 |
|
|
|||||||||
|
Способ получения антирабической вакцины. Вакцинный штамм для получения антирабической вакцины выращиваютСпособ получения антирабической вакцины
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антирабической вакцины. Цель изобретения повышение чистоты целевого продукта, а также повышение надежности инактивации вируса. Для осуществления способа штамм вируса бешенства "Внуково 32" выращивают в культуре клеток, собирают вируссодержащую жидкость, инактивируют ее последовательной обработкой ультрафиолетовыми лучами и формалином. Инактивированный вирус подвергают концентрированию и очистке с помощью ультрафильтрации через пористые мембраны и гель-фильтрации на пористых кремнеземах, модифицированных поливинилпирролидоном. 1 з.п.ф-лы, 2 табл. Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению противовирусных вакцин. Цель изобретения повышение чистоты целевого продукта, а также надежности инактивации вируса. Способ осуществляют следующим образом. Производственный штамм вируса бешенства "Внуково-32" выращивают в культуре первичных клеток почек сирийского хомяка, полученную вируссодержащую культуральную жидкость собирают в бутыли по 15-18 л и для освобождения от клеточного детрита осветляют пропусканием через пористые мембраны с диаметром пор 1900-2000 нм. Осветленную вирусную взвесь инактивируют ультрафиолетовыми лучами в аппарате-иррадиаторе, где расстояние поступающей на вращающийся металлический круг вирусной суспензии от ультрафиолетовых ламп составляет 18 см, скорость вращения круга 20 об/мин. Затем к инактивированной ультрафиолетовыми лучами вирусной взвеси добавляют формалин из расчета 1 мл формалина на 8 л вирусной взвеси, что соответствует концентрации 0,0116-0,0125% взвесь тщательно перемешивают и помещают на 20-22 ч в холодильную камеру при 4оС. Инактивированную взвесь концентрируют на ультрафильтрационном аппарате с тангенциальным потоком жидкости с площадью фильтрующей поверхности мембран 1 2 м2. Диаметр пор мембран 40-60 нм. Давление на внутреннюю поверхность мембран 0,5-0,7 атм. Концентрирование продолжают 1-2 ч до уменьшения объема вируссодержащей жидкости в 45-50 раз. Для удаления вирусных частиц, адсорбировавшихся в пpоцессе концентрирования на внутренней поверхности мембран, в течение 10 мин проводят барботаж, заключающийся в попеременном закачивании в ультрафильтрационный аппарат концентрата и стерильного воздуха, дальнейшее концентрирование жидкости при этом не происходит. Концентрированную вирусную взвесь собирают в сосуд и проводят очистку ее на колонке с пористым кремнеземом МПС-1М-1000, модифицированным поливинилпирролидоном. Используют колонки размером 5,6 х 85 см с 2,1 л кремнезема в трис-фосфатном буфере, рН 7,8. Один цикл гель-фильтрации позволяет очистить 250 мл концентрированной вирусной взвеси и получить 400 мл очищенного пpепарата, содержащего не более 160 мкг/мл примесных белков и имеющего относительную иммуногенность не менее 2,5 МЕ. К полученному очищенному концентрату добавляют человеческий альбумин в трис-НСl буфере до конечной концентрации 0,05% сахарозу до конечной концентрации 7,5% желатозу до 1,0% разливают в ампулы по 1,5 мл и подвергают лиофильной сушке. Сухой препарат хранят при 4оС. П р и м е р. Изготовление антирабической вакцины серии N 6. Вируссодержащую культуральную жидкость штамма вируса бешенства "Внуково-32", полученную в культуре клеток почек серийского хомяка в объеме 40 л, осветляют путем фильтрации через лавсановые мембраны с диаметром пор 2000 нм, инактивируют в аппарате-иррадиаторе ультрафиолетовых лучей, добавляют 5 мл формалина (конечная концентрация 0,016-0,0125%) и выдерживают в течение 20 ч при 4оС. Содержание белка 5,6 мг/мл; относительная иммуногенность в опыте на мышах 0,6 МЕ. Концентрирование проводят на ультрафильтрационном аппарате с тангенциальным потоком жидкости с площадью фильтрующей поверхности 2 м2. В качестве фильтрующих мембран используют пористые лавсановые фильтры с порами диаметром 40-60 нм. Давление 0,5 атм. Через 2 ч концентриpования объем концентрата доводят до 800 мл (содержание белка 10 мг/мл; относительная иммуногенность 4,09 МЕ), после чего в течение 10 мин проводят барботаж, заключающийся в попеременном закачивании в фильтрационный аппарат концентрата и стерильного воздуха, концентрирование жидкости при этом не происходит. Содержание белка увеличивается до 15 мг/мл; относительная иммуногенность 7,0 МЕ. Очистку концентрированного вируса проводят на колонке с модифицированным поливинилпирролидоном МПС-1М-1000. После трех последовательных циклов гель-фильтрации получают 1200 мл очищенного концентрата, содержащего 140 мкг/мл белка, имеющего относительную иммуногенность на мышах 3,5 МЕ. К полученному очищенному концентрату добавляют человеческий альбумин в трис-НСl буфере до конечной концентрации 0,05% сахарозу до 7,5% желатозу до 1,0% разливают в ампулы по 1,5 мл, замораживают при -60оС, высушивают по вакуумом. Сухой препарат хранят при 4оС. Способ обеспечивает получение антирабической вакцины с повышенной надежностью инактивации и высокой иммуногенной активностью. Результаты испытания вакцины приведены в табл.1 и 2. Формула изобретения 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ путем выращивания вакцинного штамма вируса бешенства "Внуково-32" в культуре клеток с последующей инактивацией вируссодержащей жидкости ультрафиолетовыми лучами, концентрированием и высушиванием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, концентрирование и очистку вируссодержащей жидкости осуществляют последовательно путем ультрафильтрации через пористые мембраны с диаметром пор 40 60 нм в тангенциальном потоке жидкости, а затем гель-фильтрации на пористых кремнеземах, модифицированных поливинилпирролидоном. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью повышения надежности инактивации вируса, после инактивации ультрафиолетовыми лучами суспензию вируса обрабатывают формалином в конечной концентрации 0,0116 0,0125% от объема суспензии вируса.MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе Дата прекращения действия патента: 30.01.2003 Извещение опубликовано: 10.07.2008 БИ: 19/2008 www.findpatent.ru Способ получения антирабической вакцины — SU 1367487Формула1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ путем выращивания вакцинного штамма вируса бешенства "Внуково-32" в культуре клеток с последующей инактивацией вируссодержащей жидкости ультрафиолетовыми лучами, концентрированием и высушиванием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, концентрирование и очистку вируссодержащей жидкости осуществляют последовательно путем ультрафильтрации через пористые мембраны с диаметром пор 40 60 нм в тангенциальном потоке жидкости, а затем гель-фильтрации на пористых кремнеземах, модифицированных поливинилпирролидоном.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью повышения надежности инактивации вируса, после инактивации ультрафиолетовыми лучами суспензию вируса обрабатывают формалином в конечной концентрации 0,0116 0,0125% от объема суспензии вируса. ОписаниеИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению противовирусных вакцин.Цель изобретения повышение чистоты целевого продукта, а также надежности инактивации вируса.Способ осуществляют следующим образом. Производственный штамм вируса бешенства "Внуково-32" выращивают в культуре первичных клеток почек сирийского хомяка, полученную вируссодержащую культуральную жидкость собирают в бутыли по 15-18 л и для освобождения от клеточного детрита осветляют пропусканием через пористые мембраны с диаметром пор 1900-2000 нм. Осветленную вирусную взвесь инактивируют ультрафиолетовыми лучами в аппарате-иррадиаторе, где расстояние поступающей на вращающийся металлический круг вирусной суспензии от ультрафиолетовых ламп составляет 18 см, скорость вращения круга 20 об/мин. Затем к инактивированной ультрафиолетовыми лучами вирусной взвеси добавляют формалин из расчета 1 мл формалина на 8 л вирусной взвеси, что соответствует концентрации 0,0116-0,0125% взвесь тщательно перемешивают и помещают на 20-22 ч в холодильную камеру при 4оС. Инактивированную взвесь концентрируют на ультрафильтрационном аппарате с тангенциальным потоком жидкости с площадью фильтрующей поверхности мембран 1 2 м2. Диаметр пор мембран 40-60 нм. Давление на внутреннюю поверхность мембран 0,5-0,7 атм. Концентрирование продолжают 1-2 ч до уменьшения объема вируссодержащей жидкости в 45-50 раз. Для удаления вирусных частиц, адсорбировавшихся в пpоцессе концентрирования на внутренней поверхности мембран, в течение 10 мин проводят барботаж, заключающийся в попеременном закачивании в ультрафильтрационный аппарат концентрата и стерильного воздуха, дальнейшее концентрирование жидкости при этом не происходит. Концентрированную вирусную взвесь собирают в сосуд и проводят очистку ее на колонке с пористым кремнеземом МПС-1М-1000, модифицированным поливинилпирролидоном. Используют колонки размером 5,6 х 85 см с 2,1 л кремнезема в трис-фосфатном буфере, рН 7,8. Один цикл гель-фильтрации позволяет очистить 250 мл концентрированной вирусной взвеси и получить 400 мл очищенного пpепарата, содержащего не более 160 мкг/мл примесных белков и имеющего относительную иммуногенность не менее 2,5 МЕ. К полученному очищенному концентрату добавляют человеческий альбумин в трис-НСl буфере до конечной концентрации 0,05% сахарозу до конечной концентрации 7,5% желатозу до 1,0% разливают в ампулы по 1,5 мл и подвергают лиофильной сушке. Сухой препарат хранят при 4оС.П р и м е р. Изготовление антирабической вакцины серии N 6.Вируссодержащую культуральную жидкость штамма вируса бешенства "Внуково-32", полученную в культуре клеток почек серийского хомяка в объеме 40 л, осветляют путем фильтрации через лавсановые мембраны с диаметром пор 2000 нм, инактивируют в аппарате-иррадиаторе ультрафиолетовых лучей, добавляют 5 мл формалина (конечная концентрация 0,016-0,0125%) и выдерживают в течение 20 ч при 4оС. Содержание белка 5,6 мг/мл; относительная иммуногенность в опыте на мышах 0,6 МЕ.Концентрирование проводят на ультрафильтрационном аппарате с тангенциальным потоком жидкости с площадью фильтрующей поверхности 2 м2. В качестве фильтрующих мембран используют пористые лавсановые фильтры с порами диаметром 40-60 нм. Давление 0,5 атм. Через 2 ч концентриpования объем концентрата доводят до 800 мл (содержание белка 10 мг/мл; относительная иммуногенность 4,09 МЕ), после чего в течение 10 мин проводят барботаж, заключающийся в попеременном закачивании в фильтрационный аппарат концентрата и стерильного воздуха, концентрирование жидкости при этом не происходит. Содержание белка увеличивается до 15 мг/мл; относительная иммуногенность 7,0 МЕ.Очистку концентрированного вируса проводят на колонке с модифицированным поливинилпирролидоном МПС-1М-1000. После трех последовательных циклов гель-фильтрации получают 1200 мл очищенного концентрата, содержащего 140 мкг/мл белка, имеющего относительную иммуногенность на мышах 3,5 МЕ. К полученному очищенному концентрату добавляют человеческий альбумин в трис-НСl буфере до конечной концентрации 0,05% сахарозу до 7,5% желатозу до 1,0% разливают в ампулы по 1,5 мл, замораживают при -60оС, высушивают по вакуумом. Сухой препарат хранят при 4оС.Способ обеспечивает получение антирабической вакцины с повышенной надежностью инактивации и высокой иммуногенной активностью.Результаты испытания вакцины приведены в табл.1 и 2.Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антирабической вакцины. Цель изобретения повышение чистоты целевого продукта, а также повышение надежности инактивации вируса. Для осуществления способа штамм вируса бешенства "Внуково 32" выращивают в культуре клеток, собирают вируссодержащую жидкость, инактивируют ее последовательной обработкой ультрафиолетовыми лучами и формалином. Инактивированный вирус подвергают концентрированию и очистке с помощью ультрафильтрации через пористые мембраны и гель-фильтрации на пористых кремнеземах, модифицированных поливинилпирролидоном. 1 з.п.ф-лы, 2 табл. Рисунки Заявка4017807/13, 29.01.1986 Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР Аксенова Т. А, Эльберт Л. Б, Селимов М. А, Красильников И. В, Кротова Л. И, Грибенча Л. Ф МПК / МеткиМПК: A61K 39/205 Метки: вакцины, антирабической Опубликовано: 27.10.1995 Код ссылки<a href="http://patents.su/1-1367487-sposob-polucheniya-antirabicheskojj-vakciny.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения антирабической вакцины</a> Похожие патенты patents.su Способ получения вакцины против бешенства и чумы плотоядныхОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУИзобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способам получения вакцин для иммунизации собак. В настоящее время существует ряд инактивированных вакцин против бешенства собак, выпускаемых в разных странах. Наиболее иммуногенными являются культуральные вакцины фирмы "Мерье" (Франция) [1] и культуральная вакцина из штамма "Внуково-32" (ИПВЭ РАМН) [2] Известны также высококачественные культуральные живые аттенуированные вакцины против чумы плотоядных. Одной из лучших считается вакцина "Вакчум", разработанная в ИПВЭ РАМН [3] В настоящее время наблюдается тенденция перехода от одновалентных вакцин к поливалентным, так как при этом меньше травмируется животное и обеспечивается лучшая возможность соблюдать правила антисептики. Ассоциированной вакцины против бешенства и чумы плотоядных в литературе не описано. В основу изобретения положена задача создания вакцины, вырабатывающей иммунитет у собак как к вирусу бешенства, так и к вирусу чумки (чумы плотоядных). Задача решена предлагаемой вакциной "Дивак", представляющей собой смесь двух вакцин на стадии жидкого полуфабриката: против чумы плотоядных - 1oC1,1 часть, против бешенства 1,9oC2 части. Антирабическая вакцина представляет собой вакционный вирус бешенства, штамм "Внуково-32", выращенный в первичной клеточной культуре клеток сирийского хомяка или в клетках перевиваемой линии 4647 и инактивированный ультрафиолетовыми лучами (УФ-лучами). Вакцина против чумы плотоядных "Вакчум" это живой аттенуированный вирус штамм "Рокборн", аттенуированный в культуре первичных клеток почечной ткани зеленых мартышек или в клетках 4647. Авторам удалось, впервые в вирусологической практике, ассоциировать живую и убитую вакцины. Это стало возможным благодаря тому, что инактивация антирабической вакцины осуществляется УФ-лучами и вакцина не содержит формалина или других инактиваторов, убивающих вирус второго компонента. Предлагаемая вакцина находит широкое применение в связи с большим количеством служебных и домашних собак ценных пород. Она разрешена к применению Главветупром Министерства сельского хозяйства. Утверждены также Технические условия ТУ-08064-19-22-95 и инструкции по изготовлению и контролю. Способ осуществляют следующим образом. Получение антирабической вакцины. Адаптацию аттенуированного штамма "Внуково-32" проводят в культуре первичных клеток почки сирийского хомяка. Монослой клеток почки сирийского хомяка, выращенный при температуре 37±1oC, отмывают два раза рабочим раствором Эрла и инфицируют вируссодержащей культуральной жидкостью (штамм "Внуково-32") в дозе 0,001 LD50 на одну клетку. Аналогично поступают в случае с клетками 4647. Сорбция вируса проходит при 37o±1oC в течение 1 ч. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла, содержащую 0,2oC0,22% ростовых протеинов. Зараженные клетки инкубируют при 32o±1oC, через 3 сут проводят смену поддерживающей среды и еще через 3 сут собирают урожай вируса. Вируссодержащий материал сохраняют при -20±1oC и после соответствующих контрольных исследований на бактериальную и микологическую стерильность производят фильтрацию вируса, затем инактивацию его ультрафиолетовыми лучами, на аппарате иррадиаторе ультрафиолетовых лучей со скоростью 20 21 об/мин, на расстоянии 18 20 см, в слое 1 1,1 мм. Получение вакцины против чумы плотоядных "Вакчум". Адаптацию аттенуированного штамма "Рокборн" вируса чумы плотоядных к культуре почечной ткани зеленых мартышек проводят в течение 8 10 пассажей при температуре 34 ± 0,2oC, доводя инкубационный период развития вируса до 4 5 дн. На основе адаптированного вируса готовят посевной вирус. Система посевного вируса предусматривает приготовление в большом объеме вакционного вируса, отвечающего всем требованиям аттенуированного штамма, сохранение его в жидком азоте и использование по мере необходимости для изготовления вакцины. Для производства вакцины используют культуру клеток почечной ткани зеленых мартышек или перевиваемой линии 4647. Выращивание вакционного вируса в указанных культурах ведут при температуре 34 ± 0,2oC на средах с добавлением 5±0,2% сыворотки крупного рогатого скота. Вируссодержащую жидкость удаляют 3 5 раз, заменяя ее свежей питательной средой, причем первое удаление производят после появления цитопатологических изменений в 30 40% клеток, и повторяют эту операцию до полной дегенерации клеток. Сборы вируссодержащей жидкости объединяют и освобождают от детрита. Получение ассоциированной вакцины против бешенства и чумы плотоядных. Полуфабрикаты вакцины против чумы плотоядных и антирабической вакцины смешивают в соотношении 1 oC 1,1 часть вакцины против чумы плотоядных + 1,9 oC 2 части антирабической вакцины, добавляют 10%-ный раствор желатозы до конечной концентрации 1 ± 0,1% и 40%-ный раствор сорбита до конечной концентрации 5±0,1% Затем разливают вакцину по (3,0±0,1) мл и лиофилизируют. Все этапы процесса изготовления вакцины (Дивак) проводят в стерильных условиях. Препарат, полученный после лиофилизации, подвергают биологическим испытаниям, и при получении благоприятных результатов препарат считают вакциной, готовой к использованию. Высокая иммуногенность и низкая реактогенность обоих компонентов вакцины, выращенных в культуре клеток, а также применяемый способ инактивации вируса бешенства ультрафиолетом, дающий возможность соединения его с живым вирусом чумы плотоядных, позволяют впервые в мире создать высокоэффективную ассоциированную вакцину этих двух вирусов вакцину нового поколения. Эта вакцина уже сейчас применяется в ветеринарной практике (в 1992 94 гг использовано 25 000 доз вакцины) и найдет широкое применение в дальнейшем, как в России, так и в странах СНГ и дальнем зарубежье. Вся технологическая документация и инструкция по применению утверждены соответствующими инстанциями. Серийное производство вакцины осуществляется на экспериментально-производственном предприятии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.
Способ получения вакцины против бешенства и чумы плотоядных, отличающийся тем, что антирабическую вакцину "Внуково 91", инактивированную УФ-лучами, и вакцину против чумы плотоядных "Вакчум" смешивают в соотношении 1:1,9 - 1,1: 2,0, после чего добавляют раствор желатозы до конечной концентрации 10±0,1% и 40%-ный раствор сорбита до конечной концентрации 5±0,1% и лиофилизируют. bankpatentov.ru Способ получения антирабической вакцины
Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин. Способ включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса и последующее приготовление целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21. При этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50. Полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства "Щелково-51" проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38oС. При более производительном и технологическом способе изготовления вакцина обладает большей иммуногенной потенцией и более надежно будет защищать животных от бешенства. Этот эффект объясним тем, что в результате термообработки в популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. 1 з.п.ф-лы, 1 табл. Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин против бешенства животных. Известен способ получения антирабической вакцины, включающий репродукцию вируса бешенства штамм "Щелково-51" в культуре перевиваемых клеток ВНК-21, внесение по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию стабилизатора - полиакриловую кислоту или ее соль, затем инактиватора - димер этиленимина ((ДЭИ) до концентрации 0,1-0,3%, инкубации смеси при 37oС в течение 20-24 ч с последующей расфасовкой полученной вакцины для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде ((RU 2134590 С, опубл. 20.08.1999). Однако в известном способе ДЭИ используют в высокой концентрации, что приводит к значительной потере первоначальной иммуногенной активности вируса в процессе изготовления вакцины. Кроме того, в получаемом материале, особенно на первых этапах репродукции, содержится значительное количество неполноценных дефектных вирионов, что не в полной мере способствует проявлению иммуногенной потенции штамма "Щелково-51". Наиболее близким аналогом является способ получения антирабической вакцины, включающий репродукцию штамма вируса бешенства "Щелково-51" в культуре перевиваемых клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию инактиватора бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при температуре 4-6oС в течение 2-4 ч с последующим добавлением стабилизирующей среды на основе пептона, сахарозы и желатина, и адъюванта сапонина (RU 955577 А, опубл. 15.08.1994). Недостатком ближайшего аналога является то, что по существующей технологии обязательна стадия получения посевного материала путем размножения вируса "Щелково-51" в мозге овец. Из-за значительной инфицированности овец возбудителем скрейпи существует постоянная угроза его попадания с мозговой тканью в состав изготовляемой вакцины, как следствие этого, распространение прионовой инфекции среди прививаемого поголовья сельскохозяйственных и домашних животных. Поэтому процесс получения мозгового посевного материала является очень ответственной, трудоемкой и дорогостоящей операцией, связанной с тщательным отбором животных и контролем мозговой вируссодержащей ткани и изготовленных серий вакцины на наличие посторонних агентов. Задачей изобретения является усовершенствование промышленной технологии производства антирабической вакцины из штамма "Щелково-51". Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины, сокращении затрат, повышении иммуногенности и безопасности получаемой вакцины за счет получения полноценных вирионов с полным спектром антигенов и исключения возможности включения в ее состав возбудителя скрейпи. Сущность изобретения. Способ получения антирабической вакцины включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, и отличается тем, что посевной материала получают в культуре клеток ВНК-21, при этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50, а полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства "Щелково-51" проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38oС. Для получения посевного материала полностью исключаются овцы. В результате термообработки в термостабильной популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. Кроме того, эффективность культивирования вируса, прошедшего термическую стадию обработки, значительно выше по сравнению с контролем, что проявляется как в динамике накопления вируса, так и в повышении выхода вируса в целом (увеличивается количество сборов вируса). Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологичном способе изготовления обладают большей иммуногенной потенцией и более надежно будут защищать животных от бешенства. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример. Для приготовления вакцины используют культуру перевиваемых клеток ВНК-21, которую получают роллерным способом в виде кругового монослоя в бутылях. В качестве ростовой и поддерживающей питательной среды используют среду на основе среды 199, среды Игла и 10%-ной нативной сыворотки крупного рогатого скота. 2-3-суточный монослой клеток отделяют от поверхности стекла бутылей общепринятым способом, например с помощью версена и трипсина, и ресуспендируют в ростовой среде. Полученную клеточную взвесь заражают посевным материалом, подготовленным следующим образом: исходный производственный штамм вируса бешенства "Щелково-51" подвергают термообработке до сохранения им инфекционной активности от 0,0001 до 0,001% интрацеребральных мышиных ЛД50. Для этого первично репродуцированный вирус пассируют в культуре клеток ВНК-21 при температуре 37,5oС в течение 140-160 ч. Далее вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют в качестве посевного материала для инфицирования и репродуцирования в культуре клеток ВНК-21. Культивирование осуществляют роллерным способом при температуре 37oС. Затем проводят сбор вируссодержащей жидкости на 2, 3, 4, 5 и 6 сутки культивирования. Замену ростовой питательной среды проводят после каждого сбора вируса. Начиная с 4-х суток культивирования включение сыворотки крупного рогатого скота в состав питательной среды не требуется. Полученные сборы инактивируют известным способом, например бетапропиолактоном или ДЭИ. Для изготовления сухих антирабических вакцин к 2-м частям инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют 1 часть среды высушивания. Для изготовления жидкой антирабической вакцины к инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют адъювант - 6%-ную гидроокись алюминия. Готовые вакцины проходят биологический контроль на белых мышах по методу NIH (Института здравоохранения США). Индексы иммуногенности вакцин, полученных согласно изобретению, намного выше, чем у вакцин, полученных по известным технологиям. Данные контроля приведены в таблице. Как видно из таблицы, полученная вакцина имеет высокую иммуногенную активность при более производительном и технологичном способе изготовления.Формула изобретения 1. Способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала из штамма вируса "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, отличающийся тем, что посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21, при этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения им в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50, а полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что термическую обработку проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38oС.РИСУНКИ Рисунок 1QZ4A - Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения Лицензиар(ы): Красуткин Сергей Николаевич, Мельник Николай Васильевич, Скичко Николай Данилович, Зенов Николай Иванович, Иванов Виктор Серафимович Вид лицензии*: НИЛ Лицензиат(ы): ФГУП "ЩЕЛКОВСКИЙ БИОКОМБИНАТ" Характер внесенных изменений (дополнений):Прекращение действия договора по обоюдному согласию сторон Номер и год публикации бюллетеня: 12-2004 Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 11.11.2002 № 15471 Извещение опубликовано: 27.04.2004 * ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе Дата прекращения действия патента: 21.12.2004 Извещение опубликовано: 20.02.2006 БИ: 05/2006 QZ4A - Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения Лицензиар(ы): Открытое акционерное общество "Институт биотехнологий ветеринарной медицины" Вид лицензии*: НИЛ Лицензиат(ы): Федеральное государственное предприятие "ЩЕЛКОВСКИЙ БИОКОМБИНАТ" Характер внесенных изменений (дополнений):Срок действия договора №18591/04 продлен до 04.03.2014 Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 04.03.2004 № 18591 Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009 * ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия www.findpatent.ru Способ получения антирабической вакциныИзобретение относится к области биотехнологии. Перевиваемые клетки ВНК-21 инфицируют вирусом из расчета 0,01-0,001 ММЛД 50/клетку, размножают в течение 36-70 часов во взвешенном состоянии. Затем высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×105 клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см2 микроносителей. Культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости. Полученная вакцина обладает высокой иммуногенной активностью, а способ ее изготовления - высокой производительностью. 1 табл.
Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при крупномасштабном производстве высокоиммуногенных безвредных вакцин против бешенства животных. Способ включает приготовление посевного материала на основе вируса бешенства штамм «Щелково-51» и культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Клетки ВНК-21 инфицируют культуральным матровым вирусом и в присутствии вируса размножают во взвешенном состоянии в биореакторе, а затем размноженные инфицированные клетки используют в качестве комплексного посевного материала, который высевают в реактор на поверхность микроносителей, где в клетках, образовавших клеточный пласт, осуществляют дальнейшую репродукцию вируса. При этом клетки ВНК-21 инфицируются вирусом из расчета 0,01-0,001 MM ЛД/клетку, размножают в течение 36-70 часов во взвешенном состоянии, высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×105 клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см2 микроносителей, причем культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток, с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости. При более производительном и технологическом способе изготовления вакцина обладает большей иммуногенной потенцией и более надежно будет защищать животных от бешенства. Этот эффект объясним тем, что при реализации нового способа создаются более комфортные условия для размножения вируса и получения большего количества полноценного иммуногена в более ранние сроки культивирования. Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при крупномасштабном производстве высокоиммуногенных безвредных вакцин против бешенства животных. Известен способ получения антирабической вакцины, включающий использование вируса бешенства штамм "Щелково-51", культивирование которого осуществляют, вначале пассируя вирус в роллерном монослое клеток ВНК-21 в течение 112-126 часов, а затем размножая вирус в мозге овец, путем интрацеребрального заражения животных, с последующим применением мозговой ткани в качестве вируссодержащего посевного материала для инфицирования посевной роллерной расплодки клеток, которые затем высевают в роллерные бутыли и культивируют в течение 112-128 часов, получая при этом три сбора вируссодержащей культуральной жидкости, пригодной для изготовления антирабической вакцины с иммуногенностью, не уступающей международному стандарту - 1,0 МЕ/мл (патент РФ 965049, зарегистрирован 11 января 1993 г.). Недостатком этого способа является то, что обязательной стадией технологического процесса является размножение вируса в мозге овец. Из-за значительной инфицированности овец возбудителем скрейпи существует постоянная угроза его попадания с мозговой тканью в состав изготовляемой вакцины и, как следствие этого, распространение прионовой инфекции среди прививаемого поголовья животных. Наиболее близким аналогом является способ получения антирабической вакцины, согласно которому репродуцированный в роллерном монослое культуры перевиваемых клеток ВНК-21 вирус бешенства подвергают термической обработке до сохранения им в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50, затем термообработанный вирус вновь размножают в названной клеточной системе и полученную вируссодержащую культуральную жидкость используют в качестве производственного посевного материала для заражения производственной роллерной расплодки клеток ВНК-21. Инфицированные клетки производственной расплодки вновь высевают на примерно учетверенное количество бутылей, где они культивируются в течение 5-6 суток, с проведением трех сборов вируссодержащей культуральной жидкости, пригодной для изготовления сухих и жидких антирабических вакцин с иммуногенностью 2,3-2,5 МЕ/мл. Этот способ исключает возможность включения в состав конечного продукта мозговой ткани овец и, следовательно, возбудителя скрейпи. Этим он выгодно отличается от предыдущего аналога (Патент РФ 2191600, зарегистрирован 27 октября 2002 г.). Недостатком ближайшего аналога является то, что его промышленная реализация сопровождается очень трудоемкими и многочисленными операциями, связанными с раздельным получением вирусного и клеточного производственного посевного материала в роллерных бутылях, а также с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и индивидуальной боксовой работы с каждым из них. Многократное манипулирование с бутылями, содержащими чистые клетки и клетки, инфицированные вирусом бешенства, увеличивает вероятность бактериального загрязнения вакцинного сырья и обусловливает необходимость тщательного контроля каждого сбора вируса из каждого сосуда культивирования. Все это приводит к удорожанию конечного продукта и затрудняет производство препарата на должном качественном уровне, в необходимых для ветеринарной практики количествах. Задачей изобретения является усовершенствование промышленной технологии производства антирабической вакцины из штамма "Щелково-51". Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины, сокращении затрат, повышении производительности труда и иммуногенности продукта за счет создания более комфортных условий для размножения вируса и получения большего количества полноценного иммуногена в более ранние сроки его репродукции. Сущность изобретения. Способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала на основе вируса бешенства штамм "Щелково-51" и культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, отличается тем, что клетки ВНК-21 инфицируют культуральным матровым вирусом и в присутствии вируса размножают во взвешенном состоянии в биореакторе, а затем размноженные инфицированные клетки используют в качестве комплексного посевного материала, который высевают в реактор на поверхность микроносителей, где в клетках, образовавших клеточный пласт, осуществляют дальнейшую репродукцию вируса, и отличается тем, что клетки ВНК-21 инфицируют вирусом из расчета 0,01-0,001 ММЛД 50/клетку, размножают в течение 36-70 часов во взвешенном состоянии в биореакторе, высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×105 клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см2 микроносителей, причем культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток, с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости. При производстве вакцины полностью исключается необходимость проведения специальной операции для получения вирусного посевного материала, как мозгового так и термообработанного, а также масштабной расплодки чистых клеток ВНК-21 для получения производственного посевного клеточного материала. Кроме этого, практически полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций, связанных с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и многократной боксовой работой с каждым из них. Увеличивается также количество сборов вируса и иммуногенность приготовленных из них антирабических вакцин. Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологическом способе изготовления, обладают большей иммуногенной потенцией и, следовательно, будут более надежно защищать животных от бешенства. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример: для приготовления вакцины используют сухой культуральный матровый вирус бешенства штамм "Щелково-51" с титром, например, 6,3 lg ММЛД 50/мл и перевиваемые клетки ВНК-21, выращенные, например, в 10-роллерных бутылях. К снятым со стекла 6,0×109 клеткам добавляют 10 мл вируса. После этого клетки, инфицированные вирусом в дозе 0,003 ММЛД 50/клетку, вносят в 100-литровый реактор, содержащий 20 литров питательной среды, приготовленной на основе сред: Игла, 199, гидролизата лактальбумина и сыворотки крови крупного рогатого скота. Инфицированные клетки выращивают при постоянном вращении мешалки со скоростью 100-120 об/минуту, с подачей в жидкую фазу стерильного воздуха. В нашем конкретном примере, через 45 часов культивирования общее количество клеток в реакторе достигло величины - 3,2×1010. После их осаждения и удаления отработанной питательной среды в реактор вносят 60 литров свежей питательной среды и микроносители, например Цитодекс-2, с общей полезной поверхностью около 150000 см2. На каждый 1 см2 носителя пришлось 2,1×105 клеток и 0,4 мл питательной среды. Дальнейшее культивирование инфицированных клеток проводят на поверхности микроносителей, при постоянном вращении мешалки со скоростью 50-70 об/мин, с проведением сборов вируссодержащей жидкости через каждые 24 часа, с одновременной заменой питательной среды. При этом в состав питательной среды вначале вносят 10% сыворотки, а затем на 2, 3, 4, 5 сутки культивирования - 7%, 3%, 2%, 0% соответственно. Объем каждого сбора составляет 55-56 литров. Всего получено из одного сосуда культивирования (100-литрового реактора) 6 сборов вируссодержащего материала, общим объемом около 330 литров. В контроле при получении вируссодержащего материала по известному способу (ближайший аналог) с одного сосуда культивирования (5-ти литровой бутыли) также было получено 6 сборов, по 0,5-0,6 литров в каждом. Из полученного вируссодержащего материала были приготовлены инактивирования β-пропиолактоном сухие и жидкие антирабические вакцины и исследованы рекомендованным ВОЗ методом национальных институтов здоровья США - NIH, с целью сравнительной оценки их иммуногенной потенции. Как видно из представленной таблицы, вакцины, полученные согласно изобретению, обладают большей иммуногенностью при более производительном и технологичном способе изготовления.
Способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала на основе вируса бешенства штамм "Щелково-51" и культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, отличающийся тем, что клетки ВНК-21 инфицируют культуральным матровым вирусом из расчета 0,01-0,001 ММЛД 50/клетку, размножают в течение 36-70 ч во взвешенном состоянии в биореакторе, а затем высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×105 клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см2 микроносителей, причем культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости. www.findpatent.ru СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫИзобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики и, в частности, для получения вакцины против бешенства животных. Известен способ получения антирабической вакцины для животных, включающий приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства, инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей суспензии с последующим ее инактивацией и приготовлением целевого продукта. Инактивацию вируса проводят β-пропиолактоном (Патент РФ №2287343. «Способ получения антирабической вакцины», МПК A61K 39/205, Бюл. №26, 31.05.2005). Недостатками известной вакцины являются сложность сбора вируссодержащей суспензии, недостаточный срок хранения целевого продукта. Задачей заявленного технического решения является упрощение способа и повышение качества продукта за счет увеличения срока хранения целевого продукта. Поставленная задача решается в способе получения антирабической вакцины для животных, включающем приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства, инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей суспензии с последующей ее инактивацией и приготовлением целевого продукта тем, что инактивацию проводят добавлением к вируссодержащей суспензии этанола в конечной концентрации 18-20%, экспозицией 20-22 часа при температуре 36-37 °С при постоянном перемешивании, далее добавляют 4-6%-ную гидроокись алюминия в соотношении к реакционной смеси 1:(4,5-5,0). В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна». Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо». Нами впервые установлено, что инактивация вируссодержащей суспензии при определенных режимах этанолом приводит к получению целевого продукта без потери иммунологически активного материала, а это недопустимо при производстве эффективной инактивированной антирабической вакцины для животных, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - упрощение и ускорение способа, увеличение срока хранения целевого продукта без потери его качества, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень». Способ иллюстрируется на следующих примерах. Пример 1. Культивирование зараженных вирусом бешенства клеток ВНК-21 проводят в суспензии в 10-литровом биореакторе при постоянном перемешивании. Через 1,2 и 3 сутки отбирают пробы для контроля инфекционной активности и отсутствия контаминации посторонней микрофлорой. По достижении титра инфекционности вируса 7,0 lg ЛД50/см3 к вируссодержащей суспензии добавляют при постоянном перемешивании 96%-ный водный раствор этанола до конечной его концентрации 18%, при этом продолжается перемешивание суспензии и поддержание температуры 36 °С. Через 20 ч к вируссодержащей суспензии с инактивированным вирусом добавляют 4%-ную гидроокись алюминия в соотношении к реакционной смеси 1:4,5. Пример 2. Культивирование инфицированных клеток проводят, как в примере 1, но к 7 л вируссодержащей суспензии добавляют 98%-ный водный раствор этанола до конечной концентрации 20%, при этом продолжаются перемешивание суспензии и поддержание температуры 37 °С. Через 22 ч к вируссодержащей суспензии с инактивированным вирусом добавляют 6%-ную гидроокись алюминия в соотношении к реакционной смеси 1:5,0. Контроль вакцин, полученных согласно примерам 1 и 2 (Сер-1 и Сер-2) относительно национальной референс-вакцины и прототипа на остаточную инфекционность проводили через 1,5 года хранения их путем интрацеребральной инокуляции исследуемого материала мышам массой 10-12 г. Иммуногенность исследовали методом NIH. Результаты выражали в международных единицах (ME). Антителоиндуцирующую активность определяли путем исследования сыворотки крови вакцинированных однократно в дозе 1 мл собак и кошек в реакции нейтрализации (рH). Сыворотку получали через 27 дней после иммунизации животных. рH проводили на мышах против стандартного вируса бешенства шт.CVS относительно национальной референс-сыворотки с активностью 20 МЕ/мл. Исходные серии вакцины (Сер-1 и Сер-2) не содержали в своем составе живого вируса бешенства и обладали практически одинаковой иммуногенной активностью при испытании их на мышах на уровне 2,53 МЕ/мл и 2,5 МЕ/мл соответственно. Через 18 месяцев хранения при 6-8 °С эти показатели снизились до 2,05 МЕ/мл и 2,1 МЕ/мл соответственно (на 16-19%), но продолжали отвечать международным требованиям, предъявляемым к антирабическим вакцинам, в то время как аналогичные показатели референс-вакцины и прототипа снизились на 40 и 55%, соответственно. Этанол в составе жидкой антирабической вакцины в концентрациях 18-20% полностью инактивировал инфекционность вируса и надежно защищал вакцину от случайных загрязнений посторонними агентами без потери иммунологически активного материала. Предлагаемая вакцина обладала высокой антителоиндуцирующей активностью для целевых животных. В сыворотке крови вакцинированных щенят и котят вакциной, хранившейся в течение 1,5 года в условиях бытового холодильника (6-8 °С), антитела определялись через 27 дней на уровне 3,4 МЕ/мл (щенята) и 2,2 (котята), что свидетельствует о надежной защите их от бешенства. Вакцина по своим качественным показателям соответствует самым строгим современным требованиям экологической и биобезопасности, она не содержит антибиотиков, ртутьсодержащих препаратов и β-пропиолактона. Сохраняет активность при длительном хранении и при широком температурном диапазоне. Пригодна для надежной защиты животных от бешенства. Вакцина является конкурентоспособной лучшим международным препаратам. Способ получения антирабической вакцины для животных, включающий приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства, инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей суспензии с последующей ее инактивацией и приготовлением целевого продукта, отличающийся тем, что инактивацию проводят добавлением к вируссодержащей суспензии этанола в конечной концентрации 18-20%, экспозицией 20-22 часа при температуре 36-37 °С при постоянном перемешивании, далее добавляют 4-6%-ную гидроокись алюминия в соотношении к реакционной смеси 1:(4,5-5,0).edrid.ru Способ изготовления антирабической инактивированной вакцины для сельскохозяйственных животныхИзобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов. Используют штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) вируса бешенства, который вносят в культуральный сосуд (0.1-0.01 МЛД50/клетку) одновременно с катками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток (0.5-0.6 млн. кл/мл) и выращивают в суспензии. Культивирование проводят в суспензионной среде ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании и поддержании рН 7.2-7.4. Полученное вирусное сырье с инфекционной 6.5-6.8 lg МЛД50/мл и антигенной активностью 1:90-270 инактивируют 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом 0.01% при 37°С 3 суток. Готовый вакцинный препарат соответствует требованием стандарта для ветеринарных препаратов и обладает активностью 1.5-2.0 ME. 1 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов и может быть использовано в ветеринарии для профилактики бешенства среди животных. В современной биотехнологии антирабических вирусных препаратов используют различные вакцинные штаммы (Внуково-32, Щелково-51, Тс-80, РВ-97 и др.), которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах ВНК-21, ПС, Vero., и др., применяя различные методические приемы культивирования - стационарный, роллерный, суспензионный [R.Barth, V.Franke, M.A.Selimov Vnukovo-32 primary hamster kidney cell vaccines for humans. //Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization, Geneva 1996, C.310-313; Вишняков И.Ф., Никишин И.В., Недосеков В.В. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства//Ветеринария. – 1998 - №1 С.22-24; Патент 2077338 от 20.4.97. г. Никишин И.В., Вишняков И.Ф., Горшкова Т.Ф., Стрельцов Л.Ф., Жестерев В.И.; Иванов B.C. Бешенство животных: эксперементально-теоретическое обоснование разработки, производства, применения культуральных инактивированных вакцин и новые подходы к проблеме экстренной защиты ЦНС от возбудителя заболевания: Автореф. дис. д-ра вет. наук: М. 2001-20 с; Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.]. Известные способы получения вирусного сырья для изготовления инактивированных антирабических вакцин являются весьма трудоемкими, экономически не эффективными и не позволяют получать без дополнительных технологических приемов профилактические препараты требуемой биологической активности (низкое накопление инфекционной и антигенной активности). Наиболее близким аналогом является способ получения инактивированной антирабической вакцины из штамма (РВ-97) в суспензии клеток ВНК-21 с использованием инактиванта димерэтиленимина (Гочмурадов М.Г., Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.). Однако существующий способ приготовления вакцинного препарата технологически объемный и не позволяет получать на первичных этапах сырье требуемой биологической активности (инфекционная активность 6,0-6.5 lg ЛД50/мл, антигенная активность <1МЕ). Первоначально проводят подращивание клеток ВНК-21 до 1.2-1.8 млн. кл/мл; затем заражение их вирусом бешенства. Полученное вирусное сырье концентрируют в 2-3 раза до получения необходимой антигенной активности и инактивируют димерэтиленимином. В процессе выполняемых технологических этапов проводят 1-2 раза смену дорогостоящих питательных сред (Игла-МЕМ), вводят дополнительные этапы обработки - сепарирование, концентрирование и используют инактиванты, которые требуют особых условий работы с ними, поскольку высоко токсичны и сильные мутагены для работающего персонала (димерэтиленимин). Целью изобретения является разработка и усовершенствование технологичного способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства для животных без снижения ее иммунобиологических характеристик. Поставленная цель достигается тем, что способ включает культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, при этом в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0.1-0.01 МВД50/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0.25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0.01% 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6%-го ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%. Штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) получен из исходного “овечий” ВГНКИ - 80 пассаж в мозге овец и адаптирован к культуре клеток почки кролика и культуре клеток куриных фибробластов. Инфекционная активность штамма 4,5-5,5 lg МДД50/мл. Вирус вызывает образование антител у домашних и диких животных при оральном и парантеральном введении. Патогенен для лабораторных животных мышей и кроликов при внутримозговом заражении (Ковалев Н.А и др. Авторское свидетельство №1091393 от 08.01.1984 г.). Вирус вносят в культуральный сосуд одновременно с клетками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии. Культивирование проводят в суспензионной среде 0,25% ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании содержимого. Полученное вирусное сырье имеет инфекционную (6.5-6.8 lg МЛД50/мл) и антигенную активность (1.5-2.0 ME), достаточную для использования его в вакцине без дополнительных технологических приемов (сепарирование, концентрирование). Инактивацию вируса проводят безопасным и устойчивым препаратом 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодекан - (А-24) в концентрации 0.01-0.1% при 37°С в течение 3 суток. В качестве адъюванта добавляют 10-20% 6% ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%. Пример конкретного выполнения. Выращивание вируса бешенства штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) проводят в культуре ВНК-21 с концентрацией 0.5-0.6 млн. кл/мл с одновременным внесением вируса в дозе 0.1-0.01 МЛД50/кл в суспензионной среде 0,25% ФГМ в ферментерах реакторного типа при температуре 37°С и постоянном перемешивании содержимого, и автоматическом поддержанием рН среды в пределах 7.2-7.6. В течение первых трех суток наблюдается повышение концентрации инфицированных клеток до 1.5-2.5 млн. кл/мл, затем постепенная их гибель. Культивирование прекращают, когда жизнеспособных клеток во взвеси остается 18-20%. Время культивирования - 6 суток. Инфекционная активность вируса бешенства штамма РБ-71 к этому времени составляет 6.5-6.8 lg МДЦ50/мл. Антигенная активность вирусного сырья из штамма РБ-71 составляет 1:90-1:270 в реакции ИФА. Полученное вирусное сырье инактивировали А-24 в концентрации 0.01-0.1% в течение 3 суток при 37°С, затем добавляли 6% 10-20% гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 0.6% (таблица №1).
Использование предлагаемой технологии изготовления инактивированной вакцины против бешенства по сравнению с существующим способом имеет следующие преимущества. 1. Сокращает время получения вирусного сырья на 1-2 суток за счет одновременного внесения клеток и вируса в реактор. 2. Уменьшает расход дорогостоящей питательной среды в 2 раза за счет исключения этапа смены среды. 3. Снижает расход вирусного сырья в 5-10 раз и повышает накопление антигенной активности в вирусном сырье, достаточной для использования его для изготовления эффективного инактивированного препарата. 4. Исключает использование дополнительных технологических приемов - осаждение клеток, сепарирование, концентрирование без снижения характеристик получаемой вакцины. 5. Позволяет заменить импортную среду Игла MEM на не менее эффективную отечественную питательную среду из ферментативного гидролизата мышц (ФГМ). Способ изготовления антирабической инактивированной вакцины, включающий культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, отличающийся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0,1-0,01 МЛД50/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0,5-0,6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0,25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0,01%-ным 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6% гидроокиси алюминия до конечной концентрации сухого остатка 0,6-0,9%. www.findpatent.ru |
 г.Самара, ул. Димитрова 131 [email protected] |
 |