Живая прививка против краснухи. Аттенуированная вакцина это

АТТЕНУИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ЭТО, Виды вакцин

Показания к применению вакцины против краснухи культуральной живой аттенуированной. Особые указания при приеме вакцины против краснухи культуральной живой аттенуированной. Живые вакцины обладают и рядом недостатков. Вакцина «Рудивакс» предназначена для выработки иммунитета от краснухи.

Выделяют моновакцины — вакцины, приготовленные из одного патогена, и поливакцины — вакцины, приготовленные из нескольких патогенов и позволяющие развить стойкость к нескольким болезням. Живые вакцины изготовляют на основе ослабленных штаммовмикроорганизма со стойко закрепленной авирулентностью (безвредностью). Вакцинный штамм после введения размножается в организме привитого и вызывает вакцинальный инфекционный процесс.

Дивергентные вакцины

Примером живых вакцин могут служить вакцины для профилактики краснухи, кори, полиомиелита, туберкулеза, паротита. Достигается высокая (до 95% и выше) степень очистки вакцины. Химические вакцины состоят из антигенов, полученных из микроорганизмов разными методами, преимущественно химическими. Основной принцип получения химических вакцин заключается в выделении протективных антигенов, обеспечивающих создание надежного иммунитета, и очистке этих антигенов от балластных веществ.

Вакцины — иммунобиологические препараты, предназначенные для активной иммунопрофилактики, то есть для создания активной специфической невосприимчивости организма к конкретному возбудителю. Поскольку все живые вакцины содержат микробные тела, то их относят к группе корпускулярных вакцинных препаратов. Иммунизация живой вакциной приводит к развитию вакцинального процесса, протекающего у большинства привитых без видимых клинических проявлений.

Подобные явления более типичны для противовирусных вакцин (например, живая полиомиелитная вакцина в редких случаях может вызвать полиомиелит вплоть до развития поражения спинного мозга и паралича). Наиболее известны и длительно применяются вакцина против натуральной оспы (из вируса коровьей оспы) и БЦЖ для профилактики туберкулёза (из микобактерий бычьего туберкулёза). В своем иммунном ответе, правильно функционирующие иммунные системы уничтожают аттенуированные патогены.

Если вакцина была выращена в зараженной культуре тканей, есть возможность ее заражения другими вирусами (например, ретровирусами с коревой вакциной). ЖАВ требуют особого внимания к соблюдению холодовой цепи, для сохранения активности вакцины и вызывают сбой программы, если такие требования не выполняются.

В таблице ниже перечислены редкие, наиболее тяжелые побочные реакции, вызываемые данными вакцинами. Непосредственно перед использованием вакцину разводят растворителем (вода для инъекций) из расчета 0,5 мл растворителя на одну прививочную дозу вакцины.

Для разведения вакцины отсасывают весь необходимый объем растворителя и переносят его в ампулу с сухой вакциной. После перемешивания вакцину набирают другой иглой в стерильный шприц и используют для вакцинации. Применение данной вакцины у женщин на ранних стадиях еще не установленной беременности не является показанием для прерывания этой беременности.

Информация: В наличии вакцина от ветрянки (ветряной оспы) ВАРИЛРИКС. В наличии имеется весь спектр вакцин от ведущих импортных фирм и отечественных производителей. Внимание! Новая и единственная прививка от пневмонии для детей с 2-х мес. до 5 лет! Вакцина Превенар.

Транспортировка вакцины во время выездной вакцинации осуществляется с обязательным соблюдением холодовой цепи (постоянно поддерживается необходимая температура хранения вакцины). Гепатит В (как и гепатит С, против которого нет пока вакцины) чаще является причиной цирроза и опухолевых заболеваний печени.

В России с 2002 года вакцинация от краснухи введена в Национальный календарь обязательных профилактических прививок. Краснуха — это инфекционное заболевание, вызванное вирусом. Прививка вакциной «Рудивакс» показана с целью профилактики краснушной инфекции независимо от пола детям с 12 месяцев.

У большинства привитых вакцинальная инфекция протекает без выраженных клинических симптомов и приводит к формированию, как правило, стойкого иммунитета. Если в своём составе вакцина содержит антигены возбудителей разных инфекций, то её относят к комбинированным вакцинам.

Вакцина от краснухи «Рудивакс» имеет некоторые противопоказания. Вакцина краснушная (живая) может быть введена совместно с другими вакцинами. Иммуноглобулин не вводится одновременно с вакциной «Рудивакс». Для иммунизации от краснухи применяется, в том числе, импортная вакцина «Рудивакс» (Rudivax). Наиболее широко применяется комбинированная вакцина для профилактики кори, паротита и краснухи.

hmunoserton.ru

Вакцина против краснухи живая аттенуированная для профилактики краснухи

Термин «краснуха» происходит от латинского слова «rubella», что означает – «маленький красный». Краснухой принято называть антропонозное (болеют только люди) вирусное заболевание, которое характеризуется воспалением затылочных лимфатических узлов и мелкопятнистой сыпью. Болезнь делится на две категории: врожденная и приобретенная. Заболевание очень опасно для беременных женщин: часто поражается плод с возникновением краснухи и развитием врожденных дефектов развития. Среди инфекционных заболеваний, передающихся вертикальным путем от матери к ребенку, так называемых торч инфекций, краснухе принадлежит особенное место.

Вакцина против краснухи живая аттенуированная: состав и форма выпуска

Вакцина от краснухи культивируется на диплоидных человеческих клетках. Препарат представляет гомогенный сухой порошок бледно-желтого цвета с розовым оттенком. Одна доза (полмиллилитра) содержит:

• Вирус краснухи объемом от 1000 тканевых цитопатических доз.
• Сорбитол - 12,5 мг.
• Желатин - 6,25 мг.
• L-аргинина гидрохлорид - 4 мг.
• Мальтоза - 2,5 мг, натрия хлорид - 1,4 мг.
• Лактальбумина гидролизат - 1,12 мг.
• L-аланин - 0,5 мг.
• Неомицина сульфат - не более 25 мкг.

Живая аттенуированная вакцина против краснухи (фото: www.microgen.ru)

Порошок выпускается во флаконах. Содержит одну или десять доз. В комплекте идет растворитель в ампуле от половины до пяти миллилитров. В коробке содержится по пятьдесят флаконов вакцины и растворителя.

Характеристика вакцины (фармакологическое действие)

Прививка содержит ослабленный вирус краснухи. Концентрация настолько маленькая, что не способна вызвать заболевание. Вакцина способствует тому, что организм распознает вирусные антигены. На вирусные антигены клетки иммунной системы начинают вырабатывать антитела. Как правило, на это требуется от двух до трех недель.  При дальнейшей встрече с вирусом, иммунный ответ начинается сразу. Это не позволяет развиться болезни. В том случае, если иммунитет человека ослабленный, заболевание протекает в облегченной форме.

Показания для введения вакцины

Прививка показана для профилактики кори согласно Национальному календарю прививок (НКП). Полноценная иммунизация состоит с двух введений вакцины с интервалом в пять лет. Так же прививка применяется по эпидемическим показаниям, для людей с повышенным риском заболеваемости. Перед введением прививки специальная подготовка не требуется.

Способ применения вакцины и дозы

Согласно НКП, прививку против краснухи вводят дважды:

• Первичная вакцинация проводится в возрасте двенадцати месяцев.
• Второе введение препарата (ревакцинация) - в шесть лет.

Единичная доза прививки – полмиллилитра.

Перед применением прививки ее нужно развести растворителем, который идет в комплекте. Ампулу нельзя трясти, так как образуется пена. Ее нужно слегка покачивать. На протяжении трех минут вакцина полностью растворяется и имеет вид прозрачной однородной жидкости с розовато-желтым оттенком. Запрещено применять ампулы и флаконы с нарушенной целостностью, истекшим сроком годности. Прививки, изменившие свои физические свойства (цвет, консистенцию), непригодны к применению. Также не стоит заменять растворитель, идущий в комплекте.

Национальный календарь прививок Российской Федерации (фото: www.gdp1-kbr.ucoz.ru)

Раскрытие флакона и сама процедура вакцинации проводится в стерильных условиях. Перед вскрытием ампулы место надреза обрабатывается спиртом. Вакцину разводят полным объемом растворителя. После смешивания вакцину набирают в стерильный шприц. Прививку осуществляют подкожно, в плечевую область, предварительно обработав место инъекции антисептическим раствором.

Растворенную вакцину вводят на протяжении трех минут. Она не подлежит хранению.

Противопоказания для введения вакцины

Существует несколько групп населения, которым прививка против краснухи противопоказана. К ним относят:

• Инфекционные заболевания в острой фазе, сопровождающиеся лихорадкой, интоксикацией и сыпью.
• Онкогематологические заболевания (наличие опухолевых процессов в крови и кроветворных органах), раковые заболевания в фазе обострения.
• Неадекватная реакция на предыдущее введение прививки (шок, отек Квинке, гипертермия, появление сыпи).
• Беременность. Следует удержаться от зачатия на протяжении двух месяцев после проведения вакцинации.

Важно! Если ребенку назначены препараты, угнетающие иммунную систему (иммуносупрессоры), лучевая терапия – вакцинацию разрешено проводить через год после завершения приема медикаментов

Побочное действие вакцины, осложнения

Побочные реакции возникают редко. Они связаны с нарушением техники введения вакцины, игнорированием противопоказаний и несоблюдением правил хранения и транспортировки прививки.

В месте инъекции может возникать отек, покраснение, болезненность.

Также может быть отрицательная реакция со стороны различных систем организма:

• Высыпание на коже в виде мелких точек.
• Кратковременное повышение температуры до 37-38 градусов по Цельсию.
• Увеличение лимфатических узлов затылочной и заднешейной группы.
• Сухой кашель, заложенность носа, общая слабость, головная боль.
• Тошнота и рвота.
• Боль в коленных и лучезапястных суставах, которая продолжается около двух недель.
• Поражение нервной системы в виде нарушения поверхностной чувствительности, ощущения ползания мурашек по коже.

Побочные реакции характеризуются кратковременностью. Они проходят самостоятельно через два-три дня.

Совет врача! Во избежание возникновения побочных реакций перед вакцинацией врач проводит полный осмотр вакцинируемых детей. Это поможет определить наличие возможных противопоказаний и прививку сделают позже

Применение вакцины           

Вакцина предназначена для плановой вакцинации детей в возрасте одного года и шести лет стандартной дозой.

Беременным женщинам вакцинация противопоказана.

Если ребенку не проводилась вакцинация согласно НКП, их прививают однократно стандартной дозой.

За и против

Прививка против краснухи обязательная. Она показана всем категориям населения. Побочные эффекты и поствакцинальные реакции возникают редко. Для образования стойкого видоспецифического иммунитета требуется всего два введения прививки. Так как краснуха – опасное заболевание, как в детском возрасте, так и для беременных женщин, следует улучшать эпидемическую обстановку среди населения. Вакцинация помогает уменьшить возникновение эпидемических вспышек.

Особые указания

Прививку вводят подкожно. Другие варианты введения противопоказаны, так как с их помощью невозможно добиться полноценного иммунного ответа. Прививку нельзя вводить беременным женщинам. После прививания не рекомендуется мочить и чесать место прививки на протяжении двух дней. Это предупредит инфекцию.

Взаимодействие с другими средствами для иммунопрофилактики

Вакцина хорошо взаимодействует с другими средствами для иммунопрофилактики. Разрешено одновременное введение препарата вместе с вакцинами от:

• Дифтерии.
• Коклюша.
• Столбняка.
• Полиомиелита.
• Гепатита В.
• Кори.
• Эпидемического паротита.

Если применяется одновременное введение нескольких препаратов, соблюдается одно правило. Вакцины вводятся отдельными шприцами в различные области тела.

Касательно введения препаратов крови и ее белковых компонентов – вакцину вводят как минимум через три месяца после манипуляции. Если же сначала вводят вакцину – переливание крови разрешено через две недели.

Туберкулиновые пробы можно проводить либо до либо через четыре-шесть недель после вакцинации против краснухи живой прививкой.

Условия хранения вакцины

Прививка сохраняет свои свойства при температурном режиме от плюс двух до восьми градусов по Цельсию. Вакцина хранится и транспортируется в специальных холодильных установках, которые поддерживают оптимальную температуру. Прививку запрещено замораживать, ведь таким образом она теряет иммуногенные свойства. Срок годности прививки – два года. Если она изменила свойства, цвет, появились дополнительные включения – ее утилизируют.

Аналоги вакцины

На сегодня представлено несколько аналогов живой аттенуированной вакцины против краснухи. Они представлены в таблице:

Среди прививок, идентична по составу – Рудивакс, MMRII и Приорикс. Они содержат компоненты против вируса кори и паротита. Прививки взаимозаменяемы согласно НКП. Они одинаково вызывают видоспецифический иммунитет.

Краснуха – опасное заболевание, которое имеет тератогенный эффект. Вирус губительно влияет на плод, вызывая множественные дефекты развития ребенка. Оценивая потенциальные риски и преимущества вакцинации  прививкой против кори, положительных сторон намного больше. Двухкратное введение вакцины обеспечит надежный иммунитет против краснухи.

simptomyinfo.ru

Вакцина — как она делается? | вакцинация

Вакцина - это или мёртвый или ослабленный (аттенуированный) вирус или микроорганизм. Однако отличить ослабленный (аттенуированный) микроорганизм от живого очень трудно! Поэтому от аттенуированных вакцин можно заразиться! И заражаются! Это факт. Просто не ведут такую статистику, скрывают, но каждый участковый врач знает, что таких случаев очень много.

Вот полиомиелитная вакцина как раз, "аттенуированная". И полиомиелит, как вы знаете, не искоренён, потому что на самом деле заражаются вакциноассоциированным полиомиелитом через аттенуированую полиомиелитную вакцину. Дети на материнском молоке полиомиелитом не заражаются. У них свой нормальный иммунитет и без вакцины.

Чем же, интересно, умерщвляют вирусы или бактерии? Сверхтоксическими ядами! До последних скандалов с Тимеросалом главным ядом в вакцинах была ртуть! В вакцине должен быть как минимум один сверхубойный яд, чтобы убить микроорганизм! Но на самом деле употребляются, по принципу, "кашу маслом не испортишь", как минимум несколько сильнейших ядов.

Кроме ртути в последнее время в вакцинах обнаруживается ещё один сверхтоксичный компонент - сквален. Это компонент человеческих экскрементов. Сквален в кале - это как мочевина в моче - токсины выводятся из организма. Так вот с вакциной этот сквален обратно в организм вводится!

Кроме сверхтоксических ядов в вакцинах главный компонент - это яйца, сахар, и раковые клетки! Почему яйца (обычный куриный желток), сахар, и раковые клетки? Представьте себе как делаются вакцины на миллиарды человек. Как на пивном заводе! Сначала надо размножить огромное количество живых вирусов и бактерий! Стоят ряды огромных чанов из нержавеющей стали. Это потом на последней стадии производства их убьют (аттенуируют).

Их может быть сколько угодно, зависит от мощности завода.

В чан наливается питательная среда, на которой вирусы и бактерии размножаются с максимальной скоростью! Производителю же важна продуктивность! Продуктивность определяется питательной средой!

Давно известно, что быстрее всего размножаются вирусы и бактерии на яичных желтках, в сахарном растворе и раковых тканях! То есть раковые ткани от раковых больных с операций и биопсий не выбрасывают в унитаз, а создают им условия (питательные среды) для интенсивного размножения раковых клеток. В раковых клетках содержится фактор, который снимает тормоза с клеточного деления. Поэтому без раковой ткани при производстве вакцин не обойтись. Можно обойтись без ртути, и вместо ртути употребить какой нибудь другой яд. Но без раковой ткани не обойтись! Существуют целые цеха и корпуса по производству раковых тканей. Производительность их огромная и продукт отличный - раковая ткань высочайшего качества!

1. Итак, размножили до максимальной концентрации в чане с сахарным раствором желтка и раковых тканей вирус или бактерию.

2. Теперь надо убить или аттенуировать злокачественную смесь, к которой можно приближаться только в костюме спецзащиты. Это делают, заливая в эти чаны препараты ртути (тимеросала), хлора, или ещё какой-нибудь отравы.

3. Однако даже если все вирусы и бактерии в чане убиты ртутью или ещё чем, - всё равно эта злокачественная смесь хуже чем помои! Даже и сравнивать нельзя! Помои - это нектар богов по сравнению с содержимым вакцинных чанов! Даже если все вирусы или бактерии убиты, если мы уколем в задницу эту смесь, то как минимум будет гнойный абсцесс! Нам же надо ввести эту смесь в новорождённого ребёнка!

Таким образом, необходимо сделать так, чтобы эта злокачественная смесь не вызывала гнойных процессов при введении внутримышечно, под-, или внутрикожно. Для этого эту жуткую смесь надо как-то стерилизовать. С этой целью в эти чаны вливаются десятки различных химических, стерилизующих агентов, то есть тех же токсических веществ, начиная с банального этилового спирта и лизола, которым в армии дезинфицируют сортиры. В ход идут и обычные лекарственные антибиотики. Можете себе представить какое количество жути в этот момент уже находится в этих чанах?

4. Затем содержимое чанов фильтруется и получается прозрачный раствор, который титруется на подопытных морских свинках (определяется доза, которая не убивает маленьких морских свинок наповал). Масса человека позволит ему выдержать дозу, которая убивает всего 50% уколотых морских свинок.

5. Полученный раствор разливается по ампулам и напоследок ампулы ещё облучаются радиоактивным излучением.

Рубрики: Против вакцинацииМетки: вакцина, вирусы, дети, иммунитет, полиомиелит, тимеросал Комментариев нет

Добавить комментарий

antivakcina.org

живая аттенуированная бактерия pasteurella multocida, вакцина на ее основе, способ получения вакцины и применения этой бактерии для получения вакцины для защиты животных или человека - патент РФ 2415926

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Живая аттенуированная бактерия Pasteurella multocida модифицирована внесением мутации в ген Orf-15. Мутация представляет собой инсерцию и/или делецию в гене Orf-15. В результате модификации бактерия не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15, что приводит к ее аттенуации. Раскрыто также использование такой бактерии для создания на ее основе вакцины для защиты человека или животных от инфицирования бактерий Pasteurella multocida или патогенных эффектов инфекции. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

Рисунки к патенту РФ 2415926

Настоящее изобретение относится к живым аттенуированным бактериям видов Pasteurella multocida, к живым аттенуированным вакцинам, содержащим указанные живые аттенуированные бактерии, к применению указанных бактерий для производства указанных вакцин, к способам изготовления указанных вакцин и к диагностическим тестам для выявления указанных бактерий.

Грамотрицательная бактерия Pasteurella multocida известна как возбудитель заболеваний у нескольких видов животных более века. Как известно, Pasteurella multocida, среди прочего, вызывает птичью холеру у домашней птицы, геморрагическую септицемию у крупного рогатого скота и атрофический ринит у свиней. Помимо этого, ее значение как человеческого патогена становится более и более очевидной в последние 60 лет.

Существует только один вид Pasteurella multocida. Подвидов не существует. Тем не менее, можно осуществить подразделение на основе различий в капсулярных антигенах и ЛПС-антигена. Пять групп Pasteurella multocida, А-Е, были определены на основе капсулярных антигенов, и 16 соматических серотипов были определены на основе ЛПС-антигена. На патогенность или вирулентность не влияет группа капсулярного антигена или ЛПС-серотип штаммов. Группа капсулярного антигена просто определяет животное-хозяина для каждого конкретного штамма.

Штаммы, вызывающие птичью холеру, относятся главным образом к группе капсулярного антигена А. Известно два вида заболевания: острая и хроническая птичья холера. Симптомами острой птичьей холеры являются депрессия, взъерошенные перья, лихорадка, анорексия, слизистые выделения и учащенное дыхание. Часто наблюдаются такие повреждения, как петехиальные и экхимотические кровоизлияния, общая пассивная гиперемия и накопление перитонеальной и перикардиальной жидкостей. Симптомы заболевания у хронически инфицированных птиц обычно связаны с локализованными инфекциями. Часто наблюдается набухание бородок, синусов, периорбитальных подкожных тканей, суставов ног или крыльев. Также часто наблюдается экссудативный конъюнктивит и фарингит. Повреждения у хронически инфицированных птиц обычно характеризуются фибринозно-гнойным экссудатом, очаговым некрозом и пролиферацией соединительной ткани.

Штаммы, вызывающие геморрагическую септицемию у крупного рогатого скота и азиатских буйволов, а также у свиней, овец, коз, оленей и верблюдов, относятся главным образом к группе капсулярного антигена В и Е. Геморрагическая септицемия представляет собой острое заболевание, которое характеризуется быстрым течением, отечным набуханием в области головы-горла-грудины, набухшими лимфоузлами с кровоизлияниями и наличием многочисленных субсерозных петехиальных кровоизлияний.

У свиней Pasteurella multocida вызывает атрофический ринит и пневмонию. Указанные синдромы вызываются главным образом штаммами капсулярного типа А и D. Также были описаны случаи острой септицемии, которые были вызваны капсулярным типом В. Клинические признаки, связанные с атрофическим ринитом, включают в себя чихание, выделения из носа, укорочение и подергивание рыла, пневмонию и задержку роста. Пневмония наблюдается преимущественно как вторичная инфекция, увеличивая тяжесть первичных повреждений. Клинические признаки включают в себя сухой непродуктивный кашель, который становится продуктивным, и, в тяжелых случаях, повышение температуры тела.

В принципе, когда дело касается вакцинации против Pasteurella multocida, имеется два подхода к защите против инфекции Pasteurella multocida: вакцинация убитыми вакцинами (бактеринами) и вакцинация живыми аттенуированными вакцинами. Бактерины экономически привлекательны, поскольку производство их стоит недорого. Однако их необходимо инъецировать, они часто вызывают тяжелые тканевые реакции, высокое давление антигенной стимуляции все еще может вызывать вспышки заболевания у вакцинированных бактеринами животных и, что хуже всего, они обеспечивают защиту лишь от гомологичного серотипа. В противоположность этому, вакцинация живой аттенуированной вакциной обеспечивает хорошую перекрестную защиту не только от гомологичных серотипов, но также и от гетерологичных серотипов. Таким образом, указанные вакцины, как представляется, должны быть вакцинами выбора; однако существует два серьезных недостатка, связанных с использованием живых вакцин: во-первых, живые аттенуированные вакцинные штаммы Pasteurella multocida , использующиеся в настоящее время, плохо определены: природа ослабления их поведения неизвестна. Таким образом, всегда существует риск возврата их к вирулентному состоянию. И во-вторых, имели место вспышки заболевания пастереллезом, которые можно было бы приписать использованным живым вакцинным штаммам. Возможной причиной указанных вспышек мог быть возврат использованного вакцинного штамма к вирулентному состоянию или недостаточная степень аттенуации.

Таким образом, очевидно, что существует потребность в аттенуированных вакцинах Pasteurella multocida, которые являются как эффективными, так и безопасными. Указанные вакцины должны обеспечивать защиту от инфекции Pasteurella multocida или от ее эффектов, и в то же время должны вести себя как аттенуированные, без склонности к возврату к вирулентности.

Целью настоящего изобретения является разработка живого аттенуированного штамма Pasteurella multocida, который удовлетворяет указанным требованиям.

К настоящему времени неожиданно было установлено, что новый, до сих пор неизвестный, ген Pasteurella multocida, далее называемый геном Orf-15, может быть опущен без нарушения иммунной реактивности штамма, в то же время, с резким уменьшением вирулентности бактерии. Наличие гена у дикого типа Pasteurella multocida не ограничивается конкретной группой капсулярного антигена или соматическим серотипом. Ген присутствует у штаммов Pasteurella multocida, независимо от группы капсулярного антигена или соматического серотипа: его находят у всех 16 соматических серотипов и у всех пяти групп капсулярного антигена.

Таким образом, ген представляет собой универсальную цель аттенуации у Pasteurella multocida , что впервые позволяет изготавливать безопасные вакцины против заболеваний, связанных с Pasteurella multocida. Указанный подход, таким образом, в равной степени пригоден для изготовления, например, вакцин, защищающих человека от инфекции Pasteurella multocida или ее эффектов, вакцин, защищающих домашнюю птицу от птичьей холеры, вакцин, защищающих свиней от атрофического ринита, и вакцин, защищающих крупный рогатый скот и азиатских буйволов от геморрагической септицемии.

Кроме того, было установлено, что живые аттенуированные штаммы Pasteurella multocida, лишенные гена Orf-15, обеспечивают не только очень хорошую защиту от гомологичного им серотипа, но также и очень хорошую перекрестную защиту от гетерологичных серотипов.

Таким образом, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к живой аттенуированной бактерии Pasteurella multocida , которая не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15. Последовательность новой открытой рамки считывания гена Orf-15 представлена в SEQ ID NO:1, а белок Orf-15, который она кодирует, изображен в SEQ ID NO:2.

Функциональный белок Orf-15, как представляется, является белком Orf-15, способным обеспечивать полную вирулентность, как у Pasteurella multocida дикого типа.

Таким образом, штамм Pasteurella multocida, который является дефектным по меньшей мере в отношении указанной способности, считается не способным экспрессировать функциональный белок Orf-15. Любая мутация в гене Orf-15, такая как инсерционная, заместительная или делеционная мутация, которая приводит к уменьшению вирулентности по сравнению со штаммом Pasteurella multocida дикого типа, рассматривается как входящая в объем настоящего изобретения.

Уменьшение вирулентности штамма для целей настоящего изобретения определяется двумя способами. Одно определение уменьшения вирулентности относится к уровню защиты от летальной инфекции: известно, что инфекция штаммом Pasteurella multocida дикого типа у индеек в контролируемых условиях дает смертность свыше 50% (смотрите, среди прочего, раздел Примеры ). Штамм Pasteurella multocida с уменьшенной вирулентностью из-за мутации гена Orf-15 согласно изобретению представляет собой штамм, которых при тех же условиях дает уровень смертности менее 10%.

Другое определение уменьшения вирулентности относится к уровню и тяжести повреждений после вакцинации по сравнению с сублетальной инфекцией штаммом Pasteurella multocida дикого типа. Таким образом, согласно второму определению уменьшения вирулентности, штамм Pasteurella multocida имеет пониженный уровень вирулентности, если он вызывает уровень повреждений, который меньше 30% уровня повреждений, вызываемых инфекцией штаммом Pasteurella multocida дикого типа.

Таким образом, штамм Pasteurella multocida считается входящим в объем настоящего изобретения, если он имеет, например, мутацию гена Orf-15 или агент, препятствующий экспрессии белка, кодируемого геном Orf-15 (смотрите ниже), которые приводят к уменьшению вирулентности, согласно по меньшей мере одному из двух определений уменьшения вирулентности, приведенных выше.

Указанная мутация может представлять собой инсерцию, делецию, замещение или их комбинацию, при условии, что мутация приводит к неспособности экспрессировать функциональный Orf-15. (Излишне упоминать о том, что молчащая мутация, такая как мутация кодона СТС в СТТ, не влияет на белок Orf-15 и, таким образом, не приводит к неспособности экспрессировать функциональный белок Orf-15. Следовательно, указанная мутация не пригодна для целей настоящего изобретения.

Обычно мутация будет представлять собой инсерцию, замещение или делецию одного или более нуклеотидов. Особенно инсерция или делеция последовательности из числа нуклеотидов, которое не делится на три, приводит к сдвигу рамки считывания, который, в свою очередь, приводит к появлению бессмысленного кода. В результате будет синтезироваться усеченный белок Orf-15, который имеет пониженную функциональность или даже вовсе не имеет функциональности.

Существует множество известных способов внедрения мутации в открытую рамку считывания. Одним возможным способом получения указанных мутаций является использование классических методик, таких как обработка бактерий дикого типа мутагенными агентами, такими как аналоги оснований, обработка ультрафиолетовым светом или температурная обработка. Селекция мутантов Orf-15 будет, однако, представлять собой задачу, требующую достаточно больших затрат времени.

Кроме того, природа мутации, вызванной классическими методиками получения мутаций, будет неизвестна. Это может быть точечной мутацией в гене Orf-15, который в конечном итоге может вернуться к дикому типу. Для того, чтобы избежать указанного небольшого риска, хорошей альтернативой может быть транспозонный мутагенез. Получение мутантов с использованием транспозонного мутагенеза также хорошо известно специалистам. Это представляет собой вид мутации, выполняемой на локализованном участке хромосомы. Таким способом можно получать стабильные, авирулентные, иммуногенные, транспозон-опосредованные мутанты P.multocida. Транспозон-опосредованные мутанты - это мутанты, которые имеют транспозон, вставленный в бактериальный геном. «Транспозон» представляет собой элемент ДНК, который можно вставить в молекулы ДНК путем транспозиции, процесса негомологичной рекомбинации, который не требует обширной гомологичности последовательности ДНК. Транспозоны обычно включают в себя гены, кодирующие ферменты транспозиции, называемые транспозазами, которые отрезают ДНК на конце транспозонов и вставляют транспозоны в ДНК-мишень. Помимо этого, транспозоны обычно содержат гены-маркеры, кодирующие резистентность к антибиотикам, которые можно использовать для отбора мутантов с транспозонными инсерциями. Известные транспозоны включают в себя Tn3, Tn5, TnphoA, Tn7, Tn9, Tn10 и их функциональные фрагменты (Mobile DNA, изд. D.E. Berg и M.N. Howe, ASM Press, 1989). Просто в качестве примера, транспозон Tn10 хорошо известен специалистам и описан, среди прочих, Lee (Lee, M.D., Henk, A.D., Veterinary Microbiology, 50, 1996, 143-1480). Мутант с транспозонной вставкой можно получить стандартными способами, известными специалистам (Mobile DNA, изд. D.E. Berg и M.N. Howe, ASM Press, 1989). Селекция на предмет транспозонных мутаций Orf-15 будет проще и будет отнимать меньше времени благодаря тому, что ПЦР с использованием праймеров, расположенных в 3'-концевой и 5'-концевой части гена Orf-15, будет непосредственно показывать, располагается ли транспозонная вставка в гене Orf-15 или где-либо еще.

Еще более элегантную возможность внедрения мутации в Orf-15, на этот раз на заранее определенном участке, скорее преднамеренно, чем случайно, предлагает технология рекомбинантной ДНК, более конкретно, сайт-специфический мутагенез. Указанная мутация также может представлять собой инсерцию, делецию, замещение одного нуклеотида другим или их комбинацию, с тем единственным условием, что мутировавший ген больше не кодирует функциональный Orf-15. Подобную мутацию можно, например, осуществить путем делеции ряда пар оснований. Даже очень незначительные делеции, такие как делеции единственной пары оснований, приводящие к сдвигу рамки считывания, могут быть достаточны для того, чтобы сделать Orf-15 нефункциональным. Более предпочтительно, если удаляется более длинный отрезок, например, 10, 50 или более пар оснований. Еще более предпочтительно, ген Orf-15 устраняют целиком.

Методики конструирования Orf-15-негативных мутантов посредством сайт-специфического мутагенеза являются хорошо известными стандартными методиками. Они относятся, например, к клонированию гена Orf-15, модификации последовательности гена посредством сайт-специфического мутагенеза, расщеплению рестрикционными ферментами, с последующим религированием или ПЦР-подходами, и к последующему замещению гена Orf-15 дикого типа мутантным геном (аллельный обмен или аллельное замещение). Стандартные методики рекомбинантной ДНК, такие как клонирование гена Orf-15 в плазмиде, расщепление гена рестрикционным ферментом, с последующей обработкой эндонуклеазой, религирование и гомологичная рекомбинация в штамме-хозяине, также хорошо известны специалистам и описаны, среди прочих, в Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Сайт-специфические мутации можно осуществить посредством in vitro сайт-специфического мутагенеза, с использованием набора Transformer® от Clontech. ПЦР-методики широко описаны (Dieffenbac H & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual ISBN-087969 и ISBN 0-087969-447-5).

Наиболее распространенные способы конструирования живой аттенуированной бактерии Pasteurella multocida, которая не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15, основаны, как объяснено выше, на мутациях гена Orf-15. Однако существует альтернативный путь получения живой аттенуированной бактерии Pasteurella multocida, которая не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15. Указанный альтернативный путь относится к взаимодействию с информационной РНК, кодирующей белок Orf-15. Экспрессия белка представляет собой двухэтапный процесс, включающий в себя этап генерации мРНК Orf-15 посредством транскрипции ДНК и последующий этап трансляции указанной мРНК, с получением белка Orf-15. Присутствие определенных типов РНК, таких, например, как Orf-15-специфичная dsРНК, Orf-15-специфичная короткая интерферирующая РНК или Orf-15-специфичная антисмысловая РНК, в бактерии будет создавать помехи для мРНК Orf-15 и, таким образом, блокировать трансляцию мРНК Orf-15 в белок Orf-15 в количестве, сравнимом с таковым в бактериях дикого типа. РНК, на которых основан указанный механизм, также как и механизм как таковой, широко известны как РНКi. Следовательно, присутствие, например, Orf-15-специфичной siРНК, dsРНК или Orf-15-специфичной антисмысловой РНК, будет вызывать тот же эффект, что и мутация гена Orf-15: подобная бактерия не будет способна экспрессировать функциональный белок Orf-15.

Использование антисмысловой РНК для сайленсинга генов, известное вот уже несколько десятилетий, и использование РНКi (например, dsРНК или siРНК), широко применяющееся около пяти лет, представляют собой хорошо разработанные, известные специалистам методики. Обзор по данной теме написан Hannon, G.J., в Nature 418:244-251 (2002) и Deni, A.M. и Hannon, G.J., в Trends in Biochemical Sciences 28: 196-201 (2003). Другие статьи, описывающие использование siРНК для сайленсинга генов, написаны Bertrand, J.R. et al., в B.B.R.C. 296: 1000-1004 (2002) и Sorensen, D.R. et al., в J. Mol. Biol. 327: 761-766 (2003). Использование РНКi для сайленсинга вирусов у млекопитающих было предложено недавно, и, среди прочих, написан обзор Quan-Chu Wang et al. (World J. Gastroenterol. 9: 1657-1661 (2003)).

Вообще говоря, специалист, возможно, отдаст небольшое предпочтение первому подходу, получению мутации гена Orf-15. Это происходит в силу того, что мутация гена, в противоположность любому методу, основанному на интерференции РНК, не привносит никакого дополнительного генетического материала в клетку.

Таким образом, предпочтительная форма указанного варианта осуществления настоящего изобретения относится к живой аттенуированной бактерии, которая не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15 в силу мутации гена Orf-15.

Делеция или инсерция, особенно мутация вне рамки считывания, будет оказывать выраженное действие на функциональность белка Orf-15.

Таким образом, в более предпочтительной форме указанного варианта осуществления настоящего изобретения мутация включает в себя инсерцию и/или делецию. В наиболее предпочтительной форме опускается весь ген Orf-15 или по меньшей мере его кодирующая последовательность.

Ген Orf-15 включает в себя кодирующую последовательность, а также промоторную область и сайт связывания с рибосомами. Промоторная область включает в себя по меньшей мере область, включающую нуклеотиды 22-71 SEQ ID NO:1, в то время как сайт связывания с рибосомами включает в себя нуклеотиды 92-96. Таким образом, излишне упоминать о том, что любая мутация, которая делает неэффективными промотор или сайт связывания с рибосомами, и, таким образом, приводит к уменьшению экспрессии или прекращению экспрессии Orf-15, также входит в объем настоящего изобретения.

Принимая во внимание большой объем вакцин, которые в настоящее время вводят домашним и сельскохозяйственным животным, понятно, что желательным является комбинированное введение нескольких вакцин, хотя бы по причинам меньших затрат на вакцинацию. Таким образом, весьма привлекательным является использование живых аттенуированных бактерий в качестве рекомбинантного носителя для гетерологичных генов, кодирующий антигены, выбранные из других патогенных микроорганизмов или вирусов. Введение подобного рекомбинантного носителя имеет то преимущество, что в одно и то же время приобретается иммунитет против двух или более заболеваний. Живые аттенуированные бактерии согласно изобретению обеспечивают весьма стабильные носители для гетерологичных генов, благодаря своему аттенуированному поведению.

Таким образом, еще более предпочтительная форма осуществления настоящего изобретения относится к живой аттенуированной бактерии согласно изобретению, которая несет гетерологичный ген, кодирующий один или более антигенов, выбранных из группы микроорганизмов или вирусов, патогенных для человека и/или животных.

Использование гена Orf-15 как вставочную область для гетерологичного гена имеет то дополнительное преимущество, что в одно и то же время ген Orf-15 инактивируется, а вновь внедренный гетерологичный ген может экспрессироваться (во взаимодействии с гомологичными бактериальными генами). Таким образом, еще более предпочтительная форма осуществления настоящего изобретения относится к живой аттенуированной бактерии Pasteurella multocida согласно изобретению, которая в качестве отличительного признака имеет гетерологичный ген, инсерцированный в ген, кодирующий Orf-15.

Гетерологичный ген может нести гомологичный промотор или любой другой промотор, который распознается РНК-полимеразой Pasteurella multocida. Нативный промотор Orf-15 также можно использовать. Наиболее просто это можно осуществить делецией кодирующей последовательности Orf-15 и заменой ее на выбранный гетерологичный ген.

Конструирование указанных рекомбинантных носителей можно осуществлять рутинным способом, с использованием стандартных методик молекулярной биологии, как описано выше.

В одной наиболее предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения гетерологичный ген кодирует один или более антигенов, выбранных из группы патогенов свиней, состоящей из вируса репродуктивного респираторного синдрома свиней (PRRS), вируса псевдобешенства, вируса инфлюэнцы свиней, парвовируса свиней, вируса инфекционного гастроэнтерита, ротавируса, цирковируса свиней 1 или 2, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae и Streptococcus suis.

В другой наиболее предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения гетерологичный ген кодирует один или более антигенов, выбранных из группы патогенов крупного рогатого скота, состоящей из вируса герпеса крупного рогатого скота, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, вируса парагриппа типа 3, парамиксовируса крупного рогатого скота, вируса ящура, Pasteurella haemolytica, Staphylococcus aureus , Escherichia coli, Staphylococcus uberis, синцитиального респираторного вируса крупного рогатого скота, Theileria parva , Theileria annulata, Babesia bovis, Babesia bigemina, Babesia major, Trypanosoma species , Anaplasma marginale, Anaplasma centrale или Neospora caninum.

В еще одной наиболее предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения гетерологичный ген кодирует один или более антигенов, выбранных из группы патогенов домашней птицы, состоящей из вируса птичьей оспы, вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного бурсита (Гумборо), вируса болезни Марека, агента анемии цыплят, птичьего реовируса, Mycoplasma gallisepticum, вируса ринотрахеита индеек, Haemophilus paragallinarum (Coryza), поксвируса цыплят, вируса птичьего энцефаломиелита, вируса чумы уток, вируса болезни Ньюкасла, вируса синдрома сбрасывания яиц, вируса инфекционного ларинготрахеита, вируса герпеса индеек, Eimeria species, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma synoviae, Clostridium perfringens, Salmonella species и E.coli.

Другой привлекательной возможностью является инсерция, предпочтительно, в ген Orf-15, гена, кодирующего белок, участвующий в запуске иммунной системы, такой как цитокин, интерлейкин или интерферон, или другого гена, участвующего в регуляции иммунной системы.

Благодаря их неожиданному аттенуированному, но иммуногенному характеру in vivo, бактерии согласно изобретению являются весьма подходящими в качестве основы для живых аттенуированных вакцин.

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к живой аттенуированной вакцине для защиты животных или человека от инфекции Pasteurella multocida или ее патогенных эффектов, которая содержит живые аттенуированные бактерии согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Указанные вакцины включают в себя иммуногенно эффективное количество живой аттенуированной бактерии согласно изобретению. Иммуногенно эффективное означает, что количество живых аттенуированных бактерий, введенных при вакцинации, является достаточным для того, чтобы индуцировать у хозяина эффективный иммунный ответ против вирулентных форм бактерии.

Помимо иммуногенно эффективного количества живой аттенуированной бактерии, описанной выше, вакцина согласно изобретению содержит также фармацевтически приемлемый носитель. Указанный носитель может таким простым как вода, но он также может включать в себя, например, культуральную жидкость, в которой культивировали бактерии. Другим подходящим носителем является, например, раствор соли в физиологической концентрации.

Подходящая доза для введения будет варьировать в зависимости от возраста, массы тела и вакцинируемого животного, способа введения и типа патогена, против которого осуществляют вакцинацию. Примеры, приведенные ниже, дают пример подходящих дозировок. Специалист способен экстраполировать приведенные числа на другие виды животных.

Вакцина может содержать любую дозу бактерий, достаточную для того, чтобы индуцировать эффективный иммунный ответ. Дозы менее 102 живых аттенуированных бактерий не всегда могут быть успешными для достаточной стимуляции иммунной системы, а дозы более 1010 живых аттенуированных бактерий не являются привлекательными с коммерческой точки зрения.

Дозы в пределах от 103 до 109 бактерий обычно являются весьма подходящими дозами.

Необязательно, к вакцине можно добавлять одно или более соединений, обладающих адъювантной активностью. Живая аттенуированная бактерия Pasteurella multocida согласно изобретению не обязательно нуждается в указанном адъюванте для эффективности, но в особенности в случае комбинированных вакцин, содержащих живую аттенуированную бактерию Pasteurella multocida согласно изобретению и антигенный материал от другого патогенного вируса или микроорганизма (смотрите ниже) может быть выгодным добавление адъюванта.

Адъюванты представляют собой неспецифические стимуляторы иммунной системы. Они усиливают иммунный ответ организма-хозяина на вакцину. Известными специалистам адъювантами являются полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин Е, неионогенные блок-полимеры, мурамилдипептиды, ISCOM (иммуностимулирующие комплекты, сравнительно, например, европейский патент ЕР 1099 42), сапонины, минеральное масло, растительное масло и карбопол.

Адъювантами, особенно подходящими для нанесения на слизистые оболочки, являются, например, термолабильный токсин (LT) E.coli или холерный токсин (СТ).

Другими подходящими адъювантами являются, например, гидроксид алюминия, фосфат алюминия или оксид алюминия, масляные эмульсии (например, Bayol F® или Marcol 52®), сапонины или солюбилизат витамина Е. Использование указанных адъювантов является особенно предпочтительным, если добавляются другие, вирусные или субъединичные, вакцины, например, в случае комбинированной вакцины Pasteurella multocida.

Таким образом, в предпочтительной форме указанного варианта осуществления настоящего изобретения живая аттенуированная вакцина согласно изобретению содержит адъювант.

Другие примеры фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей, пригодных для настоящего изобретения, включают стабилизаторы, такие как SPGA, углеводы (например, сорбит, маннит, крахмал, сахарозу, глюкозу, декстран), белки, такие как альбумин или казеин, содержащие белок агенты, такие как сыворотка крупного рогатого скота или снятое молоко, и буферы (например, фосфатный буфер).

Особенно в случае, когда указанные стабилизаторы добавляют к вакцине, вакцина является весьма подходящей для лиофилизации. Лиофилизация имеет то преимущество, что лиофилизированный материал не требует особых условий хранения, таких как хранение при температуре ниже -20 или даже -80 градусов по Цельсию. Таким образом, в более предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения живая аттенуированная вакцина представлена в лиофилизированной форме.

В вакцину, содержащую бактерию согласно изобретению, как описано выше, выгодно включать антигены, полученные из другого микроорганизма или вируса, патогенного для человека или животных, или антитело против указанного антигена.

Существует несколько способов изготовления указанной вакцины. Одним легко осуществимым подходом является смешивание живого аттенуированного штамма Pasteurella multocida согласно изобретению с одним или более антигенов от других патогенов человека или животного и фармацевтически приемлемого носителя. Так, еще более предпочтительная форма осуществления настоящего изобретения относится к живой аттенуированной вакцине согласно изобретению, которая отличается тем, что она дополнительно содержит один или более антигенов, выбранных из группы вирусов и микроорганизмов, патогенных для человека и/или животных.

Предпочтительно, указанные антигены выбирают из группы описанных выше патогенов свиней, крупного рогатого скота или домашней птицы.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к живой аттенуированной бактерии согласно изобретению для применения в вакцине.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению живой аттенуированной бактерии согласно изобретению для производства вакцины для защиты человека или животных от инфекции бактерией Pasteurella multocida или патогенных эффектов указанной инфекции.

Для введения животным или человеку вакцину согласно изобретению можно вводить, помимо прочих способов, интраназально, внутрикожно, подкожно, перорально, распылением или внутримышечно. Для применения у домашней птицы пероральное введение (с питьевой водой), распыление и закапывание в глаза являются особенно подходящими в лишь только простоты указанных путей введения.

Специалисту будет понятно, каким образом вводить вакцину согласно изобретению, поскольку способ не будет значительно отличаться от способов вакцинации существующими в настоящее время вакцинами Pasteurella multocida, особенно аттенуированными вакцинами Pasteurella multocida. Вакцину согласно изобретению, особенно для домашней птицы, следует, предпочтительно, вводить перорально, с питьевой водой, или путем распыления.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам изготовления вакцины согласно изобретению. Указанные способы включают в себя смешивание живой аттенуированной бактерии согласно изобретению и фармацевтически приемлемого носителя.

Принимая во внимание тот факт, что заболевания, вызываемые Pasteurella multocida, в большинстве случаев являются высококонтагиозными, было бы весьма выгодно иметь быстрый и простой инструмент, диагностический тест, для раннего выявления инфекции Pasteurella multocida у животных.

Указанные диагностические тесты должны быть как быстрыми, так и селективными, в том смысле, что они должны обеспечивать раннее выявление, и они должны быть специфичными для Pasteurella multocida и не давать ложноположительных реакций с другими бактериями, независимо от того, принадлежат ли другие бактерии к другим видам Pasteurella или к видам, не относящимся к Pasteurella.

Диагностические тесты на основе наличия или отсутствия антител против Pasteurella multocida, хотя часто и надежные, не являются очень привлекательными, если необходимо раннее выявление бактерий. Это происходит потому, что выработка антител против Pasteurella multocida у инфицированного животного может занять время до двух недель.

Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является разработка диагностических инструментов, подходящих для раннего и специфического выявления инфекции Pasteurella multocida.

В настоящее время неожиданно было установлено, что последовательность гена Orf-15 является уникальной для Pasteurella multocida , и она не присутствует в других членах Pasteurellaceae .

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к тестам на основе РНК или ДНК для выявления Pasteurella multocida.

Диагностический тест для выявления Pasteurella multocida основан, например, на реакции ДНК или РНК, выделенных из обследуемого животного, со специфичными зондами, или он представляет собой, например, (ОТ-)ПЦР-тест на основе последовательности гена Orf-15 или на основе последовательностей нуклеиновых кислот, которые являются комплементарными указанной последовательности. Если молекулы нуклеиновых кислот, специфичные для белков, связанных с Pasteurella multocida согласно изобретению, присутствуют у животного, они будут, например, специфичным образом связываться со специфичными ПЦР-праймерами и впоследствии будут амплифицироваться в ходе реакции (ОТ-)ПЦР. Продукт реакции ПЦР затем может быть легко выявлен в ходе электрофореза ДНК в геле. Реакции (ОТ-)ПЦР хорошо известны специалистам (смотрите ссылку ниже). Молекулы нуклеиновых кислот наиболее просто можно выделить из пораженной ткани или жидкостей организма обследуемого животного. У свиней мазок из носа обеспечивает подходящий материал из пораженной ткани легкого для исследования (ОТ-)ПЦР. Смывы из трахеи или материал из пораженной ткани печени, легкого или сердца являются предпочтительным источником у цыплят. У буйволов, овец и крупного рогатого скота органами выбора являются нос и пораженная ткань легкого.

В стандартных руководствах по ПЦР описаны способы определения длины праймеров для селективных ПЦР-реакций с молекулами нуклеиновых кислот, специфичными для гена Orf-15, согласно изобретению. Часто используют праймеры с последовательностью по меньшей мере в 12 нуклеотидов, но праймеры длиной более 15, предпочтительно, более 18 нуклеотидов являются в определенной степени более селективными. Особенно широко используются праймеры длиной по меньшей мере 20, предпочтительно, по меньшей мере 30 нуклеотидов. Методики ПЦР подробно описаны (Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1995)).

Молекулы нуклеиновых кислот гена Orf-15 или части указанных молекул нуклеиновых кислот, имеющие длину по меньшей мере 12, предпочтительно, 15, более предпочтительно, 18, еще более предпочтительно, 20, 22, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов, в порядке возрастания предпочтительности, или молекулы нуклеиновых кислот, комплементарные им, также являются, таким образом, частью изобретения. Указанные молекулы нуклеиновых кислот можно, например, использовать в качестве праймеров в реакциях (ОТ-)ПЦР с целью увеличения количества нуклеиновой кислоты, кодирующей белки согласно изобретению. Это позволяет быстро амплифицировать специфичные последовательности нуклеотидов для использования в качестве диагностического инструмента, например, для выявления Pasteurella multocida в ткани, как указано выше.

ПЦР-реакции, как и реакции гибридизации, хорошо известны специалистам и, среди прочих, описаны в Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6).

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к диагностическому тесту для выявления ДНК или РНК, связанных с Pasteurella multocida; указанный тест обладает тем отличительным признаком, что он включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность нуклеиновой кислоты, изображенную в SEQ ID NO:1, или молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной указанной последовательности нуклеиновой кислоты, или ее фрагмент, имеющий длину по меньшей мере 12, предпочтительно, по меньшей мере 15, более предпочтительно, по меньшей мере 18 нуклеотидов.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Селекция мутанта Р-1059, спонтанно резистентного к налидиксовой кислоте

Штамм Pasteurella multocida культивировали в бульоне Luria-Bertani (LB) при 37°C в течение ночи. 0,2 мл культуры распределяли по LB агаровым чашкам, содержавшим налидиксовую кислоту 10 мг/мл, и инкубировали при 37°C в течение 48 часов. Отбирали пару резистентных колоний и вновь засевали на LB агаровые чашки, содержавшие налидиксовую кислоту. После еще 48 часов инкубирования одну резистентную колонию отбирали и инокулировали в 10 мл LB бульона, содержавшего 20 мг/мл налидиксовой кислоты, и культивировали в течение ночи. Культуру смешивали с 5 мл глицерина, отбирали аликвоты в 1,8 мл пробирки (по 1 мл на пробирку) и хранили при -70°С. Штамм, резистентный к налидиксовой кислоте, обозначили как Р-1059NR.

Пример 2

Селекция спонтанного thyA-мутанта Р-1059NR

Р-1059NR культивировали в LB бульоне, содержавшем 20 мг/мл налидиксовой кислоты и 10 мг/мл тимина при 37°C в течение ночи. 0,2 мл культуры распределяли по LB агаровым чашкам, содержавшим 20 мг/мл налидиксовой кислоты, 10 мг/мл триметоприма и 50 мг/мл тимина, и инкубировали при 37°C в течение 24-48 часов. Десять колоний переносили на такие же чашки и LB чашки, содержавшие только 20 мг/мл налидиксовой кислоты и 10 мг/мл триметоприма. Колонии, которые росли на чашках первого вида, но не чашках второго вида, представляли собой thyA -мутанты. Один из thyA-мутантов инокулировали в 10 мл LB бульона, содержавшего 20 мг/мл налидиксовой кислоты и 150 мг/мл тимина, и инкубировали при 37°С в течение ночи. Культуру смешивали с 5 мл глицерина, отбирали аликвоты по 1 мл на пробирку и хранили при -70°С. Хранившийся thyA-мутант обозначили как Р9818.

Пример 3

Конструирование Tn вектора pYL1.3

Ген thyAE.coli амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) из геномной ДНК E.coli К-12 с использованием праймеров 5'-AAGCTTGGCTGTCTCAGGTTTGTTCC-3' и 5'-TAGCTTGGCCAGTTTCTATTTCTTCG-3'. ПЦР фрагмент триммировали с использованием Т4 ДНК-полимеразы плюс dCTP. pLOF/Ptt (Herreno, M., de Lorenzo, V. Timmis, K.N., J. Bacteriology, 172, 1990, 6557-6567) расщепляли с использованием Xba I и Sf для удаления гена Ptt, и частично наполняли ферментом Кленова и dCTP. Триммированный ПЦР фрагмент (один конец) лигировали с частично наполненным концом Xba I расщепленной плазмиды. Другой конец ПЦР фрагмента и конец Sfi расщепленной плазмиды затупляли с использованием Т4 ДНК-полимеразы и dNTP. Данная обработанная плазмида с лигированным ПЦР фрагментом самозамыкалась и трансформировалась в SM 10 E.coli. Один трансформат, содержавший плазмиду подходящего размера, очищали, культивировали, отбирали аликвоты и хранили при -70°С. Плазмиду в указанном трансформанте обозначали как pYL1.3.

Пример 4

Конструирование библиотеки Tn мутантов P.multocida

Р9818 культивировали в LB бульоне + 200 мг/мл тимина при 37°С при интенсивном встряхивании в течение приблизительно 48 часов. E.coli SM10, содержавшую pYL1.3, культивировали в LB бульоне в течение ночи. 0,1 мл Р9818 и культуры SM10 E.coli смешивали, засевали на LB + (IPTG 100 мг/мл + 10 мМ MgSO4 + тимин 200 мг/мл) и инкубировали при 37°С в течение ночи. Бактериальный газон смывали с чашек и собирали. 0,1 мл собранной суспензии засевали на чашки LB + налидиксовая кислота 20 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 48 часов. Приблизительно 150 трансконъюгатов собирали и повторно засевали на чашки LB + налидиксовая кислота 20 мг/мл для очистки. Указанные трансконъюгаты культивировали в LB бульоне + налидиксовая кислота 20 мг/мл и хранили при -70°С. Указанные трансконъюгаты повторно засевали одновременно на чашки LB + налидиксовая кислота 20 мг/мл и на чашки LB + налидиксовая кислота 20 мг/мл + ампициллин 25 мг/мл для отбора транспозоновых мутантов. Трансконъюгаты (около 120), которые росли только на чашках LB + налидиксовая кислота 20 мг/мл, рекультивировали в бульоне LB + налидиксовая кислота 20 мг/мл, отбирали аликвоты и хранили при -70°С.

Пример 5

Характеристика (саузерн-блоттинг) транспозоновых мутантов

Ряд 17 Tn мутантов отбирали случайным способом и культивировали в бульоне LB + налидиксовая кислота 20 мг/мл. Геномные ДНК мутантов экстрагировали с использованием набора QIAmp kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, США). ДНК расщепляли с использованием Hind III. Геномную ДНК Р-1059 расщепляли с использованием Hind III, pGP704 (Herreno, M., de Lorenzo, V. Timmis, K.N., J. Bacteriology, 172, 1990, 6557-6567), а также включали pYL1.3 в качестве контролей. Саузерн-блоттинг выполняли стандартными способами (Sambrook, J. et al., изд., Molecular cloning, 2-е издание, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989). Мечение ДНК DIG и детекционный набор (Poche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, США) использовали для пробного мечения и саузерн-блоттинга. pGP704 и ПЦР-амплифицированный ген thyAE.coli метили дигоксигенином и расщепленные геномные ДНК зондировали согласно инструкциям производителя. Результаты показали, что большинство мутантов являлось транспозиционными мутантами с одной инсерцией Tn, а небольшое количество мутантов представляли собой мутанты с интегрированной плазмидой.

Транспозоновые мутанты, полученные описанным способом, проверяли на предмет аттенуированного поведения в ходе стандартных экспериментов на животных.

У тех транспозоновых мутантов, которые оказались аттенуированными, участок инсерции транспозона идентифицировали и секвенировали разорванный ген.

Один из обнаруженных транспозоновых мутантов обозначен как штамм Р15 Pasteurella multocida (кратко, штамм Р-15). Данный мутант имел транспозон, вставленный в Orf-15. именно данный штамм использовали для экспериментов с вакцинацией в следующем примере.

Пример 6

Эксперименты с вакцинацией

В данных экспериментах вакцинацию осуществляли совместно с вакцинацией против болезни Ньюкасла. Это было сделано потому, что вакцинацию вакциной Pasteurella multocida и вакциной против болезни Ньюкасла в ветеринарной практике предпочтительно осуществлять в один и тот же день, даже в один и тот же момент. Преимуществом экспериментального подхода, описанного в настоящем документе, таким образом, является то, что он дополнительно дает представление о поведении вакцины в полевых условиях.

Культуры вакцины РМ

Свежие культуры штамма Р15 Pasteurella multocida в ТРВ использовали для аэрозольной вакцинации. Титр инфективности определяли немедленно после использования. Культуры штамма Р15 Pasteurella multocida, использованные для примирования, включали в себя 1,5×108 КОЕ/мл, а культуры, использованные для активной иммунизации, включали в себя 1,6×109 КОЕ/мл.

Для введения с питьевой водой 500 мл каждой культуры центрифугировали и центрифужный осадок растворяли в 500 мл растворе снятого молока. Культура штамма Р15 Pasteurella multocida, использованная для примирования, включала в себя 1,2×108 КОЕ/мл, а культура, использованная для активной иммунизации, включали в себя 1,3×109 КОЕ/мл.

ND культуры

Культуры вакцины ND содержали 7,3 EID50 (инфекционные дозы для яиц) на дозу для одной птицы.

Индейкам давали воду и корм ad libitum.

Разделение на группы и дозирование

Вакцинация

Смотрите таблицу 1, изображающую схему вакцинации. Всех птиц вакцинировали распылением вакцины ND с использованием аэрозольного баллончика. Вакцинацию штаммом Р15 осуществляли аэрозолем с использованием краскопульта (птицы оставались в аэрозоле в течение 10 минут при отключенной циркуляции воздуха) или с питьевой водой. Для вакцинации с питьевой водой 500 мл свежей культуры центрифугировали и ресуспендировали в 500 мл 2% снятого молока (20 г снятого молока на литр воды). Воду у индеек убирали по меньшей мере за 6 часов до вакцинации. 500 мл вакцинной культуры помещали в колонку с питьевой водой. После вакцинации возобновляли обычное снабжение питьевой водой.

Контрольное заражение Pasteurella multocida

Контрольное заражение осуществляли с помощью внутримышечной инъекции (1,0 мл, в области груди) свежей разбавленной культуры штамма Pasteurella multocida дикого типа серотипа 1, содержавшей 1,5×10 5 КОЕ/мл. Культуру для контрольного заражения изготавливали в ТРВ в виде свежих пятичасовых культур.

Смертность фиксировали ежедневно в течение 7 дней. У павших птиц и всех других птиц через 7 дней после заражения была предпринята попытка выделения P.multocida из печени.

Статистический анализ

Смертность сравнивали с использованием точного критерия Фишера (Statistix для Windows, версия 2.0).

Жирный шрифт: значимая разница с контролями

Результаты и обсуждение

Наблюдения после вакцинации суммированы в таблице 2. После вакцинаций и до контрольного заражения 2 птицы погибли в группе Р15 аэрозоля, 0 в группе Р15 питьевая вода и 0 в контрольной группе. Данная смертность, возможно, была связана с вакцинными штаммами, поскольку в контрольной группе смертности не наблюдалось. Вскрытие после вакцинации показало, что аэрозольный путь индуцировал несколько больше патологии (легкие повреждения воздушных мешков, которые могли быть вызваны вакцинными штаммами), по сравнению с группой питьевой воды.

Наблюдения после контрольного заражения суммированы в таблице 3 и на чертеже. После летального гетерологичного контрольного заражения (1000×LD50) были установлены различные уровни защиты. Аэрозольный путь вакцинации оказался наиболее эффективным путем (100%), затем следует путь вакцинации через питьевую воду (81%).

Из приведенных результатов можно сделать вывод о том, что мутанты Orf-15 Pasteurella multocida согласно изобретению являются весьма подходящим штаммами для применения с качестве живого аттенуированного штамма в вакцинах. Смертность после вакцинации наблюдалась при самой высокой возможной дозе (>109 КОЕ/мл).

Следует помнить о том, что как доза вакцинации, так и доза контрольного заражения, использованные в данном эксперименте, высоки. Дозу вакцины можно сильно уменьшить до уровня, при котором не будет смертности или признаков заболевания. Также можно сильно уменьшить дозу контрольного заражения (1000×LD50).

Заключение

Из приведенных результатов можно сделать вывод, что мутанты Orf-15 Pasteurella multocida согласно изобретению обеспечивают очень хорошую основу для эффективных и безопасных живых аттенуированных вакцин Pasteurella multocida .

Описание фигур

Чертеж.

На чертеже приведено сравнение кумулятивной смертности среди вакцинированных животных (вакцинация через питьевую воду и аэрозольная вакцинация) и среди контрольных животных после контрольного заражения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Живая аттенуированная бактерия Pasteurella multocida, используемая в качестве вакцины, где указанная бактерия не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15 из-за мутации в гене Orf-15, и указанная мутация включает инсерцию и/или делецию.

2. Живая аттенуированная бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия несет гетерологичный ген, кодирующий один или более антигенов, выбранных из группы вирусов и микроорганизмов, патогенных для человека и/или животных.

3. Живая аттенуированная бактерия по п.2, отличающаяся тем, что указанный гетерологичный ген вставлен в ген, кодирующий Orf-15.

4. Живая аттенуированная бактерия по п.2, отличающаяся тем, что указанный один или более антигенов выбраны из группы, состоящей из вируса репродуктивного респираторного синдрома свиней (PRRS), вируса псевдобешенства, вируса инфлюэнцы свиней, парвовируса свиней, вируса инфекционного гастроэнтерита, ротавируса, цирковируса свиней 1 или 2, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae и Streptococcus suis.

5. Живая аттенуированная бактерия по п.3, отличающаяся тем, что указанный один или более антигенов выбраны из группы, состоящей из вируса репродуктивного респираторного синдрома свиней (PRRS), вируса псевдобешенства, вируса инфлюэнцы свиней, парвовируса свиней, вируса инфекционного гастроэнтерита, ротавируса, цирковируса свиней 1 или 2, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae и Streptococcus suis.

6. Живая аттенуированная бактерия по п.2, отличающаяся тем, что указанный один или более антигенов выбраны из группы, состоящей из вируса герпеса крупного рогатого скота, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, вируса парагриппа типа 3, парамиксовируса крупного рогатого скота, вируса ящура, Pasteurella haemolytica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus uberis, Escherichia coli, синцитиального респираторного вируса крупного рогатого скота, Theileria parva, Theileria annulata, Babesia bovis, Babesia bigemina, Babesia major, Trypanosoma species, Anaplasma marginale, Anaplasma centrale или Neospora caninum.

7. Живая аттенуированная бактерия по п.3, отличающаяся тем, что указанный один или более антигенов выбраны из группы, состоящей из вируса герпеса крупного рогатого скота, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, вируса парагриппа типа 3, парамиксовируса крупного рогатого скота, вируса ящура, Pasteurella haemolytica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus uberis, Escherichia coli, синцитиального респираторного вируса крупного рогатого скота, Theileria parva, Theileria annulata, Babesia bovis, Babesia bigemina, Babesia major, Trypanosoma species, Anaplasma marginale, Anaplasma centrale или Neospora caninum.

8. Живая аттенуированная бактерия по п.2, отличающаяся тем, что указанный один или более антигенов выбраны из группы, состоящей из вируса птичьей оспы, вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного бурсита, вируса болезни Марека, агента анемии цыплят, птичьего реовируса, Mycoplasma gallisepticum, вируса ринотрахеита индеек, Haemophilus paragallinarum, поксвируса цыплят, вируса птичьего энцефаломиелита, вируса чумы уток, вируса болезни Ньюкасла, вируса синдрома сбрасывания яиц, вируса инфекционного ларинготрахеита, вируса герпеса индеек, Eimeria species, Omithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma synoviae, Clostridium perfringens, Salmonella species и E.coli.

9. Живая аттенуированная бактерия по п.3, отличающаяся тем, что указанный один или более антигенов выбраны из группы, состоящей из вируса птичьей оспы, вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного бурсита, вируса болезни Марека, агента анемии цыплят, птичьего реовируса, Mycoplasma gallisepticum, вируса ринотрахеита индеек, Haemophilus paragallinarum, поксвируса цыплят, вируса птичьего энцефаломиелита, вируса чумы уток, вируса болезни Ньюкасла, вируса синдрома сбрасывания яиц, вируса инфекционного ларинготрахеита, вируса герпеса индеек, Eimeria species, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma synoviae, Clostridium perfringens, Salmonella species и E.coli.

10. Живая аттенуированная бактерия по п.1 для применения в вакцине.

11. Живая аттенуированная вакцина для защиты животных или человека от инфекции Pasteurella multocida или ее патогенных эффектов, отличающаяся тем, что указанная вакцина включает в себя живую аттенуированную бактерию по пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

12. Живая аттенуированная вакцина по п.11, отличающаяся тем, что включает в себя адъювант.

13. Живая аттенуированная вакцина по п.11 или 12, отличающаяся тем, что находится в лиофилизированной форме.

14. Живая аттенуированная вакцина по п.11, отличающаяся тем, что дополнительно включает в себя один или более антигенов, выбранных из группы вирусов и микроорганизмов, патогенных для человека и/или животных.

15. Применение живой аттенуированной бактерии по пп.1-9 для изготовления вакцины для защиты человека или животных от инфицирования бактерией Pasteurella multocida или патогенных эффектов инфекции.

16. Способ изготовления вакцины по пп.11-14, отличающийся тем, что указанный способ включает в себя смешивание живой аттенуированной бактерии по пп.1-8 и фармацевтически приемлемого носителя.

www.freepatent.ru

Смотрите также

• 
  Вакцина бцж это
• 
  Вакцина от гепатита
• 
  Вакцина от краснухи
• 
  Свиной грипп вакцина
• 
  Менактра вакцина цена
• 
  Вакцина савин грипп
• 
  Гепатит а вакцина
• 
  Панлейкопения вакцина цена
• 
  Ультрикс вакцина цена
• 
  Состав вакцины бцж
• 
  Акт хиб вакцина