Почти универсальная вакцина для лечения рака? Вакцина для лечения

Лечение вакцинами и вирусами

Содержание статьи

Вакцина против рака

В онкологии лечение вакцинами предназначено для лечения рака, который уже диагностирован, а не для предотвращения его возникновения. Вакцина от рака воздействует на антигены, связанные с раком, чтобы усилить реакцию иммунной системы на опухолевые клетки пациента. Раковые антигены могут быть белками или молекулами другого типа, найденными на поверхности или внутри раковых клеток, которые могут стимулировать В-клетки-киллеры или Т-клетки, чтобы атаковывать их.

В настоящее время в стадии разработки находятся некоторые вакцины, которые нацелены на целевые антигены, находящиеся на или во многих типах раковых клеток. Эти вакцины против рака проходят апробацию в клинических испытаниях у пациентов с различными видами рака, в том числе рак простаты, рак толстой кишки, легких, молочной железы и рак щитовидной железы.   Другие противоопухолевые вакцины нацелены на антигены, которые являются уникальными для определенного типа рака. Тем не менее, целый ряд вакцин предназначен для борьбы с конкретным антигеном опухоли, чтобы лечить конкретного пациента путем “настройки” на имеющийся тип рака.

   Вот, например, вакцина для лечения одного типа рака, которая уже получила одобрение FDA, Sipuleucel-T (сипулейцел-Т). Это тип вакцины, который настраивается под конкретный тип рака. Кстати, в ходе его клинических испытаний, была выявлена способность сипулейцела увеличивать продолжительность жизни мужчин с метастатическим раком (одним из видов) предстательной железы на 4 месяца.

   Из-за ограниченной токсичности противораковых вакцин, они также проходят клинические испытания в сочетании с другими формами терапии, такими как гормональная терапия, химиотерапия, лучевая терапия, и целевая терапия.

Что такое БЦЖ терапия?

   БЦЖ (BCG или бацилла Кальметта – Герена) была первым вариантом биологической терапии, одобренной FDA. Она ослабляла форму живой бактерии туберкулеза, которая не вызывает заболевания у людей. Впервые БЦЖ была использована медициной как вакцина против туберкулеза. Когда введенная непосредственно в мочевой пузырь с помощью катетера, БЦЖ стимулирует общую иммунную реакцию, которая направлена не только против самой внешней бактерии, но также и против раковых клеток мочевого пузыря.

   Как и почему БЦЖ оказывает этот противоопухолевый эффект не очень хорошо понятно, но эффективность лечения хорошо документирована. Примерно 70 процентов пациентов с ранними стадиями рака мочевого пузыря испытывают ремиссию после БЦЖ-терапии.

В настоящее время использование БЦЖ также изучается в лечении других видов рака.

Что дает онколитический вирус в лечении рака?

   Некоторые вирусы, такие как реовирус, болезнь Ньюкасла, и вирус эпидемического паротита, естественно онколитические, в то время как другие, в том числе вирус кори, аденовирус, вирус коровьей оспы могут быть адаптированы или модифицированы, чтобы эффективно воспроизводиться только в раковых клетках. Кроме того, онколитические вирусы могут быть изменены с помощью генной инженерии, чтобы предпочтительно инфицировать и воспроизводиться в раковых клеток, которые продуцируют специфический рак, связанный с антигенами, такими как EGFR или HER-2.

   Одной из проблем в использовании онколитических вирусов является то, что они сами могут быть уничтожены иммунной системой пациента, прежде чем будут иметь шанс атаковать рак. Исследователи методов вирусной терапии разработали несколько стратегий, чтобы преодолеть эту проблему, например, введение комбинации иммунного подавления препаратов химиотерапии, таких как циклофосфамид вместе с вирусом или «маскировка» вируса внутри защитной оболочки. Но иммунная реакция у пациента может на самом деле иметь преимущества: хотя это может затруднить лечение онколитическим вирусом в момент доставки вируса, но это может улучшить разрушение раковых клеток после заражение вирусом опухолевых клеток.

   Нет, онколитический вирус не был одобрен для использования в Соединенных Штатах, хотя h201, модифицированная форма аденовируса, была утверждена в Китае в 2006 году для лечения пациентов с раком головы и шеи. Несколько онколитических вирусов в настоящее время проходят клинические испытания. Исследователи также изучают, могут ли онколитические вирусы быть объединены с другими видами терапии рака или могут ли быть использованы для увеличения чувствительности опухолей пациентов при использовании дополнительной терапии.

prostovita.ru

Лечение рака вакциной

С помощью иммунотерапии ищутся средства для борьбы с опухолями новыми способами. Иммунотерапия может напрямую стимулировать иммунную систему, либо с помощью искусственных белков или антигенов обучить иммунную систему изнутри выявлять и атаковать опухоли.

Некоторые виды рака могут быть замедлены вакцинами

Вакцины для лечение рака являются одной из форм иммунотерапии, которая используется для лечения раковых заболеваний, которые уже существуют в теле пациента.

Исследование влияния вакцины для борьбы с раком

В настоящее время единственная вакцина против рака, которую одобрило FDA называется Provenge для лечения рака простаты.

Как лечение рака происходит посредством вакцины?

После того, как эти активированные дендритные клетки достигают лимфатический узел, они атакуют рак специфическими антигенными Т-клеткам. Активированные Т-клетки затем путешествуют по всему организму, выявляя раковые клетки и пытаются разрушить их. Более технически, активированные CD4 + Т-клетки продуцируют цитокины, которые способствуют созреванию клеток CD-8, который после созревания распространяется по всему телу.

В качестве альтернативы, вакцина для лечения рака может быть приготовлена с использованием ДНК или РНК, которые кодируют антигены. Этот генетический материал затем вводят в клетки, которые затем продуцируют антигены. Есть надежда на то, что эти модифицированные клетки будут производить достаточное количество раковых ассоциированных антигенов, чтобы вызвать активную иммунную реакцию, чтобы убить раковые клетки.

Три критерия должны быть выполнены для опухолевых клеток, подлежащих уничтожению с помощью вакцины:

• Достаточно большое количество иммунных клеток с выраженным сродством к раковым клеткам должны быть произведены;
• Эти Т-клетки должны быть способны проникать в опухоль;
• Эти Т-клетки должны начать работать на месте опухоли, чтобы вызвать повреждения конкретного участка.

Насколько эффективны противораковые вакцины?

На протяжении десятилетий исследователи рака были заинтересованы в иммунологическом лечении рака, но с небольшим успехом. Тем не менее, недавние успехи приводят к успешному внедрению терапии дендритной клеткой с сообщениями о полных ответах даже у пациентов с раком стадии IV, которые провалили все другие методы лечения. Дендритная клетка или так называемая Дендритная клеточная вакцина - это новая и эффективная форма иммунной терапии, используемой для лечения рака.  

Перспектива вакцины против рака

Во-первых, вакцины были эффективными в предотвращении рака, и этот успех переносится на лечение рака с помощью вакцин. Другими словами, работа, которую мы сделали разрабатывая вакцины для профилактики рака научила нас многому о иммунологии раковых клеток и обеспечила теоретическую основу для разработки вакцин для лечения рака.

Есть в настоящее время две вакцины, которые предотвращают рак: вакцина против гепатита В предотвращает рак печени, и вирус папилломы человека (ВПЧ) вакцина предотвращает рак горла, шейки матки, анальный и другие виды рака.

Во-вторых, терапевтические вакцины против рака просты находятся под пристальным изучением, потому что вызвают несколько серьезных побочных эффектов.В-третьих, исследования часто смещены в их интерпретации результатов испытаний, связанных с раком и терапевтических вакцин, которые разносят ажиотаж вокруг этого вида вмешательства. В частности, исследователи, как правило, сосредоточены на бессмысленных гистологических, или клеточных изменениях, или самих клетках lymphocte (Т-клеток) inflitration опухолей вместо того, чтобы сосредоточиться на реальных изменениях: уменьшение размера опухоли или улучшения клинических симптомов.

Кроме того, главные исследователи изучения вакцины рака часто используют вводящие в заблуждение описания и слова, чтобы охарактеризовать результаты, такие как "симптомы исчезли", "временное прекращение роста в некоторых отдельных метастазах", "некроз опухоли" и "неожиданно долгое выживание пациента." Без дополнительной информации, эти термины мало что значат.

На соответствующую отсылку, были отнесены исследования вакцины против рака на животных, ведь, много было сделано выводов для основных медицинских практик с использованием животных. Мыши, как можно заключить по их размеру, модели поведения и пушистому внешнему виду, отличаются от человеческих существ. Таким образом, любой успех, который мы видим в лечении этих животных, болеющих раком, терапевтическими вакцинами, совсем не обязательно приводит к таким же результатам налюдях.

Более конкретно, хотя вакцины от рака, как было доказано, были эффективными на животных, не удалось обнаружить любой такой эффект у людей. В частности, существует только один случай положительного эффекта при использовании терапевтических вакцин от рака, одобренных FDA для лечения рака простаты у человека: вакцина Provenge (Провендж). Тем не менее, есть еще одна вакцина против рака простаты, в настоящее время она находится в 3-й фазе испытаний, которые доказали свою эффективность: вакцина Prostvac.

Вакцина от рака Provenge (Провендж) и Prostvac

Что такое рак простаты?

Вакцина от рака простаты

Факторы, которые повышают риск развития рака простаты включают пожилой возраст, афро-американское происхождение (расы с темной кожей) и наследственность.

Большинство людей с раком простаты не нуждаются в лечении, а вместо этого наблюдаются их врачами. Лечение рака простаты может включать в себя управление (выжидательное активное наблюдение), хирургия (простатэктомия или удаление простаты), лучевую терапию и андрогеную терапию (лишение половых гормонов ).

Что такое противораковая вакцина Provenge (Провендж)?

Рак гормонрефрактерного типа реагирует на гормон-депривационную терапию, или препараты, которые вызывают чехарду с андрогенами, или половыми гормонами (медицинская кастрация).

Провендж получают с использованием белых клеток крови пациента (мононуклеарных клеток периферической крови), отделяя белок в импульсном режиме, названный гранулоцитов-макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фосфатазы простатической кислоты или PAP, выделяют раковый антиген простаты.

Причина, по которой GM-CSF дается с антигеном PAP - исследователи полагают, что GM-CSF облегчает введение антигена. Следует отметить, что мононуклеарными клетками периферической крови служат дендритные клетки, к которым представлен антиген.

К сожалению, Provenge продлевает жизнь всего на несколько месяцев, около 4 месяцев. Тем не менее, это может позволить человеку, привести свои дела в порядок и провести немного больше времени со своей семьей.

Побочные эффекты от противораковой вакцины

Что такое противораковая вакцина Prostvac?

При изучении Prostvac во второй фазе клинических испытаний были включены 82 участника, из которых 42 получили Prostvac.

Prostvac продлил жизнь в экспериментальной группе на 8,5 месяцев. В настоящее время Prostvac находится в 3-й фазе клинических испытаний, и исследователи не только пытаются подтвердить эффективность применения препарата, но и пытаются выяснить, следует ли GM-CSF добавлять к вакцине.

Во время 2-й фазы клинических испытаний, были выявлены побочные эффекты Prostvac следующее:

реакции в месте инъекции (боль, отек, покраснение и т.д.) усталость лихорадка припухлость озноб боли в суставах головокружение тошнота рвота понос запор

Как используются вакцины от рака простаты?

Вероятно, следует отметить, что в 2015 году FDA одобрило Imlygic, онколитическую вакцину для лечения злокачественной меланомы, неоперабельного типа. Хотя Imlygic технически не является терапевтической вакциной против рака, Imlygic имеет второстепенные эффекты, похожие на эффект от терапевтических вакцин против рака.

Онколитические вирусы представляют собой тип иммунотерапии, где генетически сконструированный вирус вводится непосредственно в опухоль меланому разрывает опухолевые клеток уменьшая раковые образования. В дополнение к разрушению клеток, эти вирусы имеют более общий эффект - продуцирование противоопухолевого эффекта, аналогичного противораковым вакцинам.

Что терапевтические вакцины от рака означают для меня?

Тем не менее, противораковые вакцины представляют собой достижения иммунной системы на поле иммунотерапии. Чем лучше мы понимаем специфику иммунной системы, тем лучше мы можем создать целевую терапию, которая могла бы когда-нибудь спасти жизнь.

health-ambulance.ru

Почти универсальная вакцина для лечения рака?

Вакцина от любого ракаИзраильские ученые создают универсальную вакцину от рака

София Нескучная, Газета.Ru

Разработана терапия, которая воздействует на молекулу, характерную для 90% всех типов раковых клеток. С ее помощью ученые надеются создать универсальную вакцину, инъекция которой позволит иммунной системе всех без исключения пациентов самостоятельно побеждать основные виды рака, включая рак груди и рак простаты. Впрочем, данные результаты еще только предстоит официально опубликовать в рецензируемых журналах.

Западные СМИ в большом количестве сообщают о разработке универсальной вакцины от рака израильскими учеными из Университета Тель-Авива. Пока предварительные результаты клинических испытаний обнадеживают: вакцина способна запустить иммунный ответ в организме пациентов, который, как минимум, облегчает течение болезни.

Создатели методики планируют расширить масштаб клинических испытаний на пациентов с разными типами рака, чтобы детально изучить активность вакцины для каждого из них. Они полагают, что такая инъекция, для начала, станет идеальным средством для борьбы с раком на ранних стадиях, когда удалось зафиксировать небольшие по размеру опухоли. Еще более важным представляется превентивное действие: вакцину буду вводить пациентам из групп риска.

Сложности борьбы с раком в том, что раковые клетки обладают уникальной способностью избегать угроз со стороны иммунной системы. Маскируясь под обычные клетки организма, раковые клетки не дают иммунитету распознать себя как угрозу.

Дело в том, что иммунная система «настроена» на борьбу с инородными клетками – бактериями или вирусами. Опухолевые клетки происходят из собственных клеток больного, мутировавших и перепрограммированных в раковые.

Израильские ученые использовали для разработки вакцины особую молекулу – MUC1, которая в больших количествах находится на поверхности раковых клеток. И если «научить» иммунную систему распознавать эту молекулу, она сможет регистрировать возникновение опухолей.

MUC1 (муцин-1, CD227) – мембранный белок, протеогликан из группы муцинов. Синтезируется апикальной поверхностью эпителиальных клеток и обеспечивает их защиту от бактерий и ферментов – ВМ.

В сотрудничестве с компанией Vaxil Biotheraputics медики разработали вакцину, которая несет небольшой участок биомолекулы MUC1. С его помощью вакцина «прививает» иммунную систему, которая затем успешно обнаруживает и разрушает раковые клетки, несущие такую же метку – а их большая часть.

«Вакцина ImMucin генерирует устойчивый и специфичный иммунный ответ у всех пациентов, находившихся под наблюдением, после введения всего 2-4 доз. Наилучшее действие достигается после 12 доз», – говорится в сообщении Vaxil Biotheraputics, посвященном созданию вакцины.

Клинические испытания безопасности вакцины проводились в медицинском центре Иерусалима. Десять пациентов, страдавших множественной миеломой – одним из форм рака крови – получили курс вакцины. Семь из них на данный момент закончили лечение, и, согласно данным Vaxil, их иммунитет начал бороться с раком гораздо активнее, чем это происходило до введения вакцины.

Трое из пациентов смогли в результате комбинированного лечения полностью побороть болезнь. Эти результаты подтверждают выводы, сделанные в ходе исследования на мышах, опубликованного в журнале Vaccine (ImMucin: A novel therapeutic vaccine with promiscuous MHC binding for the treatment of MUC1-expressing tumors). В нем также сообщается о лучшей выживаемости больных раком, пролеченных новой вакциной.

Так или иначе, вакцине еще предстоять длительные клинические испытания и дополнительные научные исследования. Выборка в 10 пациентов всего в одной больнице никак не может считаться статистически значимой даже для одного вида рака, не говоря уже об обобщениях на другие типы опухолей.

Несмотря на оптимизм, пока результаты недостаточно доказательны даже для официальной публикации.

Впрочем, компания Vaxil уже строит планы по коммерциализации разработки: если все дальнейшие испытания пройдут успешно, вакцина может появиться на рынке уже через шесть лет.

Если такая вакцина будет создана, то медики смогут рекомендовать ее тем пациентам, которые уже больны раком. «Прививка» поможет традиционным средствам лечения болезни, то есть первичным является лечебное, а не превентивное действие лекарства. Еще одна опасность состоит в том, что здоровые клетки также содержать некоторые количества MUC1, однако создатели вакцины уверяют, что «привитая» иммунная система будет генерировать ответ только на раковые клетки, в которых MUC1 гораздо больше.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru09.04.2012

www.vechnayamolodost.ru

аутологичная вакцина для лечения онкологических заболеваний и способ ее получения - патент РФ 2392946

Изобретение относится к медицине, а именно к области онкологии. Аутологичная клеточная вакцина состоит из двух частей: в одну входит прикрепляющаяся фракция - это зрелые ДК, полученные путем инкубирования незрелых ДК с лизатом опухоли, во вторую входит не прикрепляющаяся фракция - это Т-лимфоциты, специфически активированные интерлейкином 2, зрелыми ДК и ЛАК-клетками. Использование заявленной вакцины позволяет провести эффективное лечение онкологической патологии. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к области медицины, онкологии и может быть использовано для лечения онкологических заболеваний различных локализаций.

Несмотря на огромное количество разрабатываемых и используемых методов лечения онкологических заболеваний эта проблема до сих пор остается практически нерешенной. Повышенный интерес вызывает вопрос об эффективности иммунного ответа на опухоль у человека. Одной из гипотез возникновения злокачественного процесса является несостоятельность иммунной системы [1, 2, 3]. Многочисленные исследования показали, что важная роль в защите организма отведена клеточному звену иммунного ответа, представленному в организме рядом эффекторных клеток [1]. Изначально особый интерес вызвала роль натуральных киллеров (НК), относящихся к лимфоидным клеткам, но отличающихся по фенотипу от Т- и В-лимфоцитов

Была обнаружена способность этих клеток оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки, что было подтверждено в ряде экспериментов in vitro. В частности, выявлена корреляция между частотой развития опухолевого процесса и количественным уровнем НК у мышей. Механизм действия НК опосредован их способностью распознавать антигены главного комплекса гистосовместимости 1 класса (МНС 1) на поверхности клеток и останавливать их лизис. Опухолевые клетки могут отличаться от нормальных сниженной экспрессией МНС 1, и тогда такие клетки становятся мишенями для НК. В ряде случаев уровень экспрессии на опухолевых клетках может быть нормальным такие опухоли ускользают из-под контроля НК [1, 4].

Изучение активности клеток лимфоидного ряда под воздействием различных цитокинов показало, что важную роль в активности Т-лимфоцитов и НК играет ИЛ2. В 1980 году было опубликовано сообщение о том, что лимфоциты, культивированные в присутствии ИЛ2, способны лизировать опухолевые клетки саркомы. Это явление получило название ЛАК-феномена. В дальнейшем было выяснено, что лимфокинактивированные киллеры (ЛАК) происходят из субпопуляции НК и обладают специализированной цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам. Образование ЛАК является результатом активации НК под действием ряда факторов, главным из которых является интерлейкин-2 (ИЛ2). Этот цитокин способствует генерации и усилению цитотоксичности ЛАК-клеток, участвует в регуляции иммунного ответа и направляет его по Т-хелпер первому клеточному пути развития. В организме ИЛ-2 способствует пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов, стимулирует клональную пролиферацию В-лимфоцитов и антителообразование, увеличивает функциональную активность фагоцитов и клеток натуральных киллеров [1, 5, 6,].

Изучение ЛАК-феномена быстро перешло в клинику. За весь период его изучения (20 лет) применялись как аллогенные, так и аутологичные ЛАК, культивированные в различных условиях. ЛАК вводили как системно, так и локально, изолированно и в комплексе с цитокинами, в том числе с ИЛ2, однако эти методы терапии не оправдали возложенных на него надежд. Лишь в 50% случаев наблюдалась клиническая эффективность лечения, результат оказался статистически недостоверным, но в ряде случаев достоверно снижалась частота метастазирования. Кроме того, были отработаны наиболее эффективные методы получения ЛАК и введения их в организм [1].

В последние годы исследователи различных специальностей уделяют большое внимание разработке и изучению противоопухолевых вакцин. Вакцинация - это способ создания активного специфического иммунитета с помощью вакцины, содержащей иммуногенный антиген [3, 7].

Антигенами при опухолях являются компоненты опухолевых клеток, измененные по структуре относительно нормальных клеток организма.

В последнее время стало ясно, что в процессе опухолевой прогрессии важную роль играют дендритные клетки (ДК). Природа этого феномена связана со способностью ДК презентировать опухолевые антигены цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТК). Установлено, что по причине отсутствия ДК в опухоли или слабой экспрессии молекул МНС 1 и 2 классов, а также CD80 и CD86 костимулирующих молекул на ДК, инфильтрирующих опухоль, не создается устойчивый антигенспецифический Т-клеточный ответ [9, 10]. Это может быть следствием продукции злокачественной опухолью факторов (ИЛ-10, ТФР-бета, фактор роста эндотелия и др.), угнетающих дифференцировку, созревание и функциональную активность периферических ДК [11].

Критическим фактором в запуске иммунной реакции является созревание ДК. Оно может быть инициировано различными стимулами, в том числе опухолевыми антигенами, микробными продуктами и продуктами воспаления (цитокины: ИЛ-1, ИЛ-6, ГМ-КСФ, ФНО-а, ЛПС). В процессе созревания антигензахватывающая функция ДК снижается, а способность активировать Т-клетки повышается. Окончательно дифференцированная ДК способна эффективно активировать Т-клетки, после чего последние могут осуществлять иммунный ответ [1, 9, 30].

In vivo ДК участвуют в формировании иммунной реакции в лимфоидных органах. Там они взаимодействуют со всеми основными классами Т-клеток и стимулируют развитие сильного Т-клеточного иммунного ответа [1, 9, 10].

В последнее время ДК рассматривают в качестве основного адъюванта при создании вакцин для лечения рака [3, 12, 13]. Есть основания полагать, что использование нагруженных антигеном «профессиональных» антигенпрезентирующих дендритных клеток поможет создать сильный специфический иммунный ответ. Было показано, что ДК, инкубированные с антигенами опухоли, способны генерировать формирование Т-клеточного защитного ответа как против опухолевых клеток, вторично введенных в организм, так и против имевшихся опухолей. Возможность выделения опухолеспецифических антигенов позволила реализовать стратегию иммунотерапии, основанную на представлении этих антигенов молекулами МНС одного класса ДК с генерированием цитотоксических CD8+ Т-клеток, способных вызывать отторжение опухоли [3, 12, 13].

Важную роль также играет источник получения опухолевого антигена. До сих пор ДК чаще стимулировали отдельными пептидами и белками. Однако недостатком такого подхода является недстаточная лечебная эффективность вакцины, обусловленная ее гетерогенностью и неизученностью антигенного состава опухолевых клеток. Лизат, полученный из собственной опухоли пациента, содержит широкий спектр антигенов, в том числе и не известные в настоящий момент [14].

Немаловажен и способ введения ДК. Так было показано, что подкожно введенные ДК, обладают большей иммуногенностью и способностью к миграции в отличие от ДК, введенных внутривенно [12, 13].

К настоящему времени проведен ряд испытаний противоопухолевых вакцин на основе ДК. Имеются данные об опыте применения вакцины при фолликулярной лимфоме, меланоме, миеломе, раке простаты, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, щитовидной железы [15, 16, 17].

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения вакцины для лечения онкологических заболеваний - комбинированного клеточного трансплантата на основе лимфокинактивированных киллеров (ЛАК-клеток) и дендритных клеток (ДК) [18]. ДК получают из аутологичных моноцитов периферической крови или костного мозга и in vitro активируют аутологичным опухолевым лизатом и ростовыми факторами. ЛАК-клетки получают из мононуклеаров крови и активируют ИЛ 2. В последующем ДК вводят в организм подкожно, внутривенно, интерартериально или регионально (в полости), а ЛАК-клетки вводят внутривенно. Известная вакцина обладает недостаточной клинической эффективностью вследствие отсутствия специфически активированных in vitro Т-лимфоцитов.

Новая техническая задача - разработка новой вакцины для эффективного лечения онкологической патологии на основе аутологичных мононуклеарных клеток крови: антигенактивированных дендритных клеток, специфически активированных «обученных» и неспецифически активированных лимфоцитов, сочетающей одновременное воздействие на специфическое и неспецифическое звено противоопухолевого иммунного ответа, и способа ее получения.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Предложена аутологичная вакцина для лечения онкологических заболеваний, содержащая лимфоциты, активированные интерлейкином 2, дендритные клетки, полученные путем инкубирования незрелых ДК с лизатом опухоли, причем она дополнительно содержит Т-лимфоциты, специфически активированные зрелыми ДК.

Предложен способ получения аутологичной вакцины для лечения онкологических заболеваний, включающий выделение мононуклеаров (МНК) из периферической крови пациента, культивирование МНК в среде DMEM, разделение клеток на моноциты, прикрепляющиеся к подложке, и лимфоциты, не прикрепляющиеся к подложке, помещение МНК в культуральную среду, отделение не прикрепляющихся лимфоцитов и добавление к ним ИЛ2 для получения лимфокинактивированных киллеров (ЛАК-клеток), добавление к оставшимся прикрепляющимся моноцитам ростового фактора, стимуляцию созревания ДК аутологичным опухолевым лизатом in vitro и последующим добавлением созревающих факторов в течение 1 суток, в котором для получения прикрепляющихся моноцитов МНК культивируют в среде, дополненной FCS 10% в течение одного часа, после чего для получения незрелых дендритных клеток (нДК) проводят культивацию прикрепляющихся моноцитов в среде, дополненной нейпогеном 50 нг/мл в течение 48 часов, после чего для получения зрелых дендритных клеток нДК культивируют в среде, содержащей 2000 МЕ/мл реоферона и 50 нг/мл беталейкина, при этом параллельно культивируют ЛАК-клетки из неприкрепляющейся фракции МНК в среде, содержащей 100 ЕД/мл ронколейкина в течение 72 часов, и далее полученные зДК и ЛАК-клетки отмывают центрифугированием в физиологическом растворе 10 минут при 1500 об/мин, после чего проводят совместную культивацию зДК с ЛАК-клетками в среде, дополненной 100 ЕД/мл ронколейкином в течение 24 часов, затем снимают прикрепляющуюся фракцию и не прикрепляющуюся фракцию клеток и раздельно отмывают центрифугированием в физиологическом растворе 10 минут при 1500 об/мин, получая вакцину.

Способ осуществляют следующим образом:

1) выделяют МНК из крови человека, нуждающегося в лечении онкологического заболевания,

2) инкубируют выделенные МНК в среде в течение 1 часа,

3) разделяют МНК на 2 фракции: прикрепляющиеся моноциты и не прикрепляющиеся к подложке лимфоциты,

4) обрабатывают прикрепляющиеся МНК ростовыми факторами для получения незрелых ДК (нДК)в течение 48 часов,

5) обрабатывают нДК лизатом опухолевых клеток и цитокинами для получения зрелых ДК (зДК) в течение 24 часов,

6) культивируют неприкрепляющуюся фракцию МНК с ИЛ2 для получения не специфически активированных лимфоцитов - ЛАК-клеток в течение 72 часов,

7) проводят отмывку зДК и ЛАК-клеток центрифугированием в физиологическом растворе 10 минут при 1500 об/мин.

8) проводят совместное культивирование зДК и ЛАК-клеток в свежей среде, дополненной 100 ЕД/мл ронколейкином в течение 24 часов, для получения специфически активированных лимфоцитов-киллеров.

9) снимают прикрепляющуюся фракцию и не прикрепляющуюся фракцию клеток и раздельно отмывают центрифугированием в физиологическом растворе 10 минут при 1500 об/мин, получая вакцину.

Выделяют мононуклеары из периферической крови на градиенте фикол-урографина (р=1,077 г/см3) при соотношении крови и градиента 2:1 соответственно. Мононуклеарную фракцию клеток в количестве 2×106 /мл ресуспендируют в среде DMEM, дополненной FCS 10%, HEPES 5 мМ, глутамином 2 мМ, 2-меркаптоэтанолом 5×10-5М. гентамицином 1000 мкг/мл (рассчитанные на 100 мл DMEM), помещают во флаконы для культивирования и инкубируют 1 час при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2. Далее, мононуклеары разделяют на прикрепляющуюся и неприкрепляющуюся фракции. Прикрепляющуюся фракцию помещают в упомянутую среду с добавлением нейпогена 50 нг/мл на 48 часов для получения незрелых дендритных клеток (нДК), которые способны к активному захвату антигена, путем фагоцитоза и макропиноцитоза. Затем добавляют лизат опухолевых клеток с концентрацией 100 мкг/мл, беталейкин 50 нг/мл и реоферон 2000 МЕ/мл, проводят культивирование в течение 24 часов для получения зрелых дендритных клеток (зДК).

К не прикрепляющейся фракции добавляют ронколейкин 100 ЕД/мл и культивируют 72 часа для получения ЛАК-клеток. После чего полученные зДК и ЛАК-клетки отмывают центрифугированием 10 минут при 1500 об/мин. После 72 часов проводят совместную культивацию зДК и ЛАК-клеток в свежей среде, дополненной 100 ЕД/мл ронколейкином в течение 24 часов. После чего снимают прикрепляющуюся фракцию и не прикрепляющуюся фракцию клеток и раздельно отмывают центрифугированием в физиологическом растворе 10 минут при 1500 об/мин, получая вакцину.

DMEM - среда с высоким содержанием аминокислот и витаминов, включает в свой состав трасферрин, лейцин, глюкоза, пируват и ряд других веществ. Обладает высокой биологической стабильностью, обеспечивает нормальную жизнедеятельности многих типов и линий клеток, в том числе и лимфоидных.

HEPES - буфер, нетоксичный для клеток. Широко применяется для поддержания pH среды от 6,8-8,2 в культуральных исследованиях по выращиванию лимфоидных клеток. Концентрация подобрана авторами опытным путем.

2-меркаптоэтанол - антиоксидант, вызывает реактивацию многих ферментов, используется в качестве добавки при культивировании лимфоидных клеток, увеличивает выход клеток гранулоцит - макрофагального ряда.

FCS - эмбриональная телячья сыворотка, инактивированная в течение 30 минут при температуре 60°С для снижения вероятности неспецифической антигенной стимуляции. Поддерживает рост клеток за счет содержащихся в ней факторов роста, интерлейкинов. гормонов, альбумина и других биологически активных веществ. Используется при выращивании различных типов гемопоэтических и лимфоидных клеток. Глутамин - незаменимая аминокислота, необходимая для питания растущих клеток. Гентамицин - антибиотик, подавляет рост бактериальной флоры, добавляется в концентрации, нетоксичной для растущей культуры клеток, рассчитанной экспериментально.

Нейпоген является рекомбинантным аналогом гранулоцит - макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). Препарат зарегистрирован и разрешен к применению на территории РФ. ГМ-КСФ - гликопротеин, гемопоэтический ростовой фактор, который регулирует образование и функционирование иммунокомпетентных клеток: дендритных клеток, макрофагов и гранулоцитов. В периферической крови человека содержится всего лишь около 1% дендритных клеток, и поэтому получение достаточного количества ДК in vitro для терапевтического использования в практике из моноцитов периферической крови возможно путем культивирования в присутствии ростовых факторов, основным из которых является ГМ-КСФ [8, 9, 19, 20]. Время культивации и концентрация подобраны авторами экспериментально с учетом максимального выхода незрелых ДК, фенотип которых определен по основным маркерам CD83 и CD 86.

Беталейкин - препарат человеческого рекомбинантного интерлейкина-1бета. Препарат зарегистрирован и разрешен к применению на территории РФ. При культивации незрелых дендритных клеток in vitro ИЛ-1 стимулирует созревание дендритных клеток и приобретение последних фенотипа, соответствующего зрелым ДК, которые способны к эффективной презентации антигена и активации Т-лимфоцитов [21, 22].

Реоферон - препарат человеческого рекомбинантного интерферона-альфа. Препарат зарегистрирован и разрешен к применению на территории РФ. Интерферон-альфа является главным сигналом для дифференцировки и созревания дендритных клеток. Интерферон-альфа in vitro обеспечивает быструю дифференцировку моноцитов крови, предварительно культивируемых в среде с ГМ-КСФ, в дендритные клетки с высокой функциональной активностью и способностью эффективно презентировать антиген Т-лимфоцитам.

Поэтапное культивирование моноцитов, выделенных из периферической крови пациента, способствует получению сначала незрелых дендритных клеток с выраженной способностью только поглощать антиген, а затем после добавления лизата опухоли и вышеперечисленных препаратов, стимулирующих созревание дендритных клеток, способствует получению зрелых ДК, которые эффективно презентируют антигены и активируют Т-хелперы. Время, необходимое и достаточное для эффективной культивации зрелых и незрелых ДК, определены авторами экспериментально.

Не прикрепляющуюся фракцию клеток культивируют с Ронколейкином 100 ЕД/мл в течение 72 часов. Ронколейкин - препарат рекомбинантного человеческого интерлейкина-2. Интерлейкин-2 вызывает поликлональную активацию Т-лимфоцитов и генерацию лимфокинактивированных киллеров in vitro. Образование ЛАК является результатом активации натуральных киллеров под действием ИЛ-2. Этот цитокин способствует генерации и усилению цитотоксичности ЛАК-клеток, которые более специфичны по отношению к опухолевым клеткам нежели НК-клетки. Концентрацию ронколейкина и время культивации не прикрепляющейся фракции клеток в среде, содержащей этот препарат, подобраны авторами экспериментально.

Совместное культивирование прикрепляющейся и не прикрепляющейся фракций клеток проводят в свежей среде с добавлением ронколейкина 100 ЕД/мл в течение 24 часов. На данном этапе запускается презентация антигена в составе аутологичных антигенактивированных зрелых дендритных клеток наивным Т-лимфоцитам хелперам. В присутствии ронколейкина процесс дифференцировки Т-хелперов направляется по первому пути, что приводит к развертыванию специфического противоопухолевого иммунного ответа. Образуются активированные цитотоксические Т-киллеры (CD8) и Т-лимфоциты гиперчувствительности замедленного типа (Т-ГЗТ (CD4)). которые являются основными эффекторами клеточного пути иммунного ответа. Время культивации подобрано авторами экспериментально.

Отличием предлагаемого способа является осуществление этапа совместного культивирования аутологичных антигенактивированных зрелых дендритных клеток и неспецифически активированных лимфоцитов - ЛАК-клеток, что позволяет смоделировать in vitro специфический противоопухолевый иммунный ответ и избежать супрессирующего воздействия на процесс презентации антигена наивным Т-лимфоцитам метаболитов опухолевых клеток в организме пациента. Для культивации клеток в предлагаемом способе используются препараты, разрешенные к применению на территории Российской Федерации и имеющие регистрационные номера. Использование реоферона в качестве компонента среды для получения зДК позволяет сократить время, необходимое для созревания нДК [20, 23, 24, 25].

Культивирование МНК проводят в среде с добавлением инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), что позволяет нивелировать развитие аллергической реакции на антигены, содержащиеся в сыворотке доноров. Кроме того, использование FCS исключает возможность супрессивного воздействия на клетки вакцины продуктов опухолевого роста, содержащихся в сыворотке пациента с онкопатологией.

Приводим результаты тестов, подтверждающих эффективность вакцины in vitro.

Фенотип ДК

Для анализа фенотипических характеристик дендритных клеток использовались моноклональные антитела anti-CD83-PE (BD Pharmingen), anti-CD86-FITC (BD Pharmingen), anti-HLA-DR-FITC («Сорбент», Москва) с последующим анализом на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Признаком функциональной зрелости дендритных клеток (зДК) считалось повышение уровня экспрессии вышеперечисленных маркеров по сравнению с незрелыми ДК (нДК).

В табл.1 приведены фенотипические характеристики дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови пациентов, больных раком различной локализации (n=47), (* - различия достоверны (p<0.05) по сравнению с незрелыми дендритными клетками)

Через 72 часа созревания нДК приобретают фенотип зрелых дендритных клеток, увеличивая экспрессию CD83+CD86+HLA-DR+.

Пролиферативная активность

Для определения эффективности модуляции противоопухолевого иммунного ответа оценивалась пролиферативная активность мононуклеарных клеток с использованием системы APO-BRDU Flow Kit на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Тестирование проводилось через 72 часа культивирования МНК + зДК, с лизатом опухолевых клеток и без него. В табл.2 приведены данные по пролиферативному ответу мононуклеарных клеток пациентов, больных раком различной локализации, культивированных с антигенактивированными ДК (n=47), * - различия достоверны (p<0.05) по сравнению с группой МНК.

Таким образом, антигенактивированные дендритные клетки повышают пролиферативную активность мононуклеарных клеток больных раком различной локализации in vitro.

Продукция IFN-

Для определения эффективности ответа на опухолевые антигены оценивали количество клеток, продуцирующих IFN- , с использованием системы BD FastImmune Cytokine на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Определение уровня продукции IFN- в культуральных супернатантах МНК проводили с помощью иммуноферментного анализа («Вектор-Бест») через 72 часа культивирования МНК активированных зДК. Под действием аутологичных антигенактивированных дендритных клеток больных раком различной локализации достоверно повышается количество IFN- - секретирующих клеток и уровень продукции цитокина мононуклеарными клетками в ответ на опухолевый антиген (лизат) по сравнению с клетками исходной популяции. В табл.3 приведены данные по продукции IFN МНК пациентов, больных раком различной локализации, культивированных с антигенактивированными ДК (n=47), * - различия достоверны (p<0.05) по сравнению с группой МНК.

Цитотоксическая активность

Одним из основных эффективных способов борьбы иммунокомпетентных клеток с опухолевыми является цитолиз, опосредованный цитотоксическими Т-лимфоцитами и натуральными киллерами (NK-клетки). Исследование цитотоксической активности МНК, культивированных в присутствии ДК, презентирующих антигены опухолевого лизата. проводилось с помощью проточной цитофлюориметрии по включению ядерного красителя 7-аминоактиномицина D. В табл.4 приведены данные по цитотоксической активности МНК+ДК у больных раком различной локализации (n=47), * - различия достоверны (p<0.05) по сравнению с группой МНК.

Показано, что использование аутологичных ДК усиливает цитотоксическую активность МНК против клеток опухоли.

Статистическая обработка результатов

Результаты представлены в виде среднего и ошибки среднего при p<0.05. Статистическая достоверность различий определялась с использованием программы Statistica 6.0.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность индукции специфического противоопухолевого иммунного ответа с помощью антигенактивированных дендритных клеток и «обученных» мононуклеарных клеток in vitro. Совместное культивирование специфических аутологичных ДК и МНК больных раком различной локализации приводит к активации МНК, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, повышении количества цитотоксических клеток и их функциональной активности.

Таблица 1
Уровень экспрессии маркеров (% позитивных клеток)	Стадия развития ДК
	Незрелые ДК (%)	Зрелые ДК (%)
CD 83+/CD 86+	18,59±1,05	31,33±1,56
CD 83+/HLA-DR+	7,67±0,45	22,26±1,12*:

Таблица 3
	Количество IFN- - продуцирующих клеток, %	Содержание IFN- в супернатантах МНК, пг/мл
	Спонтанная	Антигенстимулированная	Спонтанная	Антигенстимулированная
МНК	32±1,3	64±3,2	65±3,25	135±6,75
МНК + ДК (без антигена)	81±14,05	97±15,1	105±15,25	381±49,05
МНК + ДК (с антигеном)	84±4,02*	16±8,15*	618±30,91	885±44,25*

Источники информации

1. Бережная Н.М. Иммунология злокачественного роста / Н.М.Бережная, В.Ф.Чехун. Киев: Наукова думка, 2005. - 791 с.

2. Kremetz Е. Clinical experience in the immunotherapy of cancer / E.Kremetz, M.Samuel. J.Wallace // Surg. Gynecol. Obstet. - 1971. - Vol.133. - P.209-217.

3. Балдуева И.А. Противоопухолевые вакцины // Практическая онкология. Биотерапия злокачественных опухолей. - 2003. - № 4(3). - С.66-70.

4. Self-tolerance, dendritic cell (DC)-mediated activation and tissue distribution of natural killer (NK) cells // Ivan Zanoni, Francesca Granucci, Maria Foti and et al. // Immunology letters. 2007. - № 110. - C.6-17.

5. Опыт применения интерлейкина-2 и лимфокинактивированных клеток-киллеров в терапии онкогематологических заболеваний у детей / М.В.Киселевский, Г.В.Казанова, С.Р.Варфоломеева и др. // Иммунология. - 2002. - Т.23, № 1 - С.56-59.

6. Цитокины в лечении рака / И.В. Киселева, С.Ф. Протасова, В.В.Жунко, С.М.Щеканова // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. - 1999. - Т.3, № 1. - С.48-52.

7. Моисеенко В.М. Вакцинотерапия злокачественных опухолей / В.М.Моисеенко, И.Л.Балдуева, К.П.Хансон // Вопросы онкологии. - 1999. - Т.3, № 1. - С.327-332.

8. Москалева Е.Ю. Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека / Е.Ю.Москалева, С.Е.Северин // Иммунология. - 2002. - № 1. - С.8-15.

9. Птушкин В.В. Дендритные клетки и роль цитокинов в их дифференцировке и функционировании / В.В.Птушкин // Клиническая онкогематология: Руководство для врачей. - Москва, 2001. - С.6-72.

10. Пащенков М.В. Основные свойства дендритных клеток / М.В.Пащенков, Б.В.Пинегин // Иммунология. - 2001. - № 4. - С.7-16.

11. Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance / F.M.Marincola, E.M.Jaffee, D.J.Hicklin and et al. // Adv. Immunol. - 2000. - Vol.74. - P.181-273.

12. Коростелев С.А. Противоопухолевые вакцины // Современная онкология. - 2003. № 4(3). - С.9-15.

13. Москалева Е.Ю. Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека / Е.Ю.Москалева, С.Е.Северин // Иммунология, - 2002. - № 1. - С.8-15.

14. A phase 1 trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer / A.E.Chag, B.G.Redman, J.R.Whitfield et al. // Clin. Cancer Res. - 2002, - Vol.8. - P.1021-1032.

15. Vaccination with irradiated autologous melanoma cells engineered to secrete human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor generates potent antitumor immunity in patients with metastatic melanoma / R.Soiffer, T.Lynch, M.Mihm, et al. // Proc Natl. Acad Sci USA. - 1998. - № 95. - P.13141-13146.

16. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells / F.J.Hsu, C.Benike, F.Fagnoni, et al. // Nat. Med. - 1996. - P.52-58.

17. Прокопович С.К. Дендритные клетки и перспективы их использования в иммунотерапии злокачественных новообразований / С.К.Прокопович, В.Б.Винницкий // Онкология. - 2001. - Т.3. - № 2-3. - С.126-131.

18. Патент РФ № 2309753 Комбинированный клеточный трансплантат на основе лимфокинактивированных киллеров и дендритных клеток, способ его получения и способ лечения и профилактики онкологических, инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний / Д.В.Гольдштейн, А.В.Макаров, И.В.Арутюняна и соавт. - № 2309753; Заявлено 2006.05.05; Опубликован 2007.11.10 (прототип).

19. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor ameliorates DSS-induced experimental colitis / Satheesh K. Sainathan, Eyad M. Hanna, Qingqing Gong et al. // Inflamm Bowel Disease. - 2008. - Vol.14. - № 1. - P.88-99.

20. Expression of CCR-7, MIP-3, and Th-1chemokines in type I IFN-induced monocytederived dendritic cells: importance for the rapid acquisition of potent migratory and functional activities / S.Parlato, Stefano M.Santini, C.Lapenta, et al. // Blood. - 2001. - Vol.98. - № 10. - P.3022-3029.

21. Generation of dendritic cells from positively selected CD14+ monocytes for anti-tumor immunotherapy / A.Curti, A.Isidori, E.Ferri, et al. // Leukemia and Lymphoma. - 2004. - Vol.45. - № 7. - P.1419-1428.

22. Simplified method to generate large quantities of dendritic cells suitable for clinical applications / B.Goxe, N.Latour, M.Chokri // Immunological investigations. - 2000. - Vol.29. - № 3. - P. 319-336.

23. A new type I IFN-mediated pathway for the rapid differentiation of monocytes into highly active dendritic cells / S.M.Santini, Di T.Pucchio, C.Lapenta, et al. // Stem Cells. - 2003. - Vol.21. - № 3. - P.357-362.

24. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu-PBL-scid mice / S.M.Santini, C.Lapenta, M.Logozzi. et al. // J Exp Med. - 2000. - № 191. - P.1777-1788.

25. Частично-зрелые дендритные клетки как потенциальная основа для индукции противоопухолевого ответа у больных злокачественными глиомами / О.Ю.Леплина, М.А.Тихонова, Ю.П.Козлов и соавт. // Медицинская Иммунология. - 2005. - Т.7. - № 4. - С.365-374.

26. Златник Е.Ю. Изучение возможности применения Ронколейкина для LAK-терапии рака яичника / Е.Ю.Златник, Л.Ю.Голотина // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т.4. № 2. - С.54-58.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Аутологичная вакцина для лечения онкологических заболеваний, содержащая лимфоциты, активированные интерлейкином 2, дендритные клетки (ДК), полученные путем инкубирования незрелых ДК с лизатом опухоли, отличающаяся тем, что вакцина состоит из двух частей, в одну входит прикрепляющаяся фракция - это зрелые ДК, во вторую входит неприкрепляющаяся фракция - это Т-лимфоциты, специфически активированные зрелыми ДК (зДК) и ЛАК-клетками.

2. Способ получения аутологичной вакцины для лечения онкологических заболеваний, включающий выделение мононуклеаров (МНК) из периферической крови пациента, культивирование МНК в среде DMEM, разделение клеток на моноциты, прикрепляющиеся к подложке, и лимфоциты, не прикрепляющиеся к подложке, помещение МНК в культуральную среду, отделение не прикрепляющихся лимфоцитов и добавление к ним ИЛ2 для получения лимфокинактивированных киллеров (ЛАК-клеток), добавление к оставшимся прикрепляющимся моноцитам ростового фактора, стимуляцию созревания ДК аутологичным опухолевым лизатом in vitro и последующим добавлением созревающих факторов в течение 1 сут, отличающийся тем, что для получения прикрепляющихся моноцитов МНК культивируют в среде, дополненной FCS 10% в течение одного часа, после чего для получения незрелых дендритных клеток (нДК) проводят культивацию прикрепляющихся моноцитов в среде, дополненной нейпогеном 50 нг/мл в течение 48 ч, после чего для получения зрелых дендритных клеток нДК культивируют в среде, содержащей 2000 МЕ/мл реоферона и 50 нг/мл беталейкина, при этом параллельно культивируют ЛАК-клетки из неприкрепляющейся фракции МНК в среде, содержащей 100 ЕД/мл ронколейкина, в течение 72 ч, и далее полученные зДК и ЛАК-клетки отмывают центрифугированием в физиологическом растворе 10 мин при 1500 об/мин, после чего проводят совместную культивацию зДК с ЛАК-клетками в среде, дополненной 100 ЕД/мл ронколейкином, в течение 24 ч, затем снимают прикрепляющуюся фракцию и неприкрепляющуюся фракцию клеток и раздельно отмывают центрифугированием в физиологическом растворе 10 мин при 1500 об/мин, получая вакцину.

www.freepatent.ru

Смотрите также

• 
  Вакцина от чумки
• 
  Комаровский о вакцинах
• 
  Вакцина для детей
• 
  Рувакс вакцина цена
• 
  Вакцина д тест
• 
  Вакцина вместо манту
• 
  Виды вакцин нобивак
• 
  Церварикс вакцина инструкция
• 
  Расшифровка вакцина бцж
• 
  Вакцина против паркинсона
• 
  Аваксим 80 вакцина