Штамм haemophilus parasuis ск-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Вакцины против гемофилезного полисерозита свиней

признаки, диагноз, лечение, профилактика, меры борьбы. | Ветеринарная служба Владимирской области

Гемофилезный полисерозит свиней, Poliserositis haemophilosis (болезнь Глессера) – инфекционная септическая болезнь поросят послеотъемного возраста, характеризуется серозно-фибринозным воспалением перикарда, плевры, брюшины, суставов и негнойным менингоэнцефалитом.

Историческая справка. Впервые болезнь была описана К. Глессером в 1910 году в Германии, а возбудитель был выделен С. Шермером и Р. Эрлихом в 1922 году.

Гемофилезный полисерозит свиней зарегистрирован во всех странах мира, особенно широкое распространение болезнь имеет в свиноводческих хозяйствах с поточной технологией производства свинины и неудовлетворительном микроклимате в помещениях для содержания свиней. Заболевание наносит серьезный экономический ущерб свиноводству.

Этиология. Возбудитель болезни микроорганизм, отнесенный к роду Haemophilus, виду H. Parasuis, представляет собой мелкие (0,5 х 0,2-0,3 мкм) грамотрицательные, короткие,полиморфные палочки. Образуют капсулу. В мазках из патологического материала и из культур они представлены в виде зернистых одиночных палочек и в виде коротких цепочек. На концах палочек имеются интенсивно окрашенные утолщения. Растут в аэробных условиях на питательных средах с добавлением свежей крови животных или дрожжевого экстракта. Хорошо растут на «шоколадном» агаре.

На плотных питательных средах с ростовыми факторами возбудитель формирует бесцветные с ровными краями, равномерно выпуклые колонии диаметром 0,5-0,8мкм. Хорошо растет на агаре с посевом штрихом культуры негемолитического стрептококка, эшерихий и др. Рост наблюдается только вблизи штриха баккормилки (саттелитные колонии). При росте в жидких средах с ростовыми добавками образует умеренную опалесценцию и продуцирует эндотоксин. Гемолизин и уреазу не вырабатывает. Различают 4 серологических варианта H parasuis –A, B, C, D, из которых заболевание чаще взывают сероварианты D и A. Патогенен для поросят и морских свинок при внутрибрюшинном, интратрахеальном, интраназальном заражении. Возбудитель чувствителен к антибиотикам и другим антибактериальным препаратам. Растворы дезинфицирующих средств (гидроксид натрия, формальдегид, хлорсодержащие препараты) действуют на микробы губительно.

Эпизоотологические данные. В естественных условиях полисерозит регистрируется, как правило, среди поросят, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов внешней среды (отъем от свиноматок в раннем возрасте, транспортировка, переохлаждение или перегревание, неудовлетворительные параметры микроклимата помещений и др.).

Полисерозитом заболевают поросята через 8-15 дней, после отъема от свиноматок, однако в крупных свиноводческих хозяйствах возможны случаи заболевания поросят-сосунов в возрасте до 25 дней. Источником возбудителя инфекции являются взрослые свиньи -бактерионосители, особенно свиноматки первых опоросов, а также больные и переболевшие поросята.

Заражение происходит алиментарно и аэрогенно, через слизистые оболочки носоглотки и верхних дыхательных путей.

Возникновению, распространению и тяжелому протеканию заболевания способствует: гипогаммоглобулинемия, ранний отъем поросят от свиноматок, неудовлетворительный микроклимат в помещениях для содержания животных, перегруппировка животных внутри хозяйства и в корпусах комплексов, факторы влияющие неудовлетворительно на резистентность организма.

Для гемофилезного полисерозита свиней характерно быстрое нарастание количества заболевших и павших поросят с признаками одновременного поражения серозных оболочек брюшной и грудной полостей (перитонит, перикардит, плеврит).

Заболеваемость при первичной вспышке гемофилезного полисерозита может достигать 70 % и более животных, летальность может доходить до 50%.

Патогенез. На сегодняшний день недостаточно изучен. Считается, что проникая через слизистые оболочки носоглотки возбудитель проникает в кровь и с нею заносится на серозные оболочки, обладая выраженным тропизмом интенсивно размножается, вызывая в них продуктивное воспаление с обильным выпотом серозного экссудата.

Под влиянием образующихся в экссудате протеаз микроб разрушается, при разрушении микроба из него выделяются эндотоксины, которые приводят к усугублению патологических процессов в организме свиней. В последствие в экссудате появляются пленки фибрина и при выздоровлении (рассасывания экссудата) у переболевших животных образуются спайки в области эпикарда, когда эпикард имеет спайки с околосердечной сумкой, между петлями кишечника, межреберной и легочной плеврой.

Клинические признаки. Инкубационный период при гемофилезном полисерозите свиней составляет от нескольких часов до суток.

Полисерозит у свиней может протекать остро, подостро и хронически.

При остром течение заболевание начинается с подъема температуры тела до 40,5-41,5° С. Больные свиньи начинают передвигаться осторожно, отказываются от корма, щетина на спине становится взъерошенной, при пальпации появляется болезненность брюшной стенки. При проведении клинического исследования у свиней отмечаем кашель, чихание, нередко рвоту. Сердечный толчок прощупывает с трудом, нарастает сердечная недостаточность. Появляется синюшность ушных раковин и нижней стенки живота, внутренней поверхности бедер. Больные животные погибают через 24-38 часов после начала заболевания. В зависимости от резистентности заболевшего животного (уровня гамма — глобулинов в крови) полисерозит может переходить в подострое и хроническое течение.

При подостром и хроническом течении заболевания больные животные становятся малоподвижными, быстро худеют и через 10-15 дней погибают. Лишь некоторые начинают поправляться, но из-за образования спаек петель кишечника, сердечной сорочки с сердцем у них часто появляются приступы удушья, запоры, и животные погибают в более поздние сроки.

Патологоанатомические изменения. У поросят при остром течении полисерозита обнаруживают в полостях сердечной сорочки, грудной и брюшной — большое количество от 0,5- 1 литра и более мутноватой жидкости с хлопьями и нитями фибрина, гиперемию брюшины и плевры.

При подостром и хроническом течении жидкости в полостях немного, но имеются отложения пленок фибрина на сердце, плевре и кишечника. Петли кишечника соединены между собой фибринозными пленками, а сердечная сорочка срастается с сердцем. У многих павших поросят обнаруживают признаки катаральной пневмонии и поражения суставов.

Диагноз. Диагноз на гемофилезный полисерозит свиней основан на анализе эпизоотологических, клинических данных, патологоанатомических изменений и результатов бактериологического исследования.

Прогрессирующее увеличение количества больных полисерозитом поросят послеотъемного возраста – служит основанием ветспециалистам для подозрения на гемофилезный полисерозит. В ветлабораторию направляют экссудат из перитонеальной, плевральной и перикардиальной полостей. Набранный стерильным шприцем или пипеткой экссудат помещают в одну пробирку или флакон и туда же вносят соскоб с пораженного перикарда, сделанный стерильным скальпелем. В ветеринарной лаборатории исследуют мазки из материала и делают высев на кровяной МПА в бактериологических чашках. После посева на поверхность кровяного МПА штрихом, крестообразно по всему периметру чашки делают высев культуры негемолитического штамма белого стафилоккка или эшерихий (баккормилка — источник V-фактора роста). Посев инкубируют при 37-38°С 24 часа. Культуры не обладающие геммолитическими свойствами, не растут на сывороточном МПА, но формируют колонии на «шоколадном» агаре, а также на сывороточном МПА вблизи штриха баккормилки относят к виду H. parasuis.

Патогенность выделенной культуры определяют внутрибрюшинным заражением морских свинок живой массой по 300-350г. При выделении патогенной для морских свинок культуры H. Parasuis, диагноз на полисерозит считают установленным.

Дифференциальный диагноз. Гемофилезный полисерозит необходимо дифференцировать от микоплазменного полисерозита, пастерелеза, стрептококковой инфекции, сальмонеллеза и серозитов, вызываемых эшерихиями, кокковой и другой микрофлорой, проведением бактериологического исследования. Кроме того, полисерозиты, вызываемые другой микрофлорой, проявляются спорадически.

Иммунитет.

В процессе жизни у свиней формируется носительство гемофилезных бактерий с образованием иммунитета (нестерильный иммунитет). В неблагополучном свинарнике свиноматки – бактерионосители с молозивом передают выработанные ими антитела поросятам, у которых в течение 45 дней сохраняется колостральный иммунитет. Для специфической профилактики гемофилезного полисерозита во многих странах, в т.ч. и России применяют инактивированную вакцину.

Лечение. Для лечения больных гемофилезным полисерозитом поросят применяют любые имеющиеся в наличие антибактериальные препараты (антибиотики, сульфаниламидные и нитрофурановые препараты), применяя которые ветспециалистам удается спасти часть заболевших животных.

Однако вылеченные поросята, у которых остались спайки петель кишечника и перикарда с сердечной мышцей, остаются в дальнейшем тяжело больными, отставая от других поросят в росте и развитии. Поэтому владельцы животных считают, что заниматься лечением таких поросят экономически не выгодно и поэтому сдают их на санитарную бойню.

Профилактика. Профилактика гемофилезного полисерозита строится на:

• предупреждении заноса инфекции в хозяйство;
• на строгом соблюдении технологии получения, кормления, выращивания поросят и отъема их от свиноматок;
• выбраковка свиноматок в пометах, которых обнаруживаются больные перитонитом и перикардитом поросята;
• систематическое проведение дезинфекции помещений и воздуха в свинарниках;
• поддержание зоогигиенических параметров микроклимата в помещениях свинарника.

Учитывая, что гемофилезным полисерозитом заболевают в первую очередь поросята, страдающие гипогаммаглобинемией, вследствие недостаточного потребления в первые дни жизни молозива, обслуживающему персоналу необходимо после рождения поросят, подсаживать их под свиноматку и распределять их так, чтобы каждый новорожденный поросенок мог получить свою порцию молозива.

При такой организации кормления все поросята помета к 3-дневному возрасту будут иметь необходимое количество гамма глобулинов, что обеспечить необходимую защиту от возбудителя.

Меры борьбы. В неблагополучных по полисерозиту хозяйствах принимают меры, направленные на своевременное уничтожение возбудителя болезни в организме свиноматок. С этой целью всем свиноматкам с кормом или водой дают антибактериальные препараты в соответствии с наставлениями по их применению. Скармливание антибактериальных препаратов поросятам проводят в течение 3-х дней, перед тем как их отнять от кормящей их свиноматки. В хозяйстве проводится вакцинация супоросных свиноматок. В цехах опоросов организуют прием, обсушивание и одновременно подкормку поросят под свиноматкой.

Подобная технология вскармливания новорожденных поросят позволяет своевременно обеспечить их колостральными антителами и предохраняет их от заражения.

Свиноматок и полученных от них поросят в 55-дневном возрасте вакцинируют гидроокисьалюминевой формолвакциной, согласно наставления по применению вакцины.

vetvo.ru

инфекционные болезни свиней

Сверхострое течение наблюдается при первичном возникновении за­болевания в стаде. При этом температура тела обычно повышается дс 41-42°С, отмечается отказ от корма, угнетение, тяжелое дыхание с хри­пами. Появляется цианоз кожи ушей, пятачка, брюшных и грудных сте­нок. Из носовых отверстий может вытекать пенистая кровянистая жид­кость, а иногда и кровь. Больные животные часто принимают позу сидя­чей собаки. Смерть, как правило, наступает в течение 6-24 часов.

Острое течение характеризуется в целом такими же клиническими признаками, что и сверхострое, однако прогрессируют они медленнее. При этом признаки септицемии слабо выражены, а преобладают явлен* пневмонии с лихорадкой постоянного типа; дыхание учащенное, хрш лое, характерен болезненный кашель, температура тела держится на уров­не 40,5-41,0°С. смерть наступает в течение двух-пяти дней.

Подострое течение характеризуется ремитирующей лихорадкой и плохим аппетитом, в следствии чего пораженные животные начинают отставать в росте. Длительность болезни составляет 6-15 дней.

Хроническое течение характеризуется кашлем и кратковременным повышением температуры тела. Животные начинают сильно худеть и зна­чительно отставать в росте.

Как осложнения, при гемофилезной плевропневмонии, могут встре­чаться артриты, перикардиты, абсцессы в мышечной ткани и др. призна­ки (71, 69).

Патоло го анатомические изменения. При гемофилезной плевроп­невмонии патологическая картина во многом зависит от формы течения заболевания, однако основные изменения обнаруживают в легких, ле­гочной плевре и региональных лимфатических узлах.

При сверхостром течении пятачок, губы и другие части головы заг­рязнены кровью, кожа подгрудка, подчелюстного пространства, рыла, ушей, а иногда нижней стенки живота и промежностей имеет багрово-синий цвет. При надавливании на грудную стенку происходит выделе­ние кровянистой жидкости из носовых отверстий. При вскрытии в тра­хее и крупных бронхах обнаруживается пенистая жидкость красновато­го цвета, часто с примесью несвернувшийся крови (86, 76). В грудной полости также содержится кровянистая жидкость. Легкие увеличенные, уплотненные, темно-красного цвета. В большинстве случаев поражает­ся одно легкое (оба легких поражаются приблизительно в 30-40% случа­ев). Бронхиальные, средостенные и шейные поверхностные лимфатичес­кие узлы увеличены, серовато-розового цвета и гиперемированы, желу­док заполнен кормовыми массами, печень кровенаполкена.

При остром течении наблюдается цианоз кожи по всей нижней стен­ке живота, распространяющийся на промежность, конечности и кожу хво­ста. В грудной полости также содержится кровяная жидкость с хло­пьями фибрина. Плевра блестящая, гладкая, влажная, сине-красного цвета. Изменения в легких аналогичны таковым при сверхостром течении. Ха­рактерным является меньшая выраженность экссудативных процессов па фоне преобладающего серозно-фибринозного воспаления плевры, при этом пленки фибрина могут достигать 1-3 см.

При подостром течении наблюдаются сращения соединительной тка­ни между плеврой и наружным листком перикарда, легким и диафраг­мой, соседними долями легких. При этом пораженные доли легких уве- -иичены, бугристые, плотные, неравномерно окрашены. У большинства трупов в легких также обнаруживаются очаги некроза, состоящие из ка-юозной массы коричневого или грязно-бурого цвета. Желудок обычно пустой или содержит до 50 мм желтоватой слизистой жидкости.

Хроническое течение характеризуется очагами уплотнения в легоч­ной ткани, окруженными соединительной тканью. При разрезе из них выдавливается серовато-желтая густая некротическая масса.

Гистологически, при сверхостром течении выявляются изменения ха­рактерные для геморрагического отека, при остром течении - характер­ные для геморрагической фибринозной пневмонии. При подостром и хро­ническом течении эти изменения менее выражены (71, 86, 52).

Диагностика. Диагноз на гемофилезную плевропневмонию свиней ставят на основании анализа эпизоотологических данных, результатов клинических, патологоанатомических и лабораторных исследований, со­гласно с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике ге-чофилезов свиней», утвержденными ГУВ МСХ СССР 2.11.1985 года.

При подозрении на данную инфекцию в ветеринарную лабораторию направляют кусочки пораженных легких размером 5x5 см, средостен­ные и бронхиальные лимфатические узлы. Материал берут от двух-трех свежих трупов, помещают в стерильную стеклянную посуду и в термос со льдом. В лаборатории проводят микроскопию мазков-отпечатков из легких? и лимфатических узлов, выделяют и идентифицируют культуру, опреде­ляют ее патогенность. Также применяют серологическую диагностику i использованием РА, РНГА, РСК, ИФА и др.

Лечение, профилактика и меры борьбы. Для лечения гемофилез ной плевропневмонии применяют антибиотики. Наибольшую активносп на возбудителя оказывают ампициллин, левомицетин, окситетрациклин, рафампицин, цефалорид, колистин; меньшей активностью обладает пе­нициллин и эритромицин. Однако, лечебные мероприятия антибакте­риальными препаратами не всегда дают хороший эффект, поэтому перед применением необходимо определять чувствительность их к возбудите лю выделенному в конкретном хозяйстве. В целом, лечебные мероприя­тия дают положительный результат лишь на ранних стадиях болезни, кроме того, проводить их в условиях крупных свиноводческих комплек­сов достаточно сложно. В этой связи, наиболее приемлемым вариантом является применение кормовых антибиотиков всему восприимчивому поголовью, из которых можно рекомендовать хлортеграциклин -40 г/т, тилозина тартрат - 100 г/т, окситетрациклин - 98 г/т, с параллельным введением антимикробных препаратов больным животным (71).

В качестве профилактики необходимо не допускать заноса инфек­ции в благополучное хозяйство. Так при получении новых животных не­обходимо иметь в виду, что в стадах, где возбудитель циркулирует дли­тельное время, характерные клинические признаки заболевания могут не проявляться. Поэтому, все вновь поступившее поголовье должно под­вергаться карантину с систематическим клиническим осмотром и тер­мометрией. При подозрении ни инфекцию диагноз нужно уточнять ла-бораторно.

Важным фактором профилактики гемофилезной плевропневмонии является исключение стрессовых ситуаций, которыми как правило со­провождается процесс отъема поросят от свиноматок, поскольку именно на этот период происходит снижение колострального иммунитега и от­мечаются вспышки заболевания. Недопустимо перегружать помещения для доращивания, размещать поросят после отъема в холодных и сырых местах.

При возникновении в хозяйстве плевропневмонии необходимо орга­низовать клинический осмотр всех животных с выборочной термомет­рией. Поросят с выраженными клиническими признаками убивают на санитарной бойне, пораженные легкие утилизируют. Подозрительных по заболеванию изолируют и лечат. Помещения тщательно дезинфициру­ют.

Большую роль в профилактике гемофилезной плевропневмонии иг­рает специфическая иммунопрофилактика. Наибольшее распростране­ние получила иммунизация инактивированными вакцинами. Предпоч­тительнее включать в состав вакцин штаммы возбудителя преобладаю­щие в конкретном регионе или хозяйстве. В частности можно рекомен­довать следующую схему вакцинации: однократно свиноматок за 20-25 дней до опороса и трехкратно молодняк в возрасте 35-40, 45-50 и 110-120 дней. В неблагополучных хозяйствах также необходимо прививать и весь ремонтный молодняк.

В настоящее время, для профилактики данного заболевания выпус­кается «Вакцина против гемофилезной плевропневмонии свиней эмуль­гированная».

ГЕМОФИЛЕЗНЫЙ ПОЛИСЕРОЗИТ СВИНЕЙ

Гемофилезпый полисерозит свиней (болезнь Глесснера) ~ Инфек­ционное септическое заболевание поросят послеотъемного периода, ха­рактеризующееся серозно-фибринозным воспалением перикарда, плев­ры, брюшины, суставов и негнойным менингоэнцефалитом.

Возбудитель - H.parasuis, представляет собой мелкие 0,5x0,2-0,3 по­лиморфные грамотрицательные не образующие спор палочки. Вирулен­тные штаммы образуют капсулу. В мазках H.parasuis располагаются в виде зернистых палочек и в виде коротких цепочек. Растут в аэробных условиях на питательных средах с добавлением свежей крови животных или дрожжевого экстракта, а также на шоколадном агаре (71, 69).

Различают четыре серологических варианта H.parasuis - А, В, С, D, но наиболее распространены сероварианты D и А (70).

Эпизоотология. Гемофилезный полисерозит свиней распространен повсеместно. Главным образом, вспышки заболевания наблюдаются на крупных свиноводческих комплексах с промышленной технологией вы­ращивания и откорма свиней. Источником возбудителя служат больные и переболевшие поросята, а также свиноматки-бактерионосители. Как правило, заболевание возникает среди поросят, подвергнутых воздей-ствию неблагоприятных факторов, таких как отъём от матери в раннем возрасте, транспортировка, переохлаждение, перегруппировка и т.п. Обычно вспышка болезни наступает через 8-15 дней после отъёма, одна­ко иногда заболевание может встречаться и в более раннем возрасте.

Заражение гемофилезным полисерозитом, в основном, происходит аэрогенно. Важную роль в возникновении болезни играет иммунологи­ческий фон у поросят. Часто вспышки заболевания обуславливаются за­возом новых животных. Данное заболевание встречается только у сви­ней, регистрируется круглый год, но обострения обычно отмечаются в холодный период (71, 69).

Патогенез. H.parasuis обитает на слизистых оболочках верхних ды­хательных путей. При снижении резистентности организма возбудитель проникает в кровь и разносится по органам, задерживаясь на серозных оболочках - плевре, перикарде, брюшине. H.parasuis может размножать­ся в синовии суставов, а также преодолевать гематоэнцефалитарный ба­рьер и поражать головной мозг.

Накапливаясь в серозных оболочках возбудитель выделяет токсины, обуславливающие повышение температуры тела. Развивается воспале­ние брюшины, перикарда и плевры.

Существенную роль в возникновении гемофилезного полисерозита играет предшествующее переболевание вирусными или другими инфек­ционными болезнями, а также различные факторы, снижающие общую резистентность организма. Часто болезнь Глесснера протекает в виде сме­шанной инфекции с энзоотической пневмонией и другими микоплазмо-зами(71).

Клиника. Инкубационный период при гемофилсзном полисерозите может составлять от нескольких часов до пяти-семи суток. В основном наблюдается острое или подострое течение болезни.

Острое течение характеризуется повышением температуры тела до 40,5-41,5°С; затрудненным, учащенным и болезненным дыханием; мо­гут отмечаться приступы кашля. По мере накопления экссудата в перито-ниальной и перикардиальной полостях возрастает напряженность и бо­лезненность брюшной стенки, сердечный толчок прощупывается с тру­дом. Иногда может отмечаться рвота. Животные начинают принимать позы снижающие давление на грудную и брюшную стенки. Далее возни­кают отеки в области ног, ушей, морды и брюшины. На коже могут встре­чаться кровоизлияния. Смерть наступает через 24-72 часа после появле-ния первых клинических признаков. Иногда острое течение болезни мо­жет переходить в подострое с последующим выздоровлением, однако такие животные сильно отстают в росте и в конечном итоге, как правило,

погибают.

Подострое течение характеризуются более медленным нарас­танием клинических признаков, при этом симптомы плеврита, пе­рикардита и перитонита выражены не так ярко. Вначале отмеча­ется повышение температуры тела до 40,5-41,0°С. Через три-пять суток, у некоторых поросят могут развиваться артриты, особенно поражаются коленные, скакательные и карпальные суставы. На суставах появляется отечность, при пальпации ощущается болез­ненность, кожа гиперемирована, в результате этого животные ча­сто хромают или вовсе не способны передвигаться. У некоторых поросят отмечаются признаки поражения центральной нервной си­стемы, проявляющиеся в виде эпилептических припадок, плава­тельных движений конечностями, потерей зрения. При этом жи­вотные худеют, шерстяной покров становится тусклым и взъеро­шенным. В большинстве случаев, через несколько дней наступа­ет выздоровление, но часть поросят погибает примерно через чс-тыре-восемь суток после появления клинической картины болез­ни.

В целом, характерной особенностью гемофилезного полисеро­зита является быстрое нарастание числа заболевших и павших по­росят (71, 69).

Патол ого анатомические изменения. При остром течении болезни павшие поросята обычно сохраняют хорошую упитанность, тогда как при подостром течении наблюдается истощение.

Во время вскрытия поросят с острым течением инфекции, в полос­тях сердечной сорочки, а также в грудной и брюшной полостях обнару­живают большое количество мутноватой жидкости с хлопьями фибрина. Кроме того, наблюдается серозно-фибринозное воспаление плевры, брю­шины и перикарда с кровоизлияниями.

При вскрытии поросят павших с признаками подострого течения, жидкости в полостях обнаруживают немного, однако у них наблюдают значительное отложение пленок фибрина на сердце, плевре и кишечни­ке. Петли кишечника часто соединены фибринозными пленками, а сер­дечная сорочка срастается с сердцем. Могут встречаться признаки ката­ральной пневмонии и поражения суставов. При гистологическом исследовании изменения находят в серозных оболочках: перикарде, эпикарде, легочной и костальной плевре, брюши­не и сальнике (71, 69).

Диагностика. Диагноза на гемофилезную плевропневмонию свиней ставят на основании эпизоотологических, клинических патологоанато-мических данных и результатов лабораторных исследований.

При подозрении на данное заболевание в ветеринарную лаборато­рию направляют экссудат из перитониальной, плевральной и перикар-диальной полостей, который набирают стерильным шприцом в стериль­ную пробирку или флакон, туда же помещают соскоб с пораженного пе­рикарда сделанный стерильным скальпелем. При наличии признаков по­ражения центральной нервной системы в лабораторию также направля­ют мозговую ткань и содержание мозговых желудочков. Из пораженных суставов набирают синовиальную жидкость. Взятый патологический ма­териал помещают в термос со льдом и отправляют в лабораторию. Про­бы необходимо брать не позднее четырех-шести часов после смерти, пред­почтительнее от животного погибшего с признаками острого течения болезни и не подвергнутому лечению антибиотиками.

В лаборатории проводят бактериологические исследования: изу­чают мазки, делают посевы на кровяной МПА с баккормилкой. Патоген-ность определяют внутрибрюшинным заражением морских свинок. Це­лесообразно проводить серологическую диагностику.

Болезнь Глесснера необходимо дифференцировать от миколлазмо-зов (протекают менее остро, часто без повышения температуры тела, с охватом не более 5-6% восприимчивого поголовья), стрептококковой ин­фекции и пастереллеза.

Лечение, профилактика и меры борьбы. Лечение гемофилезного полисерозита эффективно только в начальной стадии развития болезни. Это связано с тем, что после развития воспалительного процесса в пери­карде, брюшине и плевре вылечить животное очень сложно, поскольку между этими органами образуются фиброзные спайки, в результате чего нарушается функция сердца и кишечника, поросята начинают сильно отставать в росте.

На ранних стадиях болезни можно рекомендовать антибиотикотера-пию. Установлено, что H.parasuis чувствителен к пенициллину, эритро­мицину, тетрациклину и левомицетину. В тоже время многие штаммы возбудителя обладают достаточной устойчивостью к стрептомицину и мономицину (32). В профилактике гемофилезного полисерозита на первый план высту­пает строгое соблюдение ветеринарно-санитарных требований, начиная с периода супоросости свиноматок и особенно во время агьема поросят, а также при их доращивании. Так, при отъеме необходимо всячески избегать стрессовых ситуаций, с которыми неизбежно сопряжены резкая смена об­становки и рациона. В неблагополучных хозяйствах необходимо проводить ежедневный клинический осмотр поголовья, больных и подозрительных в заболевании поросят - изолировать и лечить. Свиноматок в помете кото­рых обнаруживаются больные поросята нужно выбраковывать. Также сле­дует строго соблюдать режим дезинфекции (71, 69).

В профилактических целях показано применение сульфаниламидных препаратов и антибиотиков. Сульфаниламиды следует давать с кормом из расчета 30 мг/кг живой массы два раза в день, в течение трех-пяти дней. Возможна их дача с питьевой водой из расчета 100 мг/л.

Важным аспектом борьбы с гемофилезным полисерозитом является вакцинопрофилактика. В крупных свиноводческих комплексах промыш­ленного типа с ранним отъемом поросят в 26-дневном возрасте, можно рекомендовать двукратную иммунизацию свиноматок за 24-26 и 16-18 дней до опороса с целью создания колострального иммунитета, после чего двукратно иммунизировать родившихся поросят, первый раз в 17-18-дневном возрасте и повторно в 24-26-дневном возрасте инактивиро-нанной вакциной. Хорошим профилактическим и лечебным эффектом обладает обработка поросят, с целью создания у них пассивного имму­нитета, гипериммунной сывороткой (71, 69, 72).

В дастоящее время для борьбы с болезнью Глесснера разработана и выпускается «Вакцина против гемофилезного полисерозита свиней» (Ви­тебская биофабрика, Белорусь)

ЭНЗООТИЧЕСКАЯ ПНЕВМОНИЯ СВИНЕЙ

Энзоотическая пневмония свиней (микоплазмозная пневмония по­росят) - преимущественно хроническое заболевание, катаральной брон­хопневмонией, кашлем, ремитирующей лихорадкой, отставанием в рос­те и развитии.

Возбудитель - микроорганизм класса Mollucutes, семейства Mycoplasmataceae, рода Mycoplasma - M.hyopneumoniae. Основным отличием всех микоплазм от бактерий является то, что вместо клеточной стенки они имеют цитоплазматическую мембрану. M.hyopneumoniae мор­фологически может обнаруживаться в мазках в виде кокковидных, звез­дчатых нитевидных и др. форм.

Эпизоотология. Энзоотическая пневмония свиней распростра­нена повсеместно, болеют только свиньи, особенно молодняк. Ис­точником возбудителя служат больные и переболевшие животные, которые выделяют его в окружающую среду при чихании и кашле, а также с молоком и влагалищными секретами. Подсосные поросята могут инфицироваться от своих матерей. Основной путь заражения -воздушно-капельныЙ, при этом заболеваемость поголовья свиней может достигать 40% (25, 16).

Важным фактором распространения микоплазмозной пневмонии яв­ляются перегруппировки животных и особенно послеотъемное смеши­вание поросят, которое часто приводит к энзоотическим вспышкам и обуславливает стационарное неблагополучие хозяйств. Распростране­нию и тяжести течения болезни способствуют такие факторы как высо­кая скученность при содержании животных, особенно в плохо провет­риваемых, сырых и холодных помещениях с цементными полами; не­полноценное кормление; наличие сопутствующих заболеваний (16).

Патогенез. Попав в организм восприимчивого животного, микоплаз-мы в течение двух недель размножаются на слизистой оболочке трахеи, бронхов и бронхиол. При этом значительно повреждаются клетки респи­раторного эпителия. Через три недели после заражения микоплазмы на­чинают проникать.в более глубокие слои дыхательных путей и альвео­лы. В это время начинают проявляться первые клинические признаки болезни. Одновременно полиморфно-ядерные лимфоциты выходят че­рез стенку кровеносных сосудов в просвет альвеол, бронхиол и окружа­ющие ткани. В дальнейшем активизируются иммунная система, проис­ходит клеточно-пролиферативная реакция, что приводит к значительно­му утолщению стенок альвеол. Наиболее выраженные изменения проис­ходят к четвертой недели болезни. Однако, если нет осложнений вторич­ной микрофлорой, патологический процесс приостанавливается и начи­нается выздоровление. В том случае, если происходит наслоение других инфекций, клинические симптомы становятся более выраженными и болезнь протекает более остро (25). Клиника. Инкубационный период при энзоотической пневмонии в среднем составляет 10-16 дней. Основным симптомом является сухой кашель, который становится заметным через 18-22 дня после заражения, после чего постепенно усиливается. Чаще клинические признаки прояв­ляются к десятинедельному возрасту. При этом кашель, как правило, уси­ливается в утренние часы во время кормления, а также при перемещении животных. Тем не менее аппетит сохраняется, но поросята начинают от­ставать в росте. Кожа становится бледной, щетина взъерошена, возмож­на болезненность в межреберных пространствах и лихорадка.

При наслоении вторичных бактериальных инфекций респираторные расстройства у пораженных животных усиливаются. Дыхание становит­ся затрудненным, появляется цианоз кожи и слизистых оболочек, сни­жается аппетит, отмечается истощение. Температура тела у отдельных животных может повышаться. В этот период часть поросят погибает, дру­гая часть выздоравливает, однако существенно отстает в росте (25, 15).

Патологоанатом и ческие изменения. Патологоанатомическая кар­тина при микоплазмозной пневмонии свиней во многом зависит от ста­дии и продолжительности болезни, а также наличия осложнений. Наи­более характерные изменения наблюдаются в легких. Так, в верхушеч­ных и сердечных долях отмечаются измененные участки различного раз­мера, серо-красного цвета, плотной консистенции, которые, как прави­ло, четко ограничены от здоровой ткани и имеют клинообразную форму. На разрезе легких из бронхов при надавливании выделяется мутная жид­кость красноватого цвета. Бронхиальные и медиастинальные лимфати­ческие узлы увеличены.

Исследования показывают, что патологические изменения у павших и вынужденно убитых животных наблюдаются в 40% случаев в левых верхушечных долях легких, в сердечных долях - в 70% случаев, в пра­вых долях - в 50% случаев (25, 84).

Гистологические изменения также связаны с продолжительностью течения болезни. Так, в начальной стадии обнаруживается инфильтра­ция полиморфно-ядерных клеток в альвеолах и окружающих тканях. Долее, с развитием инфекционного процесса, начинает наблюдаться инфильтрация вокруг сосудов и бронхиол. В заключительной стадии об­наруживается эмфизема легких и гиперплазия лимфатических узлов. При осложнении вторичной микрофлорой может наблюдаться крупозная или крупозно-гнойная пневмония, а также плеврит и перикардит. В других органах выраженные изменения встречаются редко (25). Диагностика. Диагноз на энзоотическую пневмонию свиней ставят на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомичес-ких данных, а также результатов лабораторных исследований.

Характерным симптомом, позволяющим предположить наличие в хозяйстве M.hyopneumoniae, является сухой хронический кашель, нерав­номерное развитие животных, энзоотические проявление болезни, а так­же изменения в верхушечных и сердечных долях легких.

Для установления окончательного диагноза проводят лабораторные исследования, которые основываются на выделении и идентификации возбудителя. При этом в лабораторию направляют легкие пораженных животных взятые не позднее двух-трех часов после убоя. В сомнитель­ных случаях ставят биопробу на поросятах. Возможна серологическая диагностика с использованием ИФА, РА, РСК, РИГА и др. (25, 42, 84).

Лечение, профилактика и меры борьбы. При лечении микоплаз-мозной пневмонии хороший результат дают антибиотики широкого спек­тра действия, к которым M.hyopneumoniae достаточно чувствителен. В частности можно рекомендовать тилан в дозе 1 г/кг корма в течение трех дней или внутримышечно 5%-ный раствор (тилозин-50, фармазин-50 и др.) в дозе 2-10 мг/кг живой массы; линкомицин внутримышечно 10%-ный раствор в дозе 0,1-0,2 мл/кг живой массы в течение трех-ссми дней; тиамутин в дозе 200 мг/кг корма в течение десяти дней или в виде инъек­ций 10 мг/кг живой массы. Также эффективно применение левомицети-на и хлортетрациклина. Однако использование вышеперечисленных средств не может предотвратить инфекцию, хотя и предупреждает раз­витие клинических признаков болезни. Следует иметь в виду, что поло­жительный результат при применении антибиотиков обычно наблюдает­ся только в течение одного-полутора месяцев, после чего курс лечения следует повторить, так как организм животного полностью не освобож­дается от микоплазм (25, 112,42).

В основе профилактики энзоотической пневмонии свиней лежат стро­гое соблюдение ветеринарно-профилактических и санитарно-гигиеничес­ких правил содержания животных. При этом основное внимание следует уделять вентиляции помещений и не допускать высокой скученности по­росят. Важным моментом является борьба легочными заболеваниями инвазионной природы, в частности своевременное проведение обработ­ки свинопоголовья противопаразитарными средствами.

В литературе имеются сообщения о хороших результатах в профи­лактике и оздоровлении хозяйств от микоплазмозной пневмонии при изо-лированном выращивании поросят. С этой целью можно применять раз­личные методы:'

- Шведский. Свиноматок с поросятами содержат изолированно, но­вые группы животных комплектуют из поросят двух-трех-месячного воз­раста и клинически здоровых в течение всего периода выращивания;

- Английский. В дополнение к шведскому способу также учиты­ваются патологоанатомические данные осмотра поросят убитых с диаг­ностической целью;

- Изолированное выращивание поросят от клинически здоровых старых свиноматок так как у них микоплазмозная инфекция встречает­ся реже, чем у свиноматок более молодого возраста;

- Изолированное выращивание поросят от свиноматок отрица­тельно реагирующих в РСК, так как при отсутствии комплементсвя-зывающих антител возбудитель, в организме таких животных, выявляет­ся в крайне редких случаях;

- Ранний отъем и изолированное выращивание поросят-сосунов обработанных антибиотиками вместе с матерями. Свиноматкам за пять дней до и после опороса, а также поросятам в течение первых пяти дней жизни дают тилозина тартрат в дозе 20 мг/кг живой массы или тиамулин а дозе 10-30 мг/кг живой массы;

- Изолированное выращивание поросят полученных с помощью ги-стерэтомии. Свиноматку убивают в последний день супоросости, матку с поросятами извлекают в асептических условиях. Полученных поросят выращивают в стерильных условиях.

Создание свободных от патогенных микоплазм стад свиней является на сегодняшний день единственным надежным средством профилакти­ки энзоотической пневмонии.

МИКОПЛАЗМОЗНЫЙ ПОЛИСЕРОЗИТ И ПОЛИАРТРИТ СВИНЕЙ

Микоплазмозный полисерозит и полиартрит свиней - инфекци­онное заболевание поросят, главным образом трех-десяти месячного воз­раста, характеризующееся лихорадкой, потерей аппетита, хромотой и при­пухлостью суставов. Возбудитель - M.hyorhinis. Болезнь могут вызывать различные штам­мы данного возбудителя, которые отличаются по биологическим свой-

ствам.

Эпизоотология. Болезнь распространена во многих странах мира. Основным источником возбудителя служат больные и инфицированные животные. Занос источника инфекции в хозяйство, как правило, проис­ходит с вновь поступающими латентно больными свиньями. Поросята чаще всего заражаются от своих матерей, а организме которых возбуди- | тель обычно локализуется в носоглотке, миндалинах и других органах. ' Основной путь заражения - аэрогенный, однако установлена возможность переноса инфекции и с предметами ухода.

studfiles.net

Штамм haemophilus parasuis ск-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером Haemophilus parasuis СК-1-ДЕП. Штамм является вирулентным в нативном виде и обладает антигенной и иммуногенной активностью после инактивации. При выращивании на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO в течение 12 часов штамм накапливается в титре 9,3-9,7 Ig КОЕ/см3. Штамм сохраняет свои свойства при хранении в полужидком агаре при 4-6°С в течение месяца, а в лиофилизированном состоянии при 4-6°С в течение 1 года. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняет свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодные для изготовления высокоэффективных диагностических и вакцинных препаратов. 4 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики гемофилезного полисерозита свиней (ГПС).

В настоящее время под влиянием массовой вакцинации животных, применения химиопрепаратов, антибиотиков и других веществ, приведших к нарушению биоценоза, существенно изменилась не только этиологическая структура инфекционных заболеваний, но и роль различных серовариантов в их возникновении и развитии. В результате все более широкое распространение получают условно-патогенные микроорганизмы, болезнетворное действие которых ранее игнорировалось или рассматривалось как эксвизитное. Среди этих болезней определенное место занимает ГПС (болезнь Глессера), который регистрируется преимущественно у поросят отъемного возраста.

ГПС - инфекционная болезнь, характеризующаяся серозно-фибринозным воспалением перикарда, плевры, брюшины, суставов и мозговых оболочек. Возбудителем этого заболевания являются гемофильные бактерии Haemophilus parasuis (H.parasuis), представляющие собой мелкие 0,5×0,2-0,3 мкм полиморфные грамотрицательные не образующие спор палочки. Они являются постоянными обитателями слизистых оболочек верхних дыхательных путей многих видов животных. Вирулентные штаммы H.parasuis образуют капсулу. В мазках H.parasuis располагаются в виде палочек и коротких цепочек. Растут в аэробных условиях на питательных средах с добавлением дрожжевого экстракта, сыворотки крови или лизата цельной крови, а также на шоколадном агаре. Серологически различают 15 сероваров по соматическому антигену и 5 серогрупп (А, В, С, D, N) по капсульному. Самыми вирулентными и распространенными в Европе и Северной Америке являются серовары №1, 2, 4, 5 и 7. Несколько реже встречаются серовары №3, 12, 13 и 14.

Источником ГПС служат больные и переболевшие поросята, а также свиноматки-бактерионосители. Заражение ГПС происходит, в основном, аэрогенным путем. Важную роль в возникновении ГПС играют иммунологический фон у поросят, предшествующее переболевание вирусными болезнями, а также различные факторы, снижающие общую резистентность организма животных. Часто ГПС протекает в виде смешанной инфекции с энзоотической пневмонией и другими микоплазмозами.

Диагноз на ГПС ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований [1-13].

ГПС имеет широкое распространение во многих странах с развитым свиноводством и наносит отрасли значительный экономический ущерб.

С 2000 по 2003 гг. выполнена работа по мониторингу бактериальных инфекций поросят на территории Российской Федерации. Проведено обследование 19 хозяйств в 11 регионах России. Бактериологически обследовали 2346 образцов патологического материала от 391 головы павших и вынужденно убитых поросят в возрасте от 1 сут до 5 мес. H.parasuis и Actinobacillus pleuropneumonie изолировали из 1,35% проб патологического материала. Несмотря на незначительный процент выделения возбудителей ГПС и актинобациллезной плевропневмонии, в некоторых обследованных хозяйствах отход поросят отъемного возраста от этих заболеваний достигал 22,8% к общему числу павших отъемышей. Лечение больных гемофилезным полисерозитом поросят с помощью лекарственных средств экономически себя не оправдало, поскольку переболевшие животные резко отставали в росте и погибали в более поздние сроки от образования фибринозных спаек между серозными оболочками внутренних органов [14].

По этой причине вакцинопрофилактика ГПС занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для профилактики ГПС используют инактивированные вакцины, полученные из вирулентных штаммов гемофил, подвергнутых инактивации с помощью различных химических препаратов.

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [15].

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [16].

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [17].

Известен штамм H.parasuis серотипа А - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [18].

Известен штамм H.parasuis серотипа D - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [18].

Известен штамм H.parasuis НТ серотипа D - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [19].

Известен штамм H.parasuis серотипа А - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [20].

Известен штамм H.parasuis серотипа С - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [20].

Известен штамм H.parasuis серотипа «DB-28» - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [21].

Известен штамм H.parasuis серотипа «DB-30» - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины [21].

Общим недостатком известных штаммов является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на их основе вакцинных препаратов.

В связи с этим задача отбора и изучения эпизоотических изолятов возбудителя ГПС в целях получения новых производственных штаммов H.parasuis для изготовления диагностических и вакцинных препаратов остается актуальной.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм H.parasuis - возбудитель ГПС, обладающий высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющий свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифических диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, способных защитить свиное поголовье от эпизоотического возбудителя ГПС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов H.parasuis - возбудителей ГПС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных диагностических и вакцинных препаратов.

Указанный технический результат достигнут получением штамма H.parasuis СК-1 (авторское наименование «штамм «СК-1») - возбудителя ГПС. Штамм является новым, ранее неизвестным.

Исходная культура для получения штамма «СК-1» была выделена из патологического материала вынужденно убитых поросят в возрасте 45 суток с признаками ГПС, поступивших из ЗАО «Северный ключ» Самарской области.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 6 января 2004 года под регистрационным номером Haemophilus parasuis СК-1-ДЕП.

Штамм «СК-1» обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС, создающей напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных животных.

Штамм «СК-1» характеризуется следующими признаками и свойствами.

Происхождение штамма

Штамм «СК-1» относится к виду Haemophilus parasuis (семейство Pasteurellaceae, род Haemophilus).

Выделен в лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ в ноябре 2002 г. от больных гемофилезным полисерозитом поросят в возрасте 45 суток.

Морфологические свойства

Штамм «СК-1» обладает морфологическими признаками, характерными для данных микроорганизмов. Клетки штамма «СК-1» овальные, сферические или палочковидные, по размеру обычно менее 1 мкм в ширину и различные по длине, иногда образуют нити, обнаруживают заметный плеоморфизм, образуют капсулу, неподвижные.

При окраске по Граму клетки штамма «СК-1» окрашиваются отрицательно.

Культуральные свойства

Штамм «СК-1» растет на средах сложного состава только в присутствии фактора роста V (NAD - никотинамидадениндинуклеотид или NADP - никотинамидадениндинуклеотид-фосфат). Оптимальная температура 35-37°С.

При росте на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO (для плевропневмониеподобных организмов) фирмы Difco, содержащей 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта (фактора роста V), в течение 24 часов штамм «СК-1» образует незначительное равномерное помутнение среды.

При росте на плотных питательных средах, изготовленных на основе бульона PPLO (фирма Difco) и содержащих 1,5% агара (фирма Difco) и 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта, штамм «СК-1» формирует характерный рост колоний H.parasuis: мелкие, диаметром 0,5-2 мм, круглые, выпуклые, с гладкой блестящей поверхностью колонии в «S» форме.

Ферментативные (биохимические) свойства

Штамм «СК-1» обладает биохимическими свойствами, характерными для вида H.parasuis, образует каталазу, оксидазу, не образует уреазу, сероводород и индол. Ферментирует без образования газа углеводы: глюкозу, сахарозу, лактозу, маннит; не ферментирует сорбит, лизин и орнитин.

Биотехнологическая характеристика

Штамм «СК-1» является вирулентным в нативном виде и обладает антигенной и иммуногенной активностью после инактивации.

Штамм «СК-1» предназначен для изготовления инактивированной вакцины против ГПС. При выращивании на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO (фирма Difco), содержащей 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта (фактор роста V), в течение 12 часов штамм «СК-1» накапливается в титре 9,3-9,7 Ig колониеобразующих единиц в 1 см3 (КОЕ/см3).

Штамм «СК-1» сохраняет свои свойства при хранении в полужидком агаре при температуре 4-6°С в течение месяца, а в лиофилизированном состоянии при температуре 4-6°С в течение 1 года.

Патогенность

Штамм «СК-1» является патогенным для лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

Внутрибрюшинное заражение морских свинок массой 300-350 г суспензией штамма «СК-1», содержащей 2 млрд. КОЕ/см3, вызывает заболевание животных через 2 суток, а через 3-5 суток - их гибель.

При заражении белых мышей массой 16-18 г разведениями суточных бульонных культур ЛД50 для штамма «СК-1» составила 398 млн. микробных клеток (м.к.).

При заражении белых мышей массой 16-18 г суспензией клеток штамма «СК-1», выращенного на плотной питательной среде, Ig ЛД50 штамма «СК-1» для белых мышей составляет 9,7 (5,01×109).

Серологические свойства

Штамм «СК-1» обладает агглютинирующей активностью в отношении антител переболевших или иммунизированных животных в реакции агглютинации (РА). При иммунизации лабораторных и естественно-восприимчивых животных формалинизированный цельноклеточный антиген штамма «СК-1» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РА, в разведении 1:200-1:3200.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%.

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Свободен от контаминации грибной микрофлорой, бактериями других видов и вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм «СК-1» по биохимическим, антигенным и иммуногенным свойствам является оригинальным, ранее неизвестным штаммом. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм обладает признаками патентоспособности «новизна» и « изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают его объем.

Пример 1.

Исходная культура для получения штамма «СК-1» была выделена из патологического материала (легкое, эксудат грудной полости, заглоточные и средостенные лимфоузлы, селезенка, сердце, кровь из сердца) вынужденно убитых поросят в возрасте 45 суток с признаками гемофилезного полисерозита, поступивших из ЗАО «Северный ключ» Самарской области.

Штамм «СК-1» был выделен в лаборатории ФГУ ВНИИЗЖ с использованием плотных питательных сред, изготовленных на основе бульона PPLO (фирма Difco), содержащих 1,5% агара (фирма Difco), 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта и 1% гемина.

Выделенная чистая культура изолята была идентифицирована по культуральным и биохимическим свойствам и в полимеразной цепной реакции как H.parasius (таблица 1) и заложена на хранение в виде супсензии бактериальных клеток с концентрацией 10 млрд. м.к./см3 в желатин-сахарозной среде, лиофильно высушенной под вакуумом. Штамм хранится при температуре - 40°С.

Штамм освежают 1-2 раза в год (12 мес.). Концентрация культуры за 12 мес. хранения снижалась менее чем на 0,5 Ig КОЕ/см3, при этом стабильно сохраняется активность в РА и иммуногенная активность.

Полученному штамму бактерий H.parasuis присвоено авторское наименование «СК-1».

Пример 2.

Для изготовления диагностического антигена H.parasuis используют штамм «СК-1». Лиофилизированную культуру штамма «СК-1» суспендируют в 1 см3 PPLO бульона, содержащего ростовые факторы (раствор NADP - 1%, раствор гемина - 1%) и засевают во флаконы с 20 см3 PPLO бульона. Флаконы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов.

24-часовую бульонную культуру штамма «СК-1» высевают на чашки с PPLO агаром, содержащим ростовые факторы (раствор NADP - 1%, раствор гемина - 1%). Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов.

Выросшую на каждой чашке культуру смывают стерильным 0,9% физиологическим раствором в объеме 5 см3, затем трижды отмывают, центрифугируя суспензию при 1000 g. Осевшие клетки ресуспендируют в стерильном физ. растворе и доводят концентрацию клеток до 10 млрд. м.к./см3 по стандарту мутности. В полученную суспензию вносят формалин до конечной концентрации 0,2% и инкубируют смесь в термостате при 37°С в течение 24 часов. Суспензию проверяют на полноту инактивации высевом на чашку с PPLO агаром.

Инактивированные клетки осаждают центрифугированием при 1000 g. По стандарту мутности доводят концентрацию антигена до 20 млрд. м.к./см3 в физ. растворе.

Для получения гипериммунной сыворотки используют молодых кроликов массой 2,5-3,0 кг. Кроликов иммунизируют один раз в неделю, начиная с дозы 0,5 см3 антигена (концентрация 20 млрд. м.к./см3) с адъювантом Фрейнда (в отношении 1:1) подкожно. Все последующие инъекции делают внутривенно в возрастающих дозах: 1, 2 и 3 см3. Последнюю дозу (3 см3) повторяют 4 раза. Через 1 неделю после 8-й инъекции кроликов обескровливают.

Активность антигена определяют в количественной РА, которую проводят в полистироловых планшетах или пробирках с использованием гипериммунных сывороток крови кролика, содержащих антитела против штамма «СК-1» (положительные контрольные сыворотки). Нормальную сыворотку крови кролика используют в качестве отрицательного контроля.

Антиген считают активным, если в РА с гомологичной сывороткой он образует видимые невооруженные глазом агглютинаты при концентрации 5×107 м.к./см3 (7,69 log2) и выше. При этом с нормальной (неиммунной) сывороткой кролика реакция отсутствует.

Специфичность антигена определяют также в количественной РА, но с сыворотками, содержащими антитела к бактериям Pasteurella multocida и Actinobacillus pleuropneumoniae. Антиген HPs не дает положительной реакции с сыворотками, иммунными к названным выше видам бактерий (таблица 2).

Таким образом, результаты РА свидетельствуют о специфичности антигена, полученного из штамма «СК-1».

Пример 3.

Для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС суточную бульонную культуру из штамма «СК-1», выращенную в аппарате АК-210 (объем 10 л), стерильно переливают в стеклянную емкость для инактивации, в которую вносят раствор димера этиленимина (ДЭИ) в количестве, обеспечивающем его конечную концентрацию в суспензии 1% по активному веществу. Инактивацию проводят при постоянном перемешивании, рН в пределах 7,6-7,8 и температуре 36-37°С в течение 24 часов.

После окончания процесса инактивации суспензию охлаждают до 2-8°С и исследуют на полноту инактивации. Полученный антиген очищают от балластных примесей и ДЭИ известными для специалиста методами. После этого антиген соединяют с масляным адъювантом.

В качестве масляного адъюванта используют Montanide ISA-70 (фирма «SEPPIC», Франция). Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивают в соотношении (мас.%) 70:30 на гомогенизаторе в течение 4-5 минут при скорости вращения винта 3000 об./мин, при этом получают однородную эмульсию белого цвета типа «вода-масло».

Полученная вакцина имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Готовую эмульсионную вакцину собирают в одну стерильную емкость, фасуют в стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями.

Вакцина представляет собой эмульсию белого цвета слегка вязкой консистенции. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла на поверхности эмульсии. При встряхивании вакцины однородность эмульсии восстанавливается.

Полученную вакцину контролируют на безвредность и стерильность.

Определение безвредности проводят на 10 белых мышах массой 16-18 г. Из пяти флаконов с вакциной отбирают с соблюдением правил асептики и антисептики по 5 см3 содержимого и объединяют в общий объем. Объединенную пробу (25 см3) используют для проверки на безвредность. Препарат вводят животным подкожно в область спины в объеме 0,5 см3. Наблюдение за животными производят в течение 10 сут. Вакцину считают безвредной, если все животные, взятые в опыт, остаются живыми и клинически здоровыми в течение срока наблюдения.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 280885-89 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности».

Антигенную активность каждой серии вакцины проверяют на морских свинках массой 350-400 г. Вакцину вводят двукратно с интервалом 20-25 суток 10 морским свинкам внутримышечно в области бедра в объеме 0,5 см3. Через 14 суток после второй вакцинации у морских свинок отбирают пробы крови, выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к бактериям H.parasuis в РА. Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр специфических антител в РА не ниже 1:200. Результаты исследований представлены в таблицах 4 и 5.

Вакцину применяют для профилактической иммунизации свиней против гемофилезного полисерозита. Вакцина способствует образованию активного иммунитета против гемофилезного полисерозита через 21 сутки после 2-кратного применения препарата длительностью не менее 6 месяцев.

Пример 4.

Проведена оценка качества инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС из штамма «СК-1», изготовленной так, как описано в примере 3.

Проверку вакцины проводили по следующим показателям:

бактериологический контроль стерильности, определение безвредности вакцины и ее иммуногенной активности.

Бактериологический контроль стерильности

Пробы вакцины посеяли на жидкую и плотную среду Сабуро, МПА, МПБ - по 3 пробирки, на МППБ - по 2 пробирки и 2 флакона, среду Эндо - по 3 чашки.

Для выявления аэробов высевали 0,5 см3 вакцины в одну пробирку и 2 см3 в один флакон, а для выявления анаэробов - соответственно по 1 и 5 см3.

Пробирки, бактериологические чашки, флаконы с посевами на всех средах, кроме Сабуро, выдерживали в термостате при (37±0,5)°С, на среде Сабуро при (21±1,0)°С в течение 7 суток.

По истечении указанного срока делали пересев, за исключением посевов на МПА, среду Эндо, агар Сабуро.

Пересевали пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы выдерживали 7 суток.

Одновременно проводили контроль стерильности сред. Результаты первичного и повторного посевов оценивали путем макроскопического исследования посевов.

Рост микроорганизмов на питательных средах с посевами отсутствовал.

Определение безвредности вакцины

Безвредность вакцины проверяли на 10 белых мышах массой 16-18 г. Препарат вводили подкожно в области спины в объеме 0,5 см3. Наблюдение за животными вели в течение 10 суток. Все животные, взятые в опыт, остались живыми и клинически здоровыми в течение срока наблюдения.

Безвредность вакцины проверяли на 4 подсвинках 4-месячного возраста. Препарат вводили 2 животным внутримышечно за ухом в объеме 3 см3 (трехкратная доза) и 2 животным внутримышечно за ухом в объеме 5 см3 (пятикратная доза).

В течение 10 суток наблюдения отклонений со стороны общего состояния организма четырех подсвинков, взятых в опыт, не наблюдали.

Местная реакция на введение препарата отсутствовала.

Определение иммуногенности.

Иммуногенную активность вакцины проверяли на 20 морских свинках массой 300-350 г.

Вакцину вводили однократно внутримышечно в области бедра по 0,2 см3. Через 21 сутки после иммунизации 10 вакцинированных и 10 контрольных (невакцинированных) морских свинок заражали внутрибрюшинно предварительно оттитрованной смертельной дозой возбудителя ГПС, штамм «СК-1», в объеме 0,5 см3 подкожно.

В течение 4 суток контрольные свинки пали, а опытные оставались живы в течение 10 суток после гибели контроля.

Исследование показали, что вакцина из штамма «СК-1» стерильна, безвредна и иммуногенна.

Пример 5.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «СК-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС. Иммуногенную активность ассоциированной вакцины проверили на 10 морских свинках массой 300-350 г.

Вакцину вводили однократно внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра по 0,2 см3. Через 21 сутки после иммунизации 5 вакцинированных и 5 контрольных (невакцинированных) морских свинок заразили внутрибрюшинно предварительно оттитрованной смертельной дозой возбудителя ГПС из штамма «СК-1» в объеме 0,5 см3.

В течение 4 суток контрольные свинки пали, а опытные оставались живы в течение 10 суток после гибели контроля.

Следовательно, испытуемая вакцина иммуногенна по гемофилезному компоненту.

Пример 6.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «СК-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС в условиях промкомплекса «Кузнецовский» Московской области на 580 головах свиноматок во время производственной апробации ассоциированного препарата.

Вакцину применяли согласно временному наставлению. После применения вакцины поствакцинальных осложнений и прорывов иммунитета у животных не отмечено.

Пример 7.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «СК-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС в условиях неблагополучного по ГПС ОАО «Ильиногорское» Нижегородской области на свиноматках во время производственной апробации ассоциированного препарата. Вакцину применяли согласно временному наставлению. Общее количество привитых животных составило: опытных - 292 головы, контрольных - 285 голов.

Наблюдение за привитыми животными показало:

1. Отклонений со стороны общего состояния организма опытных и контрольных животных на инъекцию биопрепарата не наблюдали.

2. Температура тела и основные физиологические показатели оставались в пределах нормы.

3. Сыворотки крови свиноматок в количестве 20 проб исследовали в ФГУ ВНИИЗЖ до иммунизации и через 25 дней после введения второй дозы вакцины.

4. Сыворотки крови свиноматок, иммунизированных против сальмонеллеза, пастереллеза и ГПС, были положительными.

Результаты испытаний показали, что вакцина безвредна, обладает достаточной иммуногенной активностью и может быть использована для специфической профилактики.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм «СК-1»-возбудитель ГПС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной микробиологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм «СК-1», полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, пригоден для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов и расширяет арсенал новых производственных штаммов H.parasuis - возбудителей ГПС.

Следовательно, предлагаемый штамм соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации

1. Glässer К. Untersuchungen uber die Schweineseuche mit besonderer Berücksichtigung ihrer Äntiologie und Pathologie (studies on poliserositis in swine with special regard to etiology and pathology) - Deutsch. Tieärztl W. - Schr., 1910, 18, 729-733.

2. Nicolet J., Scholl E. Haemophilus infections. In: Leman A.D., Clock R. etai., (Eds). Diseases of swine. 5th edn. Iowa State Univ. Press. Ames IA, 1981, pp.368-377.

3. Nicolet J., Morozumi Т., Bloch J., Proposal for a serological classification of Haemophilus parasuis. - Proc. Int. Pig. Vet. Soc., Barcelona, 1986, p.260.

4. Сидоров М.И., Скородумов Д.И. Гемофилезы животных. - М., Агропромиздат, 1986, 82-104.

5. Nielsen R. Pathogenicity and Immunity studies of Haemophilus parasuis Serotypes. - Acta Vet. scand., 1993, 34,2, 193-198.

6. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part I. Agri-Practice, 1993a, 14 (3), 3, 19-23.

7. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part II. Agri-Practice, 1993b, 14(4), 34-39.

8. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part III. Agri-Practice, 1993с, 14 (5), 5-9.

9. Segal J. Enfermedad de Glasser: conceptos generales de la infection por Haemophilus parasuis. - Med. Vet, 1996, V.13, N11, 595-605.

10. Определитель бактерий Берджи: В 2-х т. М.: Мир, 1997. - Т.1. - С.200-203.

11. Скородумов Д.И. Актинобациллезная (гемофилезная) плевропневмония и гемофилезный полисерозит свиней (этиология, лабораторная диагностика, основы специфической профилактики актинобациллезной плевропневмонии). - Автореф. дисс... доктора вет. наук. Москва, 1997. - 40 с.

12. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. - М.: Мир, 1999. - С.498-500.

13. Гаффаров Х.З., Романов Е.А. Инфекционные болезни свиней и современные средства борьбы с ними. - Казань, 2003. - С.73-77.

14. Гусев В.В., Приходько С.М. и соавт. Мониторинг бактериальных инфекций в промышленном свиноводстве. - Ветеринария, 2004. - №2. - С.7-8.

15. Baehler J.R., Burgisser H. et al. Infection Haemophilus parasuis chez le pore. Schweiz. Arch. Tierheilkd., 1974. - 116. - P.183-188.

16. Nielsen R., Danielsen V. An outbreak of Glässer's disease. Studies on etiology, serology and effect of vaccination. Nord.Vet.Med., 1975. - 27. - P.20-25.

17. Сидоров М.А. и соавт. Иммуногенность вакцины против гемофилезного полисерозита поросят. - Доклады ВАСХНИЛ, 1980. - 8. - С.30.

18. Тарасенок Н.И. Изучение возбудителя гемофилезного полисерозита поросят. - Ветеринария, 1989. - 11. - С.36-39.

19. ТУ 10-09-110-91 от 29.04.91 г. «Формолвакцина гидроокись-алюминиевая против гемофилезного полисерозита поросят».

20. Толяронок Г.Е. Этиология и профилактика полисерозита свиней. - Автореф. дисс... канд. вет. наук. Минск, 1998, 20 с.

21. Гаффаров Х.З., Ефимова М.А. и соавт. Антигенная активность ассоциированной вакцины против гемофилезного полисерозита, трансмиссивного гастроэнтерита и отечной болезни поросят-отъемышей на лабораторных животных. - Ветеринарный врач, 2003. №3(15), С.41-43.

Штамм Haemophilus parasuis CK-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней семейства Pasteurellaceae, рода Haemophilus, вида Haemophilus parasuis, коллекция ФГУ ВГНКИ Haemophilus parasuis CK-1-ДЕП, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

www.findpatent.ru

Гемофилезный полисерозит - Заразные болезни - Инфекционные

Заболевание регистрируется во всех странах мира, особенно в хозяйствах с поточной технологией воспроизводства свиней и неудовлетворительным микроклиматом в помещениях. Наносит серьезный ущерб неблагополучным хозяйствам.Сведения возбудителе. Болезнь вызывает микроорганизм Haemophilus parasuis из семейства Pasteurellaceae, представляющий собой мелкие грамотрицательные короткие полиморфные неподвижные палочки, необразующие спор и формирующие капсулу. В окрашенных мазках из патматериала из культур они представлены в виде тонких мелкозернистых палочек, расположенных одиночно и в виде коротких (из 3 — 5 клеток) цепочек. На концах палочек имеются более интенсивно окрашенные утолщения. Возбудитель болезни растет в анаэробных условиях только на питательных средах, содержащих сыворотку крови животных и V-ростовой фактор (дифосфопиридин нуклеотид, дрожжевой экстракт) в микроаэрофильных условиях (в атмосфере 20% СОг). Гемолизин и уреазу не вырабатывает, обладает слабой ферментативной активностью.Различают семь серологических вариантов возбудителя, причем разные серовары имеют различную вирулентность. Наиболее вирулентными для восприимчивых животных являются первые пять сероваров.Возбудитель чувствителен к антибиотикам и другим антибактериальным препаратам. Растворы дезинфицирующих средств (гидроксид натрия, формальдегид, хлорсодержащие препараты и др.) в общепринятых концентрациях действуют на микроб губительно.

Эпизоотологические данные. Полисерозитом болеют поросята через 10 — 15 дней после отъема от свиноматок в 35 — 75-дневном возрасте. Возникновению болезни часто предшествует вспышка гриппа. В крупных свиноводческих комплексах иногда болеют и поросята-сосуны. Взрослые животные не заболевают.Источник возбудителя инфекции — взрослые свиньи-бактерионосители, особенно свиноматки первых опоросов, а также больные и переболевшие поросята. Заражение происходит через слизистые оболочки носоглотки и верхних дыхательных путей, а передача возбудителя — аэрогенно.

Возникновению, распространению и тяжелому протеканию заболевания в хозяйстве способствуют гипогаммоглобулинемия и ранний отъем поросят от свиноматок, неудовлетворительный микроклимат в помещениях, перемещения животных внутри хозяйства и в корпусах комплексов и факторы, отрицательно влияющие на резистентность организма.Характерная особенность гемофилезного полисерозита — быстрое нарастание числа заболевших и павших поросят с признаками одновременного поражения серозных оболочек брюшной и грудной полостей (перитонит, перикардит и плеврит). Заболеваемость при первичной вспышке достигает 70% и более, летальность — до 50%.

Патогенез. Изучен недостаточно. Полагают, что проникший через слизистые оболочки носоглотки возбудитель заносится кровью на серозные оболочки и, обладая выраженным тропизмом, интенсивно на них размножается, вызывая продуктивное воспаление с обильным выпотом серозного экссудата. Под влиянием образующихся в экссудате протеаз микроб разрушается, из него высвобождаются эндотоксины, которые усугубляют патологические процессы в организме. В дальнейшем в экссудате появляются пленки фибрина и в случае выздоровления (рассасывание экссудата) у больных образуются фибринозные спайки эпикарда сердца с эпикардом околосердечной сумки, между петлями кишечника и между реберной и легочной плеврой.

Клинические признаки и течение. Инкубационный период при гемофилезном полисерозите от нескольких часов до 1 суток. Болезнь протекает остро, подостро и хронически.При остром течении температура тела у поросят повышается до 40,5 — 41,5 "С, наблюдаются чихание, сухой кашель, нередко рвота. Больные отказываются от корма, появляется болезненность брюшной и грудной стенки, вследствие чего они передвигаются, осторожно выгнув спину, щетина на спине взъерошивается. Сердечный толчок прощупывается с трудом, прогрессирует сердечная недостаточность, появляется синюшность кожи ушных раковин, нижней стенки живота, внутренних поверхностей бедер. Смерть наступает через 24 — 36 после начала заболевания.Острое течение у многих поросят переходит в подострое или хроническое, что зависит от индивидуальных особенностей организма (главным образом от уровня гамма-глобулинов в крови). Такие животные быстро худеют и принарастающей сердечной недостаточности через 10 — 15 дней погибают. Лишь не которые начинают выздоравливать, но вследствие образования спаек петель кишечника, сердечной сумки с сердцем у них часто возникают запоры, приступы удушья. Животные погибают в более поздние сроки.

Патологоанатомические изменения. При остром течении в сердечной сумке, грудной и брюшной полостях находят большое количество (от 0,5 до 1 л и более) мутноватой жидкости с хлопьями инитями фибрина и гиперемия брюшины и плевры. При подостром и хроническом течении жидкости в полостях немного, но имеются отложения пленок фибрина на сердце, плевре и кишечнике. Петли кишечника соединены фибринозными пленками инитями, а сердечная сумка срастается с сердцем. У многих поросят обнаруживают катаральное воспаление апикальных и сердечных долей легких, а у некоторых и диафрагмальной доли, а также поражения суставов.

Диагноз и дифференциальная диагностика. Диагноз устанавливают на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов бактериологического исследования. В лабораторию для исследования направляют экссудат из перитонеальной, плевральной и перикардиальной полостей от трупов 4 — 5 нелеченых поросят и соскобы с пораженных перикарда и брюшины.При лабораторном исследовании проводят микроскопию мазков, выделяют чистую культуру на специальных средах и изолированной культурой заражают интраперитонеально и назально морских свинок. Выделение из пораженных тканей патогенной для морских свинок культуры, растущей только на среде с V-ростовым фактором, служит основанием для установления положительного диагноза на гемофилезный полисерозит.При дифференциальной диагностике необходимо учитывать, что перитониты, перикардиты и плевриты могут вызываться и другими микроорганизмами (стрептококки, стафилококки, эшерихии и др.), но в этих случаях не наблюдается массового заболевания, быстрого увеличения числа заболевших и одновременного наличия у павших поражений брюшины, перикарда и плевры.Иммунитет, специфическая профилактика. В процессе жизни у свиней формируется носительство гемофильных бактерий с образованием иммунитета (нестерильный иммунитет). Свиноматки-бактерионосители с молозивом передают антитела поросятам, у которых в течение 30 — 45 дней сохраняется колостральныйиммунитет. Для специфической профилактики болезни во многих странах, в том числе в России, применяют инакти-вированные формолвакцины.

Профилактика. Профилактика болезни основывается на строгом соблюдении технологии получения, кормления, выращивания поросят и отъема их от свиноматок; выбраковке свиноматок; в пометах которых обнаруживаются больные перитонитом и перикардитомпоросята; систематическом проведении дезинфекций помещений и воздушной среды;поддержании микроклимата в помещениях.В связи с тем что гемофилезным полисерозитом заболевают в первую очередь поросята, страдающие гипогаммаглобулинемией вследствие недостаточного потребления в первые дни жизни молозива, необходимо после рождения подсаживать поросят под свиноматку и распределять их так, чтобы каждый мог получить свою порцию молозива. При такой организации кормления все поросята помета к 2 — 3-дневномувозрасту будут иметь необходимое количество гамма-глобулинов, что обеспечит их защиту от возбудителя.

Лечение. Для лечения применяют любые имеющиеся антибактериальные препараты (антибиотики, сульфаниламидные и нитрофурановые препараты), при помощи которых можно спасти часть животных от гибели. Однако вылеченные поросята, у которых остались спайки петель кишечника и перикарда с сердечной мышцей, остаются практически тяжелобольными, отстают в росте и погибают. Поэтому принято считать, что лечение больных гемофилезным полисерозитом поросят экономически не оправдано.

Меры борьбы. В неблагополучных по полисерозиту хозяйствах принимают меры, направленные на уничтожение возбудителя в организме свиноматок. С этой целью с кормом или водой всем свиноматкам за 4 — 5 дней до перевода в цех опороса дают антибактериальные препараты в соответствии с наставлениями по их применению. Скармливают антибактериальные препараты и поросятам в течение 2 — 3 дней перед отъемом от свиноматок. Вакцинируют супоросных свиноматок. В цехах опоросов организуют прием, обсушивание и одновременную подсадку поросят под свиноматок. Такая технология вскармливания позволяет обеспечить их колостральными антителами и предохранить от заражения. Свиноматок и полученных от них поросят в 45 — 55-дневном возрасте вакцинируют гидроокись алюминиевой формолвакциной согласно наставлению по применению вакцины.

www.webvet.ru

штамм haemophilus parasuis ил-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов - патент РФ 2269570

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером Haemophilus parasuis ИЛ-1-ДЕП. Штамм является вирулентным в нативном виде и обладает антигенной и иммуногенной активностью после инактивации. При выращивании на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO в течение 12 часов штамм накапливается в титре 9,3-9,7 Ig КОЕ/см3 . Штамм сохраняет свои свойства при хранении в полужидком агаре при 4-6°С в течение месяца, а в лиофилизированном состоянии при 4-6°С в течение 1 года. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняет свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодные для изготовления высокоэффективных диагностических и вакцинных препаратов. 4 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики гемофилезного полисерозита свиней (ГПС).

В настоящее время под влиянием массовой вакцинации животных, применения химиопрепаратов, антибиотиков и других веществ, приведших к нарушению биоценоза, существенно изменилась не только этиологическая структура инфекционных заболеваний, но и роль различных серовариантов в их возникновении и развитии. В результате все более широкое распространение получают условно-патогенные микроорганизмы, болезнетворное действие которых ранее игнорировалось или рассматривалось как эксвизитное. Среди этих болезней определенное место занимает ГПС (болезнь Глессера), который регистрируется преимущественно у поросят отъемного возраста.

ГПС - инфекционная болезнь, характеризующаяся серозно-фибринозным воспалением перикарда, плевры, брюшины, суставов и мозговых оболочек. Возбудителем этого заболевания являются гемофильные бактерии Haemophilus parasuis (H.parasuis), представляющие собой мелкие 0,5×0,2-0,3 мкм полиморфные грамотрицательные не образующие спор палочки. Они являются постоянными обитателями слизистых оболочек верхних дыхательных путей многих видов животных. Вирулентные штаммы H.parasuis образуют капсулу. В мазках H.parasuis располагаются в виде палочек и коротких цепочек. Растут в аэробных условиях на питательных средах с добавлением дрожжевого экстракта, сыворотки крови или лизата цельной крови, а также на шоколадном агаре. Серологически различают 15 сероваров по соматическому антигену и 5 серогрупп (А, В, С, D, N) по капсульному. Самыми вирулентными и распространенными в Европе и Северной Америке являются серовары №№1, 2, 4, 5 и 7. Несколько реже встречаются серовары №№3, 12, 13 и 14.

Источником ГПС служат больные и переболевшие поросята, а также свиноматки-бактерионосители. Заражение ГПС происходит в основном аэрогенным путем. Важную роль в возникновении ГПС играют иммунологический фон у поросят, предшествующее переболевание вирусными болезнями, а также различные факторы, снижающие общую резистентность организма животных. Часто ГПС протекает в виде смешанной инфекции с энзоотической пневмонией и другими микоплазмозами.

Диагноз на ГПС ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований (1-13).

ГПС имеет широкое распространение во многих странах с развитым свиноводством и наносит отрасли значительный экономический ущерб.

С 2000 по 2003 гг. выполнена работа по мониторингу бактериальных инфекций поросят на территории Российской Федерации. Проведено обследование 19 хозяйств в 11 регионах России. Бактериологически обследовали 2346 образцов патологического материала от 391 головы павших и вынужденно убитых поросят в возрасте от 1 сут. до 5 мес. H.parasuis и Actinobacillus pleuropneumonie изолировали из 1,35% проб патологического материала. Несмотря на незначительный процент выделения возбудителей ГПС и актинобациллезной плевропневмонии, в некоторых обследованных хозяйствах отход поросят отъемного возраста от этих заболеваний достигал 22,8% к общему числу павших отъемышей. Лечение больных гемофилезным полисерозитом поросят с помощью лекарственных средств экономически себя не оправдало, поскольку переболевшие животные резко отставали в росте и погибали в более поздние сроки от образования фибринозных спаек между серозными оболочками внутренних органов (14).

По этой причине вакцинопрофилактика ГПС занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для профилактики ГПС используют инактивированные вакцины, полученные из вирулентных штаммов гемофил, подвергнутых инактивации с помощью различных химических препаратов.

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (15).

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (16).

Известен штамм H.parasuis неустановленного серотипа - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (17).

Известен штамм H.parasuis серотипа А - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (18).

Известен штамм H.parasuis серотипа D - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (18).

Известен штамм H.parasuis НТ серотипа D - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (19).

Известен штамм H.parasuis серотипа А - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (20).

Известен штамм H.parasuis серотипа С - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (20).

Известен штамм H.parasuis серотипа «DB-28» - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (21).

Известен штамм H.parasuis серотипа «DB-30» - возбудитель ГПС для изготовления инактивированной вакцины (21).

Общим недостатком известных штаммов является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на их основе вакцинных препаратов.

В связи с этим задача отбора и изучения эпизоотических изолятов возбудителя ГПС в целях получения новых производственных штаммов H.parasuis для изготовления диагностических и вакцинных препаратов остается актуальной.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм H.parasuis - возбудитель ГПС, обладающий высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющий свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифических диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, способных защитить свиное поголовье от эпизоотического возбудителя ГПС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов H.parasuis - возбудителей ГПС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных диагностических и вакцинных препаратов.

Указанный технический результат достигнут получением штамма H.parasuis ИЛ-1 (авторское наименование «штамм «ИЛ-1») - возбудителя ГПС. Штамм является новым, ранее неизвестным.

Исходная культура для получения штамма «ИЛ-1» была выделена из патологического материала вынужденно убитых поросят в возрасте 48 суток с признаками ГПС, поступивших из ОАО «Ильиногорское» Нижегородской области.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 6 января 2004 года под регистрационным номером Haemophilus parasuis ИЛ-1-ДЕП.

Штамм «ИЛ-1» обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС, создающей напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных животных.

Штамм «ИЛ-1» характеризуется следующими признаками и свойствами.

Происхождение штамма

Штамм «ИЛ-1» относится к виду Haemophilus parasuis (семейство Pasteurellaceae, род Haemophilus).

Выделен в лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ в октябре 2002 г. от больных гемофилезным полисерозитом поросят в возрасте 48 суток.

Морфологические свойства

Штамм «ИЛ-1» обладает морфологическими признаками, характерными для данных микроорганизмов. Клетки штамма «ИЛ-1» овальные, сферические или палочковидные, по размеру обычно менее 1 мкм в ширину и различные по длине, иногда образуют нити, обнаруживают заметный плеоморфизм, образуют капсулу, неподвижные.

При окраске по Граму клетки штамма «ИЛ-1» окрашиваются отрицательно.

Культуральные свойства

Штамм «ИЛ-1» растет на средах сложного состава только в присутствии фактора роста V (NAD - никотинамидадениндинуклеотид или NADP - никотинамидадениндинуклеотид-фосфат). Оптимальная температура 35-37°С.

При росте на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO (для плевропневмониеподобных организмов) фирмы Difco, содержащей 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта (фактора роста V), в течение 24 часов штамм «ИЛ-1» образует незначительное равномерное помутнение среды.

При росте на плотных питательных средах, изготовленных на основе бульона PPLO (фирма Difco) и содержащих 1,5% агара (фирма Difco) и 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта, штамм «ИЛ-1» формирует характерный рост колоний H.parasuis: мелкие, диаметром 0,5-2 мм, круглые, выпуклые, с гладкой блестящей поверхностью колонии в «S» форме.

Ферментативные (биохимические) свойства

Штамм «ИЛ-1» обладает биохимическими свойствами, характерными для вида H.parasuis, образует каталазу, оксидазу, не образует уреазу, сероводород и индол. Ферментирует без образования газа углеводы: глюкозу, сахарозу; не ферментирует лактозу, маннит, сорбит, лизин и орнитин.

Биотехнологическая характеристика

Штамм «ИЛ-1» является вирулентным в нативном виде и обладает антигенной и иммуногенной активностью после инактивации.

Штамм «ИЛ-1» предназначен для изготовления инактивированной вакцины против ГПС. При выращивании на жидкой питательной среде на основе бульона PPLO (фирма Difco), содержащей 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта (фактор роста V), в течение 12 часов штамм «ИЛ-1» накапливается в титре 9,3-9,7 lg колониеобразующих единиц в 1 см3 (КОЕ/см3).

Штамм «ИЛ-1» сохраняет свои свойства при хранении в полужидком агаре при температуре 4-6°С в течение месяца, а в лиофилизированном состоянии при температуре 4-6°С в течение 1 года.

Патогенность

Штамм «ИЛ-1» является патогенным для лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

Внутрибрюшинное заражение морских свинок массой 300-350 г суспензией штамма «ИЛ-1», содержащей 2 млрд. КОЕ/см 3, вызывает заболевание животных через 2 суток, а через 3-5 суток - их гибель.

При заражении белых мышей массой 16-18 г разведениями суточных бульонных культур ЛД 50 для штамма «ИЛ-1» составила 5 млрд. микробных клеток (м.к.).

Серологические свойства

Штамм «ИЛ-1» обладает агглютинирующей активностью в отношении антител переболевших или иммунизированных животных в реакции агглютинации (РА). При иммунизации лабораторных и естественно-восприимчивых животных формалинизированный цельноклеточный антиген штамма «ИЛ-1» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РА, в разведении 1:200-1:1600.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%.

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Свободен от контаминации грибной микрофлорой, бактериями других видов и вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм «ИЛ-1» по биохимическим, антигенным и иммуногенным свойствам является оригинальным, ранее неизвестным штаммом. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм обладает признаками патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают его объем.

Пример 1.

Исходная культура для получения штамма «ИЛ-1» была выделена из патологического материала (легкое, эксудат грудной полости, заглоточные и средостенные лимфоузлы, селезенка, сердце, кровь из сердца) вынужденно убитых поросят в возрасте 48 суток с признаками гемофилезного полисерозита, поступивших из ОАО «Ильиногорское» Нижегородской области.

Штамм «ИЛ-1» был выделен в лаборатории ФГУ ВНИИЗЖ с использованием плотных питательных сред, изготовленных на основе бульона PPLO (фирма Difco), содержащих 1,5% агара (фирма Difco), 10% свежеприготовленного дрожжевого экстракта и 1% гемина.

Выделенная чистая культура изолята была идентифицирована по культуральным и биохимическим свойствам и в полимеразной цепной реакции как H.parasius (таблица 1) и заложена на хранение в виде супсензии бактериальных клеток с концентрацией 10 млрд. м.к./см 3 в желатин-сахарозной среде, лиофильно высушенной под вакуумом. Штамм хранится при температуре -40°С.

Штамм освежают 1-2 раза в год (12 мес.). Концентрация культуры за 12 мес. хранения снижалась менее чем на 0,5 lg КОЕ/см 3, при этом стабильно сохраняется активность в РА и иммуногенная активность.

Полученному штамму бактерий H.parasuis присвоено авторское наименование «ИЛ-1».

Пример 2.

Для изготовления диагностического антигена H.parasuis используют штамм «ИЛ-1». Лиофилизированную культуру штамма «ИЛ-1» суспендируют в 1 см 3 PPLO бульона, содержащего ростовые факторы (раствор NADP - 1%, раствор гемина - 1%) и засевают во флаконы с 20 см 3 PPLO бульона. Флаконы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов.

24-часовую бульонную культуру штамма «ИЛ-1» высевают на чашки с PPLO агаром, содержащим ростовые факторы (раствор NADP - 1%, раствор гемина - 1%). Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов.

Выросшую на каждой чашке культуру смывают стерильным 0,9% физиологическим раствором в объеме 5 см3, затем трижды отмывают, центрифугируя суспензию при 1000 g. Осевшие клетки ресуспендируют в стерильном физ. растворе и доводят концентрацию клеток до 10 млрд. м.к./см 3 по стандарту мутности. В полученную суспензию вносят формалин до конечной концентрации 0,2% и инкубируют смесь в термостате при 37°С в течение 24 часов. Суспензию проверяют на полноту инактивации высевом на чашку с PPLO агаром.

Инактивированные клетки осаждают центрифугированием при 1000 g. По стандарту мутности доводят концентрацию антигена до 20 млрд. м.к./см3 в физ. растворе.

Для получения гипериммунной сыворотки используют молодых кроликов массой 2,5-3,0 кг. Кроликов иммунизируют один раз в неделю, начиная с дозы 0,5 см3 антигена (концентрация 20 млрд. м.к./см3) с адъювантом Фрейнда (в отношении 1:1) подкожно. Все последующие инъекции делают внутривенно в возрастающих дозах: 1, 2 и 3 см3. Последнюю дозу (3 см3) повторяют 4 раза. Через 1 неделю после 8-й инъекции кроликов обескровливают.

Активность антигена определяют в количественной РА, которую проводят в полистироловых планшетах или пробирках с использованием гипериммунных сывороток крови кролика, содержащих антитела против штамма «ИЛ-1» (положительные контрольные сыворотки). Нормальную сыворотку крови кролика используют в качестве отрицательного контроля.

Антиген считают активным, если в РА с гомологичной сывороткой он образует видимые не вооруженные глазом агглютинаты при концентрации 5×107 м.к./см 3 (7,69 log2) и выше. При этом с нормальной (неиммунной) сывороткой кролика реакция отсутствует.

Специфичность антигена определяют также в количественной РА, но с сыворотками, содержащими антитела к бактериям Pasteurella multocida и Actinobacillus pleuropneumoniae. Антиген HPs не дает положительной реакции с сыворотками, иммунными к названным выше видам бактерий (таблица 2).

Таким образом, результаты РА свидетельствуют о специфичности антигена, полученного из штамма «ИЛ-1».

Пример 3.

Для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС суточную бульонную культуру из штамма «ИЛ-1», выращенную в аппарате АК-210 (объем 10 л), стерильно переливают в стеклянную емкость для инактивации, в которую вносят раствор димера этиленимина (ДЭИ) в количестве, обеспечивающем его конечную концентрацию в суспензии 1% по активному веществу. Инактивацию проводят при постоянном перемешивании, рН в пределах 7,6-7,8 и температуре 36-37°С в течение 24 часов.

После окончания процесса инактивации суспензию охлаждают до 2-8°С и исследуют на полноту инактивации. Полученный антиген очищают от балластных примесей и ДЭИ известными для специалиста методами. После этого антиген соединяют с масляным адъювантом.

В качестве масляного адъюванта используют Montanide ISA-70 (фирма «SEPPIC», Франция). Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивают в соотношении (мас.%) 70:30 на гомогенизаторе в течение 4-5 минут при скорости вращения винта 3000 об/мин, при этом получают однородную эмульсию белого цвета типа «вода-масло».

Полученная вакцина имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Готовую эмульсионную вакцину собирают в одну стерильную емкость, фасуют в стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями.

Вакцина представляет собой эмульсию белого цвета слегка вязкой консистенции. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла на поверхности эмульсии. При встряхивании вакцины однородность эмульсии восстанавливается.

Полученную вакцину контролируют на безвредность и стерильность.

Определение безвредности проводят на 10 белых мышах массой 16-18 г. Из пяти флаконов с вакциной отбирают с соблюдением правил асептики и антисептики по 5 см3 содержимого и объединяют в общий объем. Объединенную пробу (25 см3) используют для проверки на безвредность. Препарат вводят животным подкожно в область спины в объеме 0,5 см3. Наблюдение за животными производят в течение 10 сут. Вакцину считают безвредной, если все животные, взятые в опыт, остаются живыми и клинически здоровыми в течение срока наблюдения.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 280885-89 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности».

Антигенную активность каждой серии вакцины проверяют на морских свинках массой 350-400 г. Вакцину вводят двукратно с интервалом 20-25 суток 10 морским свинкам внутримышечно в области бедра в объеме 0,5 см3. Через 14 суток после второй вакцинации у морских свинок отбирают пробы крови, выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к бактериям H.parasuis в РА. Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр специфических антител в РА не ниже 1:200. Результаты исследований представлены в таблицах 4 и 3.

Вакцину применяют для профилактической иммунизации свиней против гемофилезного полисерозита. Вакцина способствует образованию активного иммунитета против гемофилезного полисерозита через 21 сутки после 2-кратного применения препарата длительностью не менее 6 месяцев.

Пример 4.

Проведена оценка качества инактивированной эмульсионной вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1», изготовленной так, как описано в примере 3.

Проверку вакцины проводили по следующим показателям: бактериологический контроль стерильности, определение безвредности вакцины и ее иммуногенной активности.

Бактериологический контроль стерильности

Пробы вакцины посеяли на жидкую и плотную среду Сабуро, МПА, МПБ - по 3 пробирки, на МППБ - по 2 пробирки и 2 флакона, среду Эндо - по 3 чашки.

Для выявления аэробов высевали 0,5 см 3 вакцины в одну пробирку и 2 см3 в один флакон, а для выявления анаэробов - соответственно по 1 и 5 см 3.

Пробирки, бактериологические чашки, флаконы с посевами на всех средах, кроме Сабуро, выдерживали в термостате при (37±0,5)°С, на среде Сабуро при (21±1,0)°С в течение 7 суток.

По истечении указанного срока делали пересев, за исключением посевов на МПА, среду Эндо, агар Сабуро.

Пересевали пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы выдерживали 7 суток.

Одновременно проводили контроль стерильности сред. Результаты первичного и повторного посевов оценивали путем макроскопического исследования посевов.

Рост микроорганизмов на питательных средах с посевами отсутствовал.

Определение безвредности вакцины

Безвредность вакцины проверяли на 10 белых мышах массой 16-18 г. Препарат вводили подкожно в области спины в объеме 0,5 см3. Наблюдение за животными вели в течение 10 суток. Все животные, взятые в опыт, остались живыми и клинически здоровыми в течение срока наблюдения.

Безвредность вакцины проверяли на 4 подсвинках 4-месячного возраста. Препарат вводили 2 животным внутримышечно за ухом в объеме 3 см3 (трехкратная доза) и 2 животным внутримышечно за ухом в объеме 5 см3 (пятикратная доза).

В течение 10 суток наблюдения отклонений со стороны общего состояния организма четырех подсвинков, взятых в опыт, не наблюдали.

Местная реакция на введение препарата отсутствовала.

Определение иммуногенности.

Иммуногенную активность вакцины проверяли на 20 морских свинках массой 300-350 г.

Вакцину вводили однократно внутримышечно в области бедра по 0,2 см3. Через 21 сутки после иммунизации 10 вакцинированных и 10 контрольных (невакцинированных) морских свинок заражали внутрибрюшинно предварительно оттитрованной смертельной дозой возбудителя ГПС, штамм «ИЛ-1», в объеме 0,5 см3 подкожно.

В течение 4 суток контрольные свинки пали, а опытные оставались живы в течение 10 суток после гибели контроля.

Исследование показали, что вакцина из штамма «ИЛ-1» стерильна, безвредна и иммуногенна.

Пример 5.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС. Иммуногенную активность ассоциированной вакцины проверили на 10 морских свинках массой 300-350 г.

Вакцину вводили однократно внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра по 0,2 см3. Через 21 сутки после иммунизации 5 вакцинированных и 5 контрольных (невакцинированных) морских свинок заразили внутрибрюшинно предварительно оттитрованной смертельной дозой возбудителя ГПС из штамма «ИЛ-1» в объеме 0,5 см3.

В течение 4 суток контрольные свинки пали, а опытные оставались живы в течение 10 суток после гибели контроля.

Следовательно, испытуемая вакцина иммуногенна по гемофилезному компоненту.

Пример 6.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС в условиях промкомплекса «Кузнецовский» Московской области на 580 головах свиноматок во время производственной апробации ассоциированного препарата.

Вакцину применяли согласно временному наставлению. После применения вакцины поствакцинальных осложнений и прорывов иммунитета у животных не отмечено.

Пример 7.

Эффективность вакцины против ГПС из штамма «ИЛ-1» проверена в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и ГПС в условиях неблагополучного по ГПС ОАО «Ильиногорское» Нижегородской области на свиноматках во время производственной апробации ассоциированного препарата. Вакцину применяли согласно временному наставлению. Общее количество привитых животных составило: опытных - 292 головы, контрольных - 285 голов.

Наблюдение за привитыми животными показало:

1. Отклонений со стороны общего состояния организма опытных и контрольных животных на инъекцию биопрепарата не наблюдали.

2. Температура тела и основные физиологические показатели оставались в пределах нормы.

3. Сыворотки крови свиноматок в количестве 20 проб исследовали в ФГУ ВНИИЗЖ до иммунизации и через 25 дней после введения второй дозы вакцины.

4. Сыворотки крови свиноматок, иммунизированных против сальмонеллеза, пастереллеза и ГПС, были положительными.

Результаты испытаний показали, что вакцина безвредна, обладает достаточной иммуногенной активностью и может быть использована для специфической профилактики.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм «ИЛ-1» - возбудитель ГПС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной микробиологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм «ИЛ-1», полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, пригоден для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов и расширяет арсенал новых производственных штаммов H.parasuis - возбудителей ГПС.

Следовательно, предлагаемый штамм соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации

1. Glässer К. Untersuchungen über die Schweineseuche mit besonderer Berücksichtigung ihrer Äntiologie und Pathologie (studies on poliserositis in swine with special regard to etiology and pathology) - Deutsch. Tierärztl.W.-Schr., 1910, 18, 729-733.

2. Nicolet J., Scholl E. Haemophilus infections. In: Leman A.D., Glock R. et.al., (Eds). Diseases of swine. 5th edn. Iowa State Univ. Press. Ames IA, 1981, pp.368-377.

3. Nicolet J., Morozumi Т., Bloch J., Proposal for a serological classification of Haemophilus parasuis. - Proc. Int. Pig. Vet. Soc., Barcelona, 1986, p.260.

4. Сидоров М.И., Скородумов Д.И. Гемофилезы животных. - М., Агропромиздат, 1986, 82-104.

5. Nielsen R. Pathogenicity and Immunity studies of Haemophilus parasuis Serotypes.-Acta Vet. scand., 1993, 34,2, 193-198.

6. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part I. Agri-Practice, 1993a, 14 (3), 3, 19-23.

7. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part II. Agri-Practice, 1993b, 14 (4), 34-39.

8. Hill H., Conner J.F. et.al. Haemophilus parasuis. Part III. Agri-Practice, 1993с, 14 (5), 5-9.

9. Segal J. Enfermedad de Glasser: conceptos generales de la infection por Haemophilus parasuis. - Med. Vet, 1996, V.13, N11, 595-605.

10. Определитель бактерий Берджи: В 2-х т. М.: Мир, 1997. - Т.1. - С.200-203.

11. Скородумов Д.И. Актинобациллезная (гемофилезная) плевропневмония и гемофилезный полисерозит свиней (этиология, лабораторная диагностика, основы специфической профилактики актинобациллезной плевропневмонии). - Автореф. дисс... доктора вет. наук. Москва, 1997. - 40 с.

12. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. - М.: Мир, 1999. - С.498-500.

13. Гаффаров Х.З., Романов Е.А. Инфекционные болезни свиней и современные средства борьбы с ними. - Казань, 2003. - С.73-77.

14. Гусев В.В., Приходько С.М. и соавт. Мониторинг бактериальных инфекций в промышленном свиноводстве. - Ветеринария, 2004. - №2. - С.7-8.

15. Baehler J.R., Burgisser H. et al. Infection Haemophilus parasuis chez le pore. Schweiz. Arch. Tierheilkd., 1974. - 116. - P.183-188.

16. Nielsen R., Danielsen V. An outbreak of Glässer's disease. Studies on etiology, serology and effect of vaccination. Nord.Vet.Med., 1975. - 27. - P.20-25.

17. Сидоров М.А. и соавт. Иммуногенность вакцины против гемофилезного полисерозита поросят. - Доклады ВАСХНИЛ, 1980. - 8. - С.30.

18. Тарасенок Н.И. Изучение возбудителя гемофилезного полисерозита поросят. - Ветеринария, 1989. - 11. - С.36-39.

19. ТУ 10-09-110-91 от 29.04.91 г. «Формолвакцина гидроокись-алюминиевая против гемофилезного полисерозита поросят».

20. Толяронок Г.Е. Этиология и профилактика полисерозита свиней. - Автореф. дисс... канд. вет. наук. Минск, 1998, 20 с.

21. Гаффаров Х.З., Ефимова М.А. и соавт. Антигенная активность ассоциированной вакцины против гемофилезного полисерозита, трансмиссивного гастроэнтерита и отечной болезни поросят-отъемышей на лабораторных животных. - Ветеринарный врач, 2003. №3(15), С.41-43.

Таблица 1Биохимические свойства штамма «ИЛ-1»
Название теста	Оценка					реакции
	«ИЛ-1»					по определителю Берджи
Каталаза	+					+
Оксидаза						-
Гемин (X)	-					-
NADP (V)	+					+
-гемолиз	-					-
Индол	-					-
Уреаза	-					-
Сероводород	-					d
Глюкоза	+					+
Лактоза	-					d
Сорбит	-					-
Маннит	-					-
Сахароза	+					+
Лизин	-					-
Орнитин	-					-
Примечание: «+» - положительная реакция«-«- отрицательная реакция«d» - вариабельная реакция
Таблица 2Специфичность антигена H.parasuis, штамм «ИЛ-1»
Сыворотки крови кролика, специфические к изолятам		Антигены (титры антител сывороток в РА, выраженные в lg)
		ИЛ-1	СК-1	Ш-1	К-1		РМ №115	РМ №656	РМ №9
ИЛ-1 (H.parasuis)		1600*	400	-	-		-	-	-
СК-1 (H.parasuis)		400	3200	-	-		-	-	-
Ш-1 (A.pleuropneumoniae)		-	-	1600	-		-	-	-
К-1 (A.pleuropneumoniae)		-	-	-	1600		-	-	-
P.multocida N115		-	-	-	-		3200	400	200
P.multocida N656		-	-	-	-		400	3200	200
P.multocida N9		-	-	-	-		400	200	3200
Контроль **		-	-	-	-		-	-	-
Примечание: * - величина, обратная разведению сыворотки;**- неиммунная сыворотка крови кролика;«-«- негативная реакция.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм Haemophilus parasuis ИЛ-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней семейства Pasteurellaceae, рода Haemophilus, вида Haemophilus parasuis, коллекция ФГУ ВГНКИ Haemophilus parasuis ИЛ-1-ДЕП, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

www.freepatent.ru

2.2. Разработка и испытание экспериментальных образцов инактивированной вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней.

Возрастная заболеваемость свиней актинобациллёзной плевропневмонией диктует необходимость вакцинации просят-отъёмышей и проблема реактогенности препарата актуальна. Исследование остаточной токсичности инактивированных цельноклеточных суспензий A.pleuropneumoniae в тесте прироста массы мышей показало высокие её уровни. Из испытанных способов инактивации наиболее эффективным оказалась обработка формальдегидом (0,2%) с последующей выдержкой бактериальных взвесей при 4-6°С в течении 30-45 суток. Различия сравниваемых показателей по этому препарату, а также инактивированных 0,1% формальдегида и тиомерсалом были достоверны, на уровне значимости от Р<0,01 – до Р<0,05 (в зависимости от сроков хранения). Полученные данные были учтены в технологии изготовления инактивированной эмульгированной вакцины. Испытание вакцины такого типа на 21,38 – 40 - дневных поросятах и супоросных свиноматках показало её безвредность.

В качестве лабораторных моделей для испытания специфической активности инактивированной вакцины были испытаны морские свинки живой массой 200—250г и белые мыши живой массой 14-16г. Мышей вакцинировали подкожно, двукратно с интервалом 10 суток в дозе с последующим определением ЛД50 заражающей культуры на вакцинированных и контрольных животных («внутрибрюшинная модель»). ЛД50 культуры, установленная на вакцинированных животных пятикратно, превышала тот же показатель, полученный на контрольных животных.

Морских свинок акционировали однократно различными дозами вакцины с последующим интраназальном заражении гомологичной культурой в дозе («лёгочная модель»). Подобный методический подход позволил определить ИМД50 вакцины. По нашему мнению, «лёгочная модель» предпочтительнее, поскольку этот метод соответствует естественным входным воротам возбудителя инфекции. С другой стороны, об эффективности иммунизации можно дополнительно судить по наличию поражений в лёгких их массивности. Определённую информацию дают показатели серологического ответа - между объёмом поражённой лёгочной ткани и среднегрупповыми титрами антител (РСК) установлена функциональная обратная зависимость

Исследовали влияние типа адъюванта на иммунологическую эффективность инактивированной вакцины. В качестве адъювантов использовали гидрат окиси алюминия и масляный адъювант на основе лёгкого минерального масла. Эмульгированной вакциной привили 315 поросят (полсектора) в неблагополучном по актинобациллёзной плевропневмонии хозяйстве, 317 свиней этого же сектора служили контролем. Гидроокись -алюминиевую вакцину ввели 647 поросятам, контролем служили 652 животных. Наблюдение за животными вели в течении 86 дней, заболевание свиней актинобациллёзной плевропневмонией наблюдали во всех группах. Индекс и коэффициент эффективности эмульгированной вакцины в этом опыте составил соответственно 7,95 и 8,42%. Аналогичные показатели в группе свиней привитых РОА вакциной были соответственно 3,12 и 67,98%, что свидетельствует о большей эффективности эмульгированной вакцины.

При конструировании инактивированной вакцины, исходя из полученных данных о накоплении в культуральной жидкости экзотоксина, гемолизина и капсульной субстанции, исследовали влияние растворимых антигенов бульонных культур на её иммуногенность. В опыте на белых была определена ИМД50 эмульгированной вакцины приготовленной на основе бульонных культур и отмытых клетках возбудителя. ИМД50 вакцины первого типа составила микробных клеток, у вакцины второго типа ИМД50 не удалось рассчитать, так как процент защиты при избранных дозах вакцины не превысил 36,36%. Следовательно, включение растворимых компонентов реакторных культур возбудителя в состав инактивированных вакцин необходимо.

При отработке оптимальной схемы иммунизации свиней инактивированной эмульгированной вакциной исследовали влияние кратности её введения на уровень иммунитета у свиней. В одном случае свиньям (8 голов) вводили вакцины однократно, в другом случае – дробно 1 и2интервалом 10 суток (8 голов). Свиней заразили через 20 дней после вакцинации интраназально в дозе Установлено, что среди свиней, вакцинированных двукратно, летальных исходов не было. Из числа привитых однократно погибло 50% животных. Между животными этих групп также выявлена достоверная разница по высоте титров антител (РА). Исходя изменений полученных данных можно заключить, что результаты серологических реакций могут служить косвенным групповым показателем формирования иммунитета.

Исследовали влияние суммарной дозы антигена при двукратной (интервал - 15 суток) вакцинации свиней эмульгированной вакциной на состояние иммунитета. Установлено, что среди привитых различными дозами вакцины свиней (16 голов) при контрольном интраназальном заражении летальных исходов не было, в контроле погибло 50% животных. Среди животных, привитых вакциной в суммарных дозах 10,6,4 и 2, объём поражённой лёгочной ткани в среднем по группам соответственно составил 5,25±6,70, 5,94±8,01, 5,69±10,24, 10,50­±8,57%. У контрольных свиней было поражено 25,1% лёгочной ткани. Различия в титрах комплементсвязывающих антител у вакцинированных животных перечисленных групп перед заражением были статистически не достоверны, также не достоверны различия по объёму поражённой лёгочной ткани. Свиноводства учётом заболеваемости, количества летальных исходов и объёма поражённой лёгочной ткани мы считаем оптимальной дозу вакцины 4 , введённую по схеме 1+3.

Исследовали сроки формирования и длительность иммунитета у свиней, привитых однократных эмульгированной вакциной в дозе 5 с контрольным интраназальным заражением через 10, 30 и 60 дней после иммунизации. Исходя из уровня защиты вакцинированных животных указанных групп и площади поражённой лёгочной ткани, близкие показатели состояния иммунитета имели свиньи через 10 и 30 дней со снижением к 60 дню после вакцинации. Между показателями защиты (%) и площади поражения лёгочной ткани выявлена обратная функциональная зависимость (r= -1). Значительная заболеваемость свиней актинобациллёзной плевропневмонией в первый период откорма в неблагополучном хозяйстве, с учётом полученных данных, свидетельствует о необходимости ревакцинации свиней в период передачи на откорм.

Определение иммуногенности вакцины в опытах на белых мышах в процессе хранения при 4-6°С показало, что в интервале 1-11 месяцев ИМД50 препарата колебалась в пределах микробных клеток, что позволяет говорить о малом изменении активности препарата в указанные сроки.

С учётом результатов испытания различных типов инактивированных вакцин на лабораторных животных и свиньях была проведена апробация экспериментальных образцов вакцин против актинобациллёзной плевропневмонии свиней в производственных условиях.

Первоначально эмульгированная вакцина была испытана на безвредность и иммунологическую эффективность на ограниченном контингенте свиней различного возраста в хозяйстве, неблагополучном по актинобациллёзной плевропневмонии свиней. В последующем в этом же хозяйстве проводилась поголовная вакцинация животных по следующей схеме: внутримышечно свиноматкам за 20-25 дней до ожидаемого опороса в дозе 1,аналогичную дозу вводили ремонтным свинкам, поросят вакцинировали в дозе 1в возрасте 35 - 40 дне й. В период проведённых исследований вакцинации было подвергнуто 1677,4 тысячи свиней.

Исследования показали, что до начала вакцинации падёж свиней с диагнозом актинобациллёзной плевропневмонии составил 30,22% от общего количества павших животных, при частичной вакцинации поголовья -12,28%, при полной вакцинации - 8,89%. Между уровнем вакцинации и падёжом свиней от актинобациллёзной плевропневмонии установлена достаточно сильная обратная связь ( r= -0,71). Применение вакцины обеспечило снижение отхода свиней по причине актинобациллёзной плевропневмонии, в зависимости от анализируемого периода в 3 - 5 раз и увеличение живой массы поросят на 7,42 - 8,29 кг при передаче на откорм. Частота терапевтического вмешательства ветеринарного персонала в группах вакцинированных поросят была в 2,11 раза реже, чем среди не вакцинированных животных.

Практические предложения.

Список опубликованных работ.

studfiles.net

Смотрите также

• 
  Вакцина от свиного гриппа 2016
• 
  Вакцина от герпеса 6 типа
• 
  Лучшие вакцины для кошек 2017
• 
  Куда делают вакцину от столбняка
• Контаминация вакцины может быть причиной
• 
  Вакцина против энтерококковой инфекции телят
• 
  Вакцина от гриппа перед беременностью
• 
  Томский институт вакцин и сывороток
• 
  Вакцина от кальцивироза для кошек
• 
  Дерматит нодулярный у коров вакцина
• 
  Вакцина бцж живая или убитая