 |
|
|
|||||||||
|
Достоинства живых вакцин:. Сорбированные вакциныИнактивированная сорбированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птицИзобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц, инактивант димер этиленимина, адъюванты гидроокись алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Штамм (авторское наименование «К-58») депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером - штамм «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц. Штамм «К-58 №122-ДЕП» репродуцируется на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см 3. Вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета. Вакцину применяют клинически здоровой птице в возрасте 110-120 суток в объеме 0,5 см3 однократно. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ птиц «родительской» стаи и обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 15-25-суточного возраста, безвредна, 12 з.п. ф-лы, 5 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. ИББ птиц (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) - широко распространенная высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят, преимущественно в возрасте 15-80 суток, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. ИББ поражает, в основном, β-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. ИББ протекает остро, с характерной клиникой заболевания и субклинически. Субклиническая форма имеет широкое распространение. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднение при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза заболевания. ИББ птиц зарегистрирована во всех странах мира. В последние годы ИББ получила широкое распространение в большинстве крупных птицеводческих хозяйств России. Применение отечественных и импортных биопрепаратов в очагах инфекции не обеспечило ожидаемого эффекта. Это объясняется тем, что их применению не предшествовало изучение антигенных свойств циркулирующих изолятов вируса ИББ, не определялись специфические антитела птицы до и после вакцинации, а также уровень пассивного материнского иммунитета у цыплят. Не учитывалась известная особенность возбудителя ИББ - его антигенная изменчивость в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки и на разных территориях и зависящая от видового и породного состава птичьего поголовья, его иммунного статуса, и множество других факторов. В связи с этим выбор вакцинного штамма вируса ИББ птиц должен проводиться с учетом антигенной структуры эпизоотического изолята и для приготовления вакцинных препаратов необходимо использовать производственные штаммы, обладающие наибольшей степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическими изолятами вируса ИББ. Экономический ущерб от ИББ, обусловленный гибелью до 20-70% поголовья цыплят при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также в результате возникновения вторичных инфекций, очень велик. В настоящее время общепризнано, что единственно правильным и надежным направлением в борьбе с инфекцией является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики ИББ используют живые и инактивированные вакцины из гомологичных штаммов возбудителя инфекции, выращенных в различных чувствительных биологических системах. В большинстве птицехозяйств цыплят прививают 2-кратно живыми вакцинами, а ревакцинируют в 16-20-недельном возрасте инактивированной вакциной. Это обусловлено тем, что при ИББ введение живых вакцин взрослой птице не формирует у нее напряженный иммунитет, что связано с ее возрастными особенностями. По этой причине для специфической профилактики ИББ взрослой птицы широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные. При изготовлении инактивированной вакцины широко используют вирулентные штаммы вируса ИББ птиц. Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма Д78, АТСС №VP-2041, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур [1]. Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, сордержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма GP/82, NCAJM №V(Р)-001033, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали культуру клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур [2]. Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма 689, ЕСАСС №V00012609, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении [3]. Основной недостаток известных вакцин состоит в том, что они являются импортными препаратами и не обеспечивают удовлетворительной защиты против вируса ИББ птиц, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации. Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма "БГ" №102-ДЕП", полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и, по меньшей мере, один адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур [4]. Недостаток вакцины-прототипа состоит в том, что она обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью. В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной сорбированной вакцины на основе нового штамма вируса ИББ птиц, обладающего более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью в нативном виде и после инактивации. Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности и безвредности предлагаемой вакцины. Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков: 1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц. 2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, в эффективном количестве. 3. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. 4. В качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур. 5. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации. 6. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%. 7. Инактивант. 8. Из инактивантов димер этиленимина (ДЭИ). 9. ДЭИ в виде 15% водного раствора. 10. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%. 11. Адъювант. 12. Из адъювантов гидроокись алюминия (ГОА). 13. ГОА в виде 3-4% геля. 14. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%. 15. Из адъювантов дополнительно сапонин. 16. Сапонин в виде 10% водного раствора. 17. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%. 18. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
Предлагаемое изобретение содержит следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц. 2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, в эффективном количестве. 3. Инактивант. 4. По меньшей мере, один адъювант. Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования: 1. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации. 2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%. 3. Из инактивантов ДЭИ. 4. ДЭИ в виде 15% водного раствора. 5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%. 6. Из адъювантов ГОА. 7. ГОА в виде 3-4% геля. 8. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%. 9. Из адъювантов дополнительно сапонин. 10. Сапонин в виде 10% водного раствора. 11. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%. 12. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются: 1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц. 2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации. 3. Инактивант. 4. По меньшей мере, один адъювант. По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что она содержит эффективное количество антигенного материала из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования: 1. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации. 2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%. 3. Из инактивантов ДЭИ. 4. ДЭИ в виде 15% водного раствора. 5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%. 6. Из адъювантов ГОА. 7. ГОА в виде 3-4% геля. 8. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%. 9. Из адъювантов дополнительно сапонин. 10. Сапонин в виде 10% водного раствора. 11. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%. 12. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
По сравнению с вакциной-прототипом инактивированная сорбированная вакцина на основе штамма "К-58 №122-ДЕП" обладает более высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной. Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что в ее состав введен вирусный материал из нового аттенуированного штамма "К-58 №122-ДЕП", гомологичного возбудителю инфекции и не вызывающего иммуносупрессии у привитой птицы. Исходный вирус (авторское наименование изолята "К-58") для получения штамма "К-58 №122-ДЕП" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров на птицефабрике "Васильевская" Пензенской области в 1994 году. Вакцинный штамм "К-58 №122-ДЕП" получен путем многократных последовательных пассажей исходного изолята на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и SPF-цыплятах. Штамм "К-58" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. По сравнению со штаммом "БГ" №102-ДЕП" штамм "К-58 №122-ДЕП" не вызывает иммуносупрессии и обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц. Штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические свойства Штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц относится к семейству Birnaviri-dae, роду Avibirnavirus, серотипу I и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона икосаэдрическая, размер вириона 58-60 нм. Капсид Т13, оболочка отсутствует. Антигенные свойства По своим антигенным свойствам штамм "К-58 №122-ДЕП" относится к сероварианту I. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА-1:400-1:10000 и более, при гипериммунизации в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА>1:10000. Для определения генотаксономической гомологии вакцинного штамма "К-58 №122-ДЕП" и полевых изолятов вируса ИББ сравнили вариабельные области VP2 полевых изолятов (37 образцов, выделенных в 1993-1996 гг. на территории РФ и странах СНГ) и вакцинных штаммов (7 образцов коммерческих живых вакцин). Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Taq-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный эпитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей-Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5-8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "К-58 №122-ДЕП". Биотехнологические характеристики Штамм "К-58 №122-ДЕП" предназначен для изготовления живой и инактивированной вакцин и диагностических биопрепаратов. Штамм "К-58 №122-ДЕП" репродуцируется в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур при температуре 37,7°С и влажности 55-64%. В течение 72-96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см 3. Хемо- и генотаксономическая характеристика Штамм "К-58 №122-ДЕП" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой РНК 2,16×106 Da. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирус имеет белковую оболочку, образованную 5 видами белков (VP1, VP2, VP3, VP4 и VP5): VP1 - РНК-зависимая РНК-полимераза; VP2, VP3 - структурные белки; VP4 - протеаза; VP5 - не идентифицирован. Липиды отсутствуют. Штамм "К-58 №122-ДЕП" проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в области РНК, кодирующей VP2. Мутации, ведущие к замене аминокислот, определяют антигенную вариабельность VP2. Штамм "К-58 №122-ДЕП" проявляет высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993-1996 г. Физические свойства Масса вириона составляет 55,0×106 Da. Коэффициент седиментации 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33-1,34 г/см3 в градиенте CsCl. Устойчивость к внешним факторам Штамм "К-58 №122-ДЕП" устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению и высыханию. Дополнительные признаки и свойства Иммуногенная активность - 100%. Реактогенность - отсутствует. Патогенность - отсутствует. Вирулентность - отсутствует. Онкогенность - отсутствует. Контагиозность - отсутствует. Штамм "К-58 №122-ДЕП" является стабильным и не вызывает иммуносупрессии. По безопасности и иммуногенности штамм "К-58 №122-ДЕП" полностью отвечает требованиям О.I.E. (МЭБ). Комиссионные испытания подтвердили полное соответствие штамма "К-58 №122-ДЕП" предъявляемым требованиям и явились основанием для его депонирования во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. На основании приведенных сведений можно утверждать, что штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц по антигенному и иммуногенному спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ИББ птиц. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения. Пример 1 Матровую расплодку вируса из штамма "К-58 №122-ДЕП" в эмбрионах SPF-кур получают следующим образом. На границе подскорлупной оболочки и хориоаллантоисной оболочки (ХАО) делают насечку, не повреждая ХАО, и затем с помощью шприца вводят вируссодержащий материал в количестве 0,2 см3 на ХАО. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают, экстрагируют при температуре 4°С в течение 45 минут, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5, центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Полученную вируссодержащую жидкость с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см 3 используют в качестве матровой расплодки. Пример 2 На первом этапе готовят матровый материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц так, как описано в примере 1. Полученную вируссодержащую жидкость используют для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур. Вирусный материал в количестве 0,2 см3 вводят на ХАО и инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С и полученное сырье используют для изготовления вакцины. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют в течение 45 минут при температуре 4°С, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5 и центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин, очищая его таким образом от балластных примесей. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор для инактивации вируса. Из инактивантов используют ДЭИ в виде 15% водного раствора, рН 7,9-8,0. В подогретую до 27°С вируссодержащую суспензию с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см 3 вносят ДЭИ в количестве, соответствующем его 0,1-0,3 мас.% содержанию в готовом препарате. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 27°С в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8°С. Из адъювантов - сорбентов в вакцине используют стерильный 3-4% гель ГОА. Значение рН ГОА устанавливают в пределах 7,5-7,6 и охлаждают до 2-8°С. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют ГОА в количестве, соответствующем его 12,7-44,4 мас.% содержанию в готовом препарате. Затем к смеси дополнительно добавляют 10% водный раствор сапонина в количестве, соответствующем его 0,5-2,0 мас.% содержанию в готовом препарате. Смесь перемешивают в течение часа, определяют рН препарата и при необходимости доводят его значение до 7,4-7,6. Полученная вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь. Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность и фасуют в стерильные флаконы. Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89 (ст. СЭВ 6280-88). Авирулентность препарата определяют методом трехкратных "слепых" пассажей вакцины на развивающихся SPF-эмбрионах 10-суточного возраста. Вакцину применяют клинически здоровой птице для создания высокого уровня иммунитета. Птиц вакцинируют в возрасте 110-120 суток однократно. Препарат вводят внутримышечно в объеме 0,5 мл. Иммунитету вакцинированной птицы наступает на 14-21 сутки после вакцинации и сохраняется до 12 месяцев. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ у птиц "родительской стаи" и обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 15-25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевого вирулентного вируса ИББ в ранний период жизни. Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав (мас.%), представленный в таблице 1. Содержание антигена в предлагаемой вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающем достижение технического результата. Пример 3. Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 сутки у птиц брали кровь, получали сыворотки и затем исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной сорбированой вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП". Пример 4. Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 сутки после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител против ИББ. Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП". Пример 5. Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 сутки у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 4. Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП". Пример 6. Проведена сравнительная оценка иммуногенной активности вакцины-прототипа и инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность вакцин определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител против вируса ИББ. Вакцины вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице 5. Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что жидкая инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, изготовленная из аттенуированного штамма "К-58 №122-ДЕП", значительно превосходит вакцину против ИББ (титр антител выше в 1,88 раза), изготовленную из штамма "БГ" №102-ДЕП", и обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 15-25-суточного возраста, что позволяет защитить его от заболевания ИББ в ранний период жизни. Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий: - для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов; - инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, приготовленная из штамма "К-58 №122-ДЕП" в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Источники информации 1. Пат. США №4530831, 424-89, 23.07.85 г. 2. Пат. Венгрии №203781; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12; 28.08.90 г. 3. Пат. США №6451321, 424-204.1, 17.09.02 г. 4. Пат. РФ №2127603; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 20.03.99 г. (прототип).
1. Инактивированная сорбированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и, по меньшей мере, один адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигенного материала она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц (Bursitis infectiosa gallinae), семейства Birnaviridae, рода Avibirnavirus, серотипа 1, коллекция ФГУ ВГНКИ «К-58 №122-ДЕП», в эффективном количестве. 2. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации. 3. Инактивированная сорбированная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%. 4. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из инактивантов она содержит димер этиленимина (ДЭИ). 5. Инактивированная сорбированная вакцина по п.4, отличающаяся тем, что она содержит ДЭИ в виде 15%-ного водного раствора. 6. Инактивированная сорбированная вакцина по п.5, отличающаяся тем, что она содержит ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%. 7. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит гидроокись алюминия (ГОА). 8. Инактивированная сорбированная вакцина по п.7, отличающаяся тем, что она содержит ГОА в виде 3-4% геля. 9. Инактивированная сорбированная вакцина по п.8, отличающаяся тем, что она содержит ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%. 10. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит дополнительно сапонин. 11. Инактивированная сорбированная вакцина по п.10, отличающаяся тем, что она содержит сапонин в виде 10%-ного водного раствора. 12. Инактивированная сорбированная вакцина по п.11, отличающаяся тем, что она содержит сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%. 13. Инактивированная сорбированная вакцина по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
www.findpatent.ru Презентация на тему: Достоинства живых вакцин: Высокая приживляемость вакцинных штаммов Длительная их персистенция в организме Сохранение протективных антигенов (продуцируют достаточно эффективный клеточный и гуморальный иммунитет ) Иммунизация ими несложна и в большинстве случаев однократна  Недостатки живых вакцин:Трудно стандартизировать Трудно сохранять в стерильном состоянии Сложность в поддержании стабильной иммуногенности и приживляемости Могут вызвать осложнения Способны вызывать мутации клеток организма (хромосомные абберации) – опасно в отношении половых клеток Содержат вирусы-контаминаты(опасно в отношении онковирусов)  Недостатки живых вакцин:Трудно дозируются и поддаются биоконтролю Чувствительны к действию высоких температур, требуют соблюдения холодовой цепи Вводятся парентерально Возможность риверсии вирулентных форм Пациенты с иммунодефицитами (получающие иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны получать такие вакцины Живые вакцины в основном выпускаются в лиофилизированном виде  Инактивированные (убитые) вакциныполучают путем воздействия на микроорганизмы химическим путем или нагреванием: -гретые вакцины -формоловые, карболовые, спиртовые, ацетоновые,  Достоинства инактивированных вакциндостаточно стабильны не могут вызвать реверсию вирулентности не требуют хранения на холоде Недостатки: сложность в приготовлении (сложные питательные среды) требуют кратности введения (микробный штамм не приживляется) реактогенны (содержат до 99% балластных веществ) (вакцины против коклюша, брюшного тифа,  Достоинства химических вакцинВысокая степень очистки Повышенная иммуногенность препарата Антигены концентрированы в небольшом объеме жидкости Применяются в ассоциациях Возможность адсорбции на веществах, понижающих реактогенность и повышающих иммуногенность  Анатоксины – используют для активной иммунизации токсинемических инфекцийИммунитет, индуцируемый анатоксином, нейтрализует экзотоксин, но не оказывает влияния на бактерии-продуцентыэтого токсина и их  Получение анатоксина: экзотоксин подвергают обработке формалином (0,3-0,8%)при35-400Св течении3-4недель. Очищают от балластных веществ, концентрируют, адсорбируют на гидрате окиси алюминия, фосфате алюминия и др. сорбентах Токсины утрачивают токсигенность, сохраняют антигенность  Сорбированные вакциныСорбенты оказывают адъювантное действие: Вызывают в месте введения легкую воспалительную реакцию, активируют захват и резорбцию антигена - Создают депо, обеспечивая пролонгированное действие антигена, уменьшая кратность вакцинации при сохранении высокого studfiles.net Инактивированная сорбированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птицИзобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. ИББ птиц (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) - широко распространенная высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят, преимущественно в возрасте 15-80 суток, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. ИББ поражает, в основном, β.GIF; -лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. ИББ протекает остро, с характерной клиникой заболевания и субклинически. Субклиническая форма имеет широкое распространение. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднение при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза заболевания. ИББ птиц зарегистрирована во всех странах мира. В последние годы ИББ получила широкое распространение в большинстве крупных птицеводческих хозяйств России. Применение отечественных и импортных биопрепаратов в очагах инфекции не обеспечило ожидаемого эффекта. Это объясняется тем, что их применению не предшествовало изучение антигенных свойств циркулирующих изолятов вируса ИББ, не определялись специфические антитела птицы до и после вакцинации, а также уровень пассивного материнского иммунитета у цыплят. Не учитывалась известная особенность возбудителя ИББ - его антигенная изменчивость в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки и на разных территориях и зависящая от видового и породного состава птичьего поголовья, его иммунного статуса, и множество других факторов. В связи с этим выбор вакцинного штамма вируса ИББ птиц должен проводиться с учетом антигенной структуры эпизоотического изолята и для приготовления вакцинных препаратов необходимо использовать производственные штаммы, обладающие наибольшей степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическими изолятами вируса ИББ. Экономический ущерб от ИББ, обусловленный гибелью до 20-70% поголовья цыплят при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также в результате возникновения вторичных инфекций, очень велик. В настоящее время общепризнано, что единственно правильным и надежным направлением в борьбе с инфекцией является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики ИББ используют живые и инактивированные вакцины из гомологичных штаммов возбудителя инфекции, выращенных в различных чувствительных биологических системах. В большинстве птицехозяйств цыплят прививают 2-кратно живыми вакцинами, а ревакцинируют в 16-20-недельном возрасте инактивированной вакциной. Это обусловлено тем, что при ИББ введение живых вакцин взрослой птице не формирует у нее напряженный иммунитет, что связано с ее возрастными особенностями. По этой причине для специфической профилактики ИББ взрослой птицы широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные. При изготовлении инактивированной вакцины широко используют вирулентные штаммы вируса ИББ птиц. Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма Д78, АТСС №VP-2041, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур [1]. Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, сордержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма GP/82, NCAJM №V(Р)-001033, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали культуру клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур [2]. Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма 689, ЕСАСС №V00012609, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении [3]. Основной недостаток известных вакцин состоит в том, что они являются импортными препаратами и не обеспечивают удовлетворительной защиты против вируса ИББ птиц, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации. Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма "БГ" №102-ДЕП", полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и, по меньшей мере, один адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур [4]. Недостаток вакцины-прототипа состоит в том, что она обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью. В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной сорбированной вакцины на основе нового штамма вируса ИББ птиц, обладающего более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью в нативном виде и после инактивации. Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности и безвредности предлагаемой вакцины. Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков: 1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц. 2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, в эффективном количестве. 3. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. 4. В качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур. 5. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации. 6. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%. 7. Инактивант. 8. Из инактивантов димер этиленимина (ДЭИ). 9. ДЭИ в виде 15% водного раствора. 10. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%. 11. Адъювант. 12. Из адъювантов гидроокись алюминия (ГОА). 13. ГОА в виде 3-4% геля. 14. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%. 15. Из адъювантов дополнительно сапонин. 16. Сапонин в виде 10% водного раствора. 17. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%. 18. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
Предлагаемое изобретение содержит следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц. 2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, в эффективном количестве. 3. Инактивант. 4. По меньшей мере, один адъювант. Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования: 1. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД 50/0,2см3 и подвергнутый инактивации. 2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%. 3. Из инактивантов ДЭИ. 4. ДЭИ в виде 15% водного раствора. 5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%. 6. Из адъювантов ГОА. 7. ГОА в виде 3-4% геля. 8. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%. 9. Из адъювантов дополнительно сапонин. 10. Сапонин в виде 10% водного раствора. 11. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%. 12. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются: 1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц. 2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации. 3. Инактивант. 4. По меньшей мере, один адъювант. По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что она содержит эффективное количество антигенного материала из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования: 1. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации. 2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД 50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%. 3. Из инактивантов ДЭИ. 4. ДЭИ в виде 15% водного раствора. 5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%. 6. Из адъювантов ГОА. 7. ГОА в виде 3-4% геля. 8. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%. 9. Из адъювантов дополнительно сапонин. 10. Сапонин в виде 10% водного раствора. 11. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%. 12. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
По сравнению с вакциной-прототипом инактивированная сорбированная вакцина на основе штамма "К-58 №122-ДЕП" обладает более высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной. Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что в ее состав введен вирусный материал из нового аттенуированного штамма "К-58 №122-ДЕП", гомологичного возбудителю инфекции и не вызывающего иммуносупрессии у привитой птицы. Исходный вирус (авторское наименование изолята "К-58") для получения штамма "К-58 №122-ДЕП" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров на птицефабрике "Васильевская" Пензенской области в 1994 году. Вакцинный штамм "К-58 №122-ДЕП" получен путем многократных последовательных пассажей исходного изолята на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и SPF-цыплятах. Штамм "К-58" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. По сравнению со штаммом "БГ" №102-ДЕП" штамм "К-58 №122-ДЕП" не вызывает иммуносупрессии и обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц. Штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические свойства Штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц относится к семейству Birnaviri-dae, роду Avibirnavirus, серотипу I и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона икосаэдрическая, размер вириона 58-60 нм. Капсид Т13, оболочка отсутствует. Антигенные свойства По своим антигенным свойствам штамм "К-58 №122-ДЕП" относится к сероварианту I. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА-1:400-1:10000 и более, при гипериммунизации в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА>1:10000. Для определения генотаксономической гомологии вакцинного штамма "К-58 №122-ДЕП" и полевых изолятов вируса ИББ сравнили вариабельные области VP2 полевых изолятов (37 образцов, выделенных в 1993-1996 гг. на территории РФ и странах СНГ) и вакцинных штаммов (7 образцов коммерческих живых вакцин). Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Taq-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный эпитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей-Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5-8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "К-58 №122-ДЕП". Биотехнологические характеристики Штамм "К-58 №122-ДЕП" предназначен для изготовления живой и инактивированной вакцин и диагностических биопрепаратов. Штамм "К-58 №122-ДЕП" репродуцируется в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур при температуре 37,7°С и влажности 55-64%. В течение 72-96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см 3. Хемо- и генотаксономическая характеристика Штамм "К-58 №122-ДЕП" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой РНК 2,16×106 Da. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирус имеет белковую оболочку, образованную 5 видами белков (VP1, VP2, VP3, VP4 и VP5): VP1 - РНК-зависимая РНК-полимераза; VP2, VP3 - структурные белки; VP4 - протеаза; VP5 - не идентифицирован. Липиды отсутствуют. Штамм "К-58 №122-ДЕП" проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в области РНК, кодирующей VP2. Мутации, ведущие к замене аминокислот, определяют антигенную вариабельность VP2. Штамм "К-58 №122-ДЕП" проявляет высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993-1996 г. Физические свойства Масса вириона составляет 55,0×106 Da. Коэффициент седиментации 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33-1,34 г/см 3 в градиенте CsCl. Устойчивость к внешним факторам Штамм "К-58 №122-ДЕП" устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ.GIF; -облучению и высыханию. Дополнительные признаки и свойства Иммуногенная активность - 100%. Реактогенность - отсутствует. Патогенность - отсутствует. Вирулентность - отсутствует. Онкогенность - отсутствует. Контагиозность - отсутствует. Штамм "К-58 №122-ДЕП" является стабильным и не вызывает иммуносупрессии. По безопасности и иммуногенности штамм "К-58 №122-ДЕП" полностью отвечает требованиям О.I.E. (МЭБ). Комиссионные испытания подтвердили полное соответствие штамма "К-58 №122-ДЕП" предъявляемым требованиям и явились основанием для его депонирования во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц. На основании приведенных сведений можно утверждать, что штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц по антигенному и иммуногенному спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ИББ птиц. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения. Пример 1 Матровую расплодку вируса из штамма "К-58 №122-ДЕП" в эмбрионах SPF-кур получают следующим образом. На границе подскорлупной оболочки и хориоаллантоисной оболочки (ХАО) делают насечку, не повреждая ХАО, и затем с помощью шприца вводят вируссодержащий материал в количестве 0,2 см3 на ХАО. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают, экстрагируют при температуре 4°С в течение 45 минут, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5, центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Полученную вируссодержащую жидкость с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см3 используют в качестве матровой расплодки. Пример 2 На первом этапе готовят матровый материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц так, как описано в примере 1. Полученную вируссодержащую жидкость используют для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур. Вирусный материал в количестве 0,2 см3 вводят на ХАО и инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С и полученное сырье используют для изготовления вакцины. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют в течение 45 минут при температуре 4°С, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5 и центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин, очищая его таким образом от балластных примесей. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор для инактивации вируса. Из инактивантов используют ДЭИ в виде 15% водного раствора, рН 7,9-8,0. В подогретую до 27°С вируссодержащую суспензию с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см3 вносят ДЭИ в количестве, соответствующем его 0,1-0,3 мас.% содержанию в готовом препарате. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 27°С в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8°С. Из адъювантов - сорбентов в вакцине используют стерильный 3-4% гель ГОА. Значение рН ГОА устанавливают в пределах 7,5-7,6 и охлаждают до 2-8°С. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют ГОА в количестве, соответствующем его 12,7-44,4 мас.% содержанию в готовом препарате. Затем к смеси дополнительно добавляют 10% водный раствор сапонина в количестве, соответствующем его 0,5-2,0 мас.% содержанию в готовом препарате. Смесь перемешивают в течение часа, определяют рН препарата и при необходимости доводят его значение до 7,4-7,6. Полученная вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь. Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность и фасуют в стерильные флаконы. Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89 (ст. СЭВ 6280-88). Авирулентность препарата определяют методом трехкратных "слепых" пассажей вакцины на развивающихся SPF-эмбрионах 10-суточного возраста. Вакцину применяют клинически здоровой птице для создания высокого уровня иммунитета. Птиц вакцинируют в возрасте 110-120 суток однократно. Препарат вводят внутримышечно в объеме 0,5 мл. Иммунитету вакцинированной птицы наступает на 14-21 сутки после вакцинации и сохраняется до 12 месяцев. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ у птиц "родительской стаи" и обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 15-25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевого вирулентного вируса ИББ в ранний период жизни. Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав (мас.%), представленный в таблице 1. Содержание антигена в предлагаемой вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающем достижение технического результата. Пример 3. Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 сутки у птиц брали кровь, получали сыворотки и затем исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной сорбированой вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП". Пример 4. Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 сутки после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител против ИББ. Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП". Пример 5. Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 сутки у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 4. Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП". Пример 6. Проведена сравнительная оценка иммуногенной активности вакцины-прототипа и инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
Иммуногенную активность вакцин определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител против вируса ИББ. Вакцины вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице 5. Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что жидкая инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, изготовленная из аттенуированного штамма "К-58 №122-ДЕП", значительно превосходит вакцину против ИББ (титр антител выше в 1,88 раза), изготовленную из штамма "БГ" №102-ДЕП", и обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 15-25-суточного возраста, что позволяет защитить его от заболевания ИББ в ранний период жизни. Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий: - для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов; - инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, приготовленная из штамма "К-58 №122-ДЕП" в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Источники информации 1. Пат. США №4530831, 424-89, 23.07.85 г. 2. Пат. Венгрии №203781; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12; 28.08.90 г. 3. Пат. США №6451321, 424-204.1, 17.09.02 г. 4. Пат. РФ №2127603; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 20.03.99 г. (прототип).
bankpatentov.ru |
хлороформенные
паратифов, холеры, лептоспирозов, клещевого энцефалита, гриппа)
эндотоксины
и иммуногенность
профилактического эффекта
 г.Самара, ул. Димитрова 131 [email protected] |
 |