B. Wahren: Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1- infected patients. Lancet 351, 1320-1325 (1998) 80. Conry R. M., D. T. Curiel, T. V. Strong, S. E. Moore, K. O. Allen, D. L. Barlow, D. R. Shaw & A. F. LoBuglio: Safety and immunogenicity of a DNA vaccine encoding carcinoembryonic antigen and hepatitis B surface antigen in colorectal carcinoma patients. Clin Cancer Res 8, 2782- 2787 (2002) 81. Rosenberg S. A., J. C. Yang, R. M. Sherry, P. Hwu, S. Topalian, D. J. Schwartzentruber, N. P. Restifo, L. R. Haworth, C. A. Seipp, L. J. Freezer, K. E. Morton, S. A. Mavroukakis & D. E. White: Inability to immunize patients with metastatic melanoma using plasmid DNA encoding the gp100 melanoma-melanocyte antigen. Hum Gene Ther 14, 709-714 (2003) 82. Tagawa S. T., P. Lee, J. Snively, W. Boswell, S. Ounpraseuth, S. Lee, B. Hickingbottom, J. Smith, D. Johnson, & J.S. Weber. Phase I study of intranodal delivery of a plasmid DNA vaccine for patients with Stage IV melanoma. Cancer 98, 144-154 (2003) 83. Pavlenko, M., A. K. Ross, A. Lundqvist, A. Palmborg, A.M. Miller, V. Ozenci, B. Bergman, L. Egevad, M. Hellstrom, R. Kiessling, G. Masucci, P. Wersall, S. Nilsson, & P. Pisa. A phase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer. Br J Cancer 91, 688-694 (2004) 84. Timmerman J. M., G. Singh, G. Hermanson, P. Hobart, D. K. Czerwinski, B. Taidi, R. Rajapaksa, C. B. Caspar, A. Van Beckhoven & R. Levy: Immunogenicity of a plasmid DNA vaccine encoding chimeric idiotype in patients with B-cell lymphoma. Cancer Res 62, 5845-5852 (2002) 85. Timmerman J. M. & R. Levy: The history of the development of vaccines for the treatment of lymphoma. Clin Lymphoma 1, 129-139 (2000) 86. Bendandi M., C. D. Gocke, C. B. Kobrin, F. A. Benko, L. A. Sternas, R. Pennington, T. M. Watson, C. W. Reynolds, B. L. Gause, P. L. Duffey, E. S. Jaffe, S. P. Creekmore, D. L. Longo & L. W. Kwak: Complete molecular remissions induced by patient-specific vaccination plus granulocyte-monocyte colony-stimulating factor against lymphoma. Nat Med 5, 1171-1177 (1999) 87. Klencke B., M. Matijevic, R. G. Urban, J. L. Lathey, M. L. Hedley, M. Berry, J. Thatcher, V. Weinberg, J. Wilson, T. Darragh, N. Jay, M. Da Costa & J. M. Palefsky: Encapsulated plasmid DNA treatment for human papillomavirus 16-associated anal dysplasia: a Phase I study of ZYC101. Clin Cancer Res 8, 1028-1037 (2002) 88. Sheets E. E., R. G. Urban, C. P. Crum, M. L. Hedley, J. A. Politch, M. A. Gold, L. I. Muderspach, G. A. Cole & P. A. Crowley-Nowick: Immunotherapy of human cervical high-grade cervical intraepithelial neoplasia with microparticle-delivered human papillomavirus 16 E7 plasmid DNA. Am J Obstet Gynecol 188, 916-926 (2003) 89. Stevanovic S.: Identification of tumour-associated Tcell epitopes for vaccine development. Nat Rev Cancer 2, 514-520 (2002) 90. Nelson P. S.: Identifying immunotherapeutic targets for prostate carcinoma through the analysis of gene expression profiles. Ann NY Acad Sci 975, 232-46 (2002) 91. Schultze J. L. & R. H. Vonderheide: From cancer genomics to cancer immunotherapy: toward secondgeneration tumor antigens. Trends Immunol 22, 516-523 (2001) 92. Chen Y. T.: Cancer vaccine: identification of human tumor antigens by SEREX. Cancer J 6, Suppl 3, S208-217 (2000) 93. Naour F. L., F. Brichory, L. Beretta & S. M. Hanash: Identification of tumor-associated antigens using proteomics. Technol Cancer Res Treat 1, 257-262 (2002) 94. Niethammer A. G., R. Xiang, J. C. Becker, H. Wodrich, U. Pertl, G. Karsten, B. P. Eliceiri & R. A. Reisfeld: A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med 8, 1369-1375 (2002) 95. Xiang R., N. Mizutani, Y. Lou, C. Chiodoni, H. Zhou, M. Mizutani, Y. Ba, J.C. Becker, & R. A. Reisfeld: A DNA vaccine targeting survivin combines apoptosis with suppression of angiogenesis in lung tumor eradication. Cancer Res 65, 553-561, (2005) 96. McConkey S. J., W. H. Reece, V. S. Moorthy, D. Webster, S. Dunachie, G. Butcher, J. M. Vuola, T. J. Blanchard, P. Gothard, K. Watkins, C. M. Hannan, S. Everaere, K. Brown, K. E. Kester, J. Cummings, J. Williams, D. G. Heppner, A. Pathan, K. Flanagan, N. Arulanantham, M. T. Roberts, M. Roy, G. L. Smith, J. Schneider, T. Peto, R. E. Sinden, S. C. Gilbert & A. V. Hill: Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans. Nat Med 9, 729-735 (2003)

Адрес для корреспонденции: Dr. Theresa V. Strong, WTI 558, 1530 3rd Avenue South, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL 35294-3300, Tel: 205-975-9878, Fax: 205-934-9511, E-mail: [email protected]

Портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru

19.05.2008

www.vechnayamolodost.ru

днк-вакцины - salesjungle

Оригинал статьи опубликован на сайте Solvay-pharma.ru , с использованием xTerra.Ru

Традиционные вакцины, избавившие человека от десятков инфекционных заболеваний, во многих случаях остаются неэффективными либо слишком небезопасными. Возможность преодолеть присущие им ограничения появилась с развитием генной инженерии. В качестве альтернативы обычным методам иммунизации разрабатываются ДНК-вакцины.

Массовая вакцинация привела к исчезновению оспы, почти уничтожила полиомиелит и невероятным образом снизила число случаев заболевания тифом, корью, гепатитом A и B, столбняком, дифтерией... Тем не менее возможности традиционных вакцин далеко не безграничны. Не возымели успеха попытки иммунизации против таких давно и хорошо известных болезней, как туберкулез и малярия. Двадцать лет назад список пополнился СПИДом. Кроме того, все более опасными становятся инфекции, с которыми, казалось бы, уже научились бороться, создав эффективные методы предупреждения и лечения. Появление устойчивых штаммов возбудителей, активно мутирующих и адаптирующихся к действию даже самых новых лекарственных препаратов, вынуждает постоянно обновлять медицинскую практику. Применение ДНК-вакцин, уже очевидно, займет в ней не последнее место.

В последние 10 лет ДНК-вакцины из сомнительной идеи превратились в чрезвычайно перспективное направление биомедицинских исследований.

Впервые предположение, что гены могут быть использованы для вакцинации, появилось почти полвека назад, после серии исследований, проведенных в 50-60-е гг. Эксперименты, к слову, вовсе не имевшие отношения к созданию вакцин, продемонстрировали один интересный эффект, который сегодня, впрочем, кажется очевидным. Ученые обнаружили, что фрагменты «чужой» ДНК, имплантированные в клетки животных, способны в некотором количестве синтезировать собственные белки. Сами клетки, получившие гены другого организма, в ответ начинают вырабатывать антитела. Позднее результаты этих экспериментов подтвердились в ходе других исследований, проводившихся с целью создания новых методов лечения различных заболеваний, прежде всего наследственного характера. Имеется в виду генная терапия, первые попытки применения которой были не слишком удачными. Опыты на животных показали, что «терапевтические» гены, имплантируемые с благим намерением исправить то или иное нарушение, провоцируют иммунную реакцию и потому долго не живут. Такое наблюдение, с одной стороны, несколько разочаровало ученых, однако вскоре пришлось убедиться, что нет худа без добра. Иммунный ответ на появление чужеродных генов стали всерьез, хотя поначалу и не без некоторых сомнений, рассматривать как принцип действия вакцин нового типа.

С начала 90-х гг. научные лаборатории начали все активнее работать в этом направлении. Вводя вакцины лабораторным грызунам и приматам, ученые зафиксировали возникновение иммунной реакции, противодействующей многим различным патогенам. Более того, было доказано, что вакцины имеют некоторый эффект при терапии определенных видов рака. Хотя злокачественные опухоли вовсе не являются инфекционными заболеваниями, исследования показали, что с их развитием можно бороться за счет повышения активности иммунной системы. Позднее состоялись первые клинические испытания на человеке, которые прежде всего должны были продемонстрировать безопасность нового метода. Эксперименты состояли в том, что гены ВИЧ вносили в клетки пациентов, уже зараженных вирусом. Еще позднее аналогичные операции проделали со здоровыми людьми. Помимо генов вируса иммунодефицита им пересаживали гены гриппа, а в ходе дальнейших исследований – герпеса и гепатита B. Результаты всех тестов оказались вполне обнадеживающими: вакцины стабильно провоцировали иммунный ответ. Что касается соображений в духе «не навреди», то серьезных побочных эффектов, способных привести к неприятным последствиям, отмечено не было.

Эксперименты по созданию ДНК-вакцин преимущественно ведутся с бактериальными плазмидами – небольшими стабильными кольцевыми ДНК, которые содержатся вне хромосом. Плазмиды хороши в том плане, что сами по себе не провоцируют инфекцию. Фактически их используют только в качестве вектора – средства доставки. Чтобы вызвать необходимую иммунную реакцию, выделенные из бактерий плазмиды модифицируют, внося определенные изменения в структуру ДНК. А именно вшивают гены, которые кодируют один или несколько определенных белков-антигенов, вырабатываемых конкретной бактерией или вирусом. Также встраиваются гены, необходимые для обеспечения экспрессии (активности) всей конструкции. В то же время фрагменты ДНК, ответственные за воспроизводство и размножение инфекции, в плазмиды не переносятся. Вводится вакцина обычно либо путем инъекции, либо с помощью так называемой «генной пушки». Этот аппарат, выпуская струю сжатого гелия, пробивает клеточные мембраны микроскопическими металлическими частицами, покрытыми ДНК. Попав тем или иным способом внутрь клеток, плазмиды провоцируют синтез белков-антигенов. Их появление вакцинируемый организм воспринимает как полноценное инфицирование и реагирует обычным образом, в итоге вырабатывая иммунитет против соответствующей бактерии или вируса.

Уже первые успешные испытания, в ходе которых была продемонстрирована перспективность самой идеи создания ДНК-вакцин, привлекли немалое внимание как государственных структур, действующих в сфере здравоохранения, так и крупнейших частных компаний. Многие из них подключились на самых ранних этапах исследований, либо разработав собственные научные программы, либо заключив соглашения с академическими центрами и лабораториями. Сегодня Aventis, Merck, Pfizer и другие фармацевтические и биотехнологические гиганты рассматривают создание новых методов иммунизации как одно из приоритетных направлений работы.

ДНК-вакцины в разных отношениях выглядят намного предпочтительнее традиционных средств.

Стойкость иммунитета, который вырабатывается в ответ на введение ДНК-вакцин, определяется принципиально важным обстоятельством. Поскольку антигены синтезируются внутри самого организма, а не поступают с него извне, вызывается комплексная реакция. Активизируются все типы белых кровяных телец: B-лимфоциты вырабатывают антитела, нейтрализующие антигены в жидких межклеточных тканях (гуморальный иммунный ответ), а цитотоксические Т-лимфоциты разрушают болезнетворные агенты внутри клеток (клеточный иммунный ответ).

Аналогичным образом действуют вакцины, содержащие живые аттенуированные (ослабленные) вирусы или бактерии. Однако их применение может быть связано с некоторыми рисками. Хотя вводится лишь ослабленный патоген, вероятность инфицирования и развития болезни при определенных условиях не исключена. Даже ослабленные вирусы или бактерии не являются стопроцентно безопасными, что подтверждают медицинские отчеты, описывающие отдельные случаи заболевания при вакцинации. Особенно рискуют люди с иммунной недостаточностью, такие как больные СПИДом и раковые пациенты, проходящие курсы химиотерапии. Кроме того, ослабленные живые бактерии и вирусы в некоторых случаях могут мутировать, восстанавливая весь свой патогенный потенциал. Более безопасны вакцины, которые содержат убитый патоген либо отдельный очищенный его компонент – белок или полисахарид. Однако такие препараты менее эффективны: они в основном вызывают только гуморальный иммунный ответ и, кроме того, нередко требуют проведения повторных вакцинаций.

К недостаткам обычных вакцин относится и то, что они достаточно дороги в производстве (применяются разнообразные технологии изготовления, зависящие от особенностей конкретных микробов), а также нуждаются в особых условиях хранения и транспортировки – прежде всего, постоянной низкой температуре. Два этих обстоятельства существенно осложняют возможность массового применения самых необходимых лекарств во многих не особенно благополучных странах.

ДНК-вакцины заметно превосходят по своим характеристикам обычные препараты. В целом результаты многочисленных лабораторных исследований и клинических испытаний указывают на то, что ДНК-вакцины обладают всеми положительными свойствами традиционных вакцин, при этом не имея их недостатков. Введение фрагментов ДНК бактерий или вирусов вызывает полноценную иммунную реакцию, но совершенно исключает возможность заражения, поскольку в клетки не попадают гены, необходимые для развития инфекции. ДНК-вакцины сравнительно просто синтезировать в значительных количествах, используя уже ставшую обычной рекомбинантную технологию. Причем весь производственный процесс предельно унифицирован – меняются только гены, которые включаются в плазмиду. Кроме того, поскольку вакцины способны содержать фрагменты ДНК сразу нескольких различных штаммов возбудителей, их можно использовать для противодействия целому ряду инфекций одновременно. Что было бы чрезвычайно полезно, особенно в случае, если дело касается таких изменчивых и многоликих микроорганизмов, как вирус гриппа. Наконец, ДНК-вакцины чрезвычайно устойчивы и могут, в растворе или в сухом виде, храниться при обычных условиях, выдерживая высокие и низкие температуры и разный уровень влажности.

Разумеется, столь многообещающий метод иммунизации не лишен недостатков, самый очевидный из которых вытекает из самой природы ДНК-вакцин. Поскольку вводятся гены, кодирующие белковые молекулы, вырабатывается иммунный ответ только на появление белковых компонентов вирусов и бактерий. Иначе говоря, традиционным вакцинам, в которых используются полисахариды, пока нет альтернативы. Другие потенциально слабые места ДНК-вакцин активно проверяются. Существовало опасение, что чужеродная ДНК может каким-то образом повредить ДНК человека. Другая неприятность, которую подозревали при первых испытаниях, - возникновение аутоиммунного ответа, т. е. реакции, направленной против собственных клеток. Также не исключалась вероятность развития толерантности к препарату и, как следствие, быстрого снижения эффекта от вакцинации. Хотя все эти проблемы не проявились при проведении тестов, ученые продолжают оценивать риски, связанные с применением нового метода иммунизации.

Используя одно из принципиальных генетических отличий человека от бактерии, ученые надеются победить все инфекции.

Результаты некоторых исследований позволяют предположить, что функции плазмид-векторов на самом деле не ограничиваются доставкой «инфекционных» генов. Иммунная реакция, вызываемая этими генами (точнее, соответствующими им белками) самими плазмидами дополнительно усиливается. Такой эффект, вероятно, связан с тем принципиальным обстоятельством, что в ДНК микроорганизмов, в том числе в кольцевых плазмидах, часто встречается определенный фрагмент, а именно связка цитозина (C) и гуанина (G). Эти два нуклеотидных основания намного реже соседствуют в ДНК позвоночных. Кроме того, если у позвоночных цитозин и гуанин расположены последовательно в одной цепочке двойной спирали, к ним обычно прикрепляется метиловая химическая группа. Бактерии обходятся без этого дополнения. Ученые предполагают, что клетки позвоночных воспринимают часто повторяющиеся неметилированные CG-фрагменты как сигнал опасности. В ответ активизируется так называемая «первичная» часть иммунной системы, работа которой не связана с распознаванием специфичных белков-антигенов.

Эта гипотеза лежит в основе особого направления исследований в рамках работы над ДНК-вакцинами. Несколько научных групп сегодня пытаются создать препарат, способный на короткое время активизировать иммунную систему таким образом, чтобы она немедленно и мощно реагировала на вторжение любой инфекции. Такой препарат, к примеру, обезопасил бы людей, которым предстоит дальняя поездка, особенно по неблагополучным в санитарном отношении районам. Вакцину могли бы принимать пациенты, ожидающие хирургическую операцию и желающие максимально исключить вероятность заражения и развития инфекции, очевидную при пониженной активности иммунной системы. Кроме того, возникает возможность обезопасить людей, вынужденных находиться на зараженных территориях. Последний пункт становится особенно актуальным в связи с известными событиями, напугавшими растущей угрозой применения биологического оружия.

Принцип, который разрабатывается при создании универсальной вакцины, подразумевает использование не генов, кодирующих белки-антигены микробов, а бактериальных последовательностей CG в качестве активного компонента вакцины. Идея в том, что когда иммунная система человека обнаруживает часто встречающиеся CG-фрагменты ДНК, лишенные метиловой группы, немедленно вызывается общий иммунный ответ, который защищает от инфекции. Нужно подчеркнуть, что поскольку эта реакция является неспециализированной, она направлена против многих видов бактерий одновременно, в том числе штаммов, которые не поддаются воздействию обычных вакцин.

Такое действие, как подтверждают начальные исследования, существует не только чисто теоретически. Предварительные испытания дают вдохновляющие результаты как в плане проверки препаратов на наличие неблагоприятных побочных эффектов, так и в отношении развития стойкого иммунитета. Эксперименты на мышах показали, что ДНК-вакцина такого типа предотвращает развитие сибирской язвы. Также продемонстрирована эффективность препарата при борьбе с лихорадкой Эбола и другими инфекциями, в том числе теми, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия. Кроме того, вакцина способна защитить и от паразитов. В частности, тесты показали ее противомалярийное действие. Как отмечают ученые, синтетические препараты, содержащие CG бактерий в качестве активного компонента, прежде всего ограничивают рост и размножение патогенов на ранних стадиях развития инфекции.

О воздействии вакцины на человека и тем более о перспективах ее терапевтического применения ученые пока говорят осторожно. Первые лабораторные эксперименты с человеческими клетками оказались вполне успешными, однако полный цикл клинических испытаний еще предстоит провести. С другой стороны, особенных неприятных неожиданностей, как кажется, ожидать вряд ли следует. Многочисленные бактериальные последовательности цитозина и гуанина содержатся в любой ДНК-вакцине, в том числе в тех, которые уже были протестированы на людях. Проводились и более предметные исследования, в ходе которых оценивалось действие именно CG-фрагментов. В частности, испытания проводили специалисты компании Coley Pharmaceuticals. Правда, они использовали соединение гуанина и цитозина в соответствии с первоначальной идеей, т. е. только в качестве средства, усиливающего действие других вакцин. Пока неясно, планируют ли Coley и другие фармацевтические компании расширить исследования и взяться за разработку полнофункционального самостоятельного препарата. Вполне возможно, что планируют или даже уже делают. В том числе, не исключено, с прицелом на применение вакцины против искусственно созданных штаммов. Во всяком случая, в одном из заявлений Артур Криг (Arthur Krieg), глава научного отдела Coley, высказался в том плане, что использование CG бактерий может быть чрезвычайно эффективным способом активизации естественной иммунной системы с целью обеспечения защиты от биологического оружия различного типа.Ссылки по теме:[РИА Новости] За последние 40 лет человечество получило 72 новых инфекции [Medlinks.ru] Дмитрий Томилов, Генетическая прививка ["Наука в Сибири"] Валентин Власов, Генная терапия и генная иммунизация -- технологии завтрашнего дня [Weandyou.org.ru] Г. Дж. Нэйбел, Трудности и перспективы создания вакцины от СПИДа [GennoTerra] В ЮАР приступают к испытаниям генетической вакцины против ВИЧ-инфекции [app.rol.ru] Разработана генетическая вакцина против малярии ["Аптека"] Андрей Спасокукоцкий, Проект человеческого генома и его роль в развитии фармацевтической промышленности

salesjungle.livejournal.com

Смотрите также

• 
  Название вакцин
• 
  Сэбина вакцина
• 
  Вакцина сэбина
• 
  Вакцина противотуберкулезная
• 
  Вакцина дюрамун
• 
  Ас вакцина
• 
  Вакцина сибиреязвенная
• 
  Хранение вакцин
• 
  Какую вакцину
• 
  Вакцина эувакс
• 
  Вакцина ротарикс