ГОСТ Р 53912-2010 Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков. Антибиотики гост

Антибиотики | Новости GMP

Антибиотики — вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших.

По ГОСТ 21507-81 (СТ СЭВ 1740-79)Антибиотик — вещество микробного, животного или растительного происхождения, способное подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель.

Антибиотики природного происхождения чаще всего продуцируются актиномицетами, реже — немицелиальными бактериями.

— Некоторые антибиотики оказывают сильное подавляющее действие на рост и размножение бактерий и при этом относительно мало повреждают или вовсе не повреждают клетки макроорганизма, и поэтому применяются в качестве лекарственных средств;— Некоторые антибиотики используются в качестве цитостатических (противоопухолевых) препаратов при лечении онкологических заболеваний.

Терминология

Полностью синтетические препараты, не имеющие природных аналогов и оказывающие сходное с антибиотиками подавляющее влияние на рост бактерий, традиционно было принято называть не антибиотиками, а антибактериальными химиопрепаратами. В частности, когда из антибактериальных химиопрепаратов известны были только сульфаниламиды, принято было говорить обо всём классе антибактериальных препаратов как об «антибиотиках и сульфаниламидах». Однако в последние десятилетия в связи с изобретением многих весьма сильных антибактериальных химиопрепаратов, в частности фторхинолонов, приближающихся или превышающих по активности «традиционные» антибиотики, понятие «антибиотик» стало размываться и расширяться и теперь часто употребляется не только по отношению к природным и полусинтетическим соединениям, но и к многим сильным антибактериальным химиопрепаратам.

Классификация

Огромное разнообразие антибиотиков и видов их воздействия на организм человека явилось причиной классифицирования и разделения антибиотиков на группы. По характеру воздействия на бактериальную клетку антибиотики можно разделить на три группы:

— бактериостатические (бактерии живы, но не в состоянии размножаться),— бактерициды (бактерии умертвляются, но физически продолжают присутствовать в среде),— бактериолитические (бактерии умертвляются, и бактериальные клеточные стенки разрушаются).

Классификация по химической структуре, которую широко используют в медицинской среде, состоит из следующих групп:

— Бета-лактамные антибиотики, делящиеся на две подгруппы:o Пенициллины — вырабатываются колониями плесневого грибка Penicillium;o Цефалоспорины — обладают схожей структурой с пенициллинами. Используются по отношению к пенициллинустойчивым бактериям.

— Макролиды — антибиотики со сложной циклической структурой. Действие — бактериостатическое.

— Тетрациклины — используются для лечения инфекций дыхательных и мочевыводящих путей, лечения тяжелых инфекций типа сибирской язвы, туляремии, бруцеллёза. Действие — бактериостатическое.

— Аминогликозиды — обладают высокой токсичностью. Используются для лечения тяжелых инфекций типа заражения крови или перитонитов.

— Левомицетины — Использование ограничено по причине повышенной опасности серьезных осложнений — поражении костного мозга, вырабатывающего клетки крови. Действие — бактерицидное.

— Гликопептидные антибиотики нарушают синтез клеточной стенки бактерий. Оказывают бактерицидное действие, однако в отношении энтерококков, некоторых стрептококков и стафилококков действуют бактериостатически.

— Линкозамиды оказывают бактериостатическое действие, которое обусловлено ингибированием синтеза белка рибосомами. В высоких концентрациях в отношении высокочувствительных микроорганизмов могут проявлять бактерицидный эффект.

— Противогрибковые — разрушают мембрану клеток грибков и вызывают их гибель. Действие — литическое. Постепенно вытесняются высокоэффективными синтетическими противогрибковыми препаратами.

Источник: Википедия

gmpnews.ru

ГОСТ Р 51600-2000 Молоко. Методы определения наличия антибиотиков

ГОСТ Р 51600-2000

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО

Методы определения наличия антибиотиков

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 «Молоко и молочные продукты»

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 г. № 127-ст

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ИЗДАНИЕ (август 2010 г.) с Изменениями № 1, 2, утвержденными в феврале 2006 г., январе 2008 г. (ИУС 4-2006, 4-2008)

ГОСТ Р 51600-2000

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Дата введения 2001-07-01

Настоящий стандарт распространяется на натуральное коровье молоко - сырье, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее - молоко) и устанавливает микробиологические и рецепторные методы определения наличия антибиотиков.

Раздел 1(Измененная редакция, Изм. № 1, 2).

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ

ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды

ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака

ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

3.1 Сущность метода

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.

3.2 Аппаратура, реактивы и материалы

3.2.1 Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2 - 3.2.16.

3.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

3.2.3 Центрифуга частотой вращения 3000 мин-1 и разделяющим фактором 750 м/с2.

3.2.4 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

3.2.5 Колба коническая по ГОСТ 25336, вместимостью 250 см3.

3.2.6 Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.

3.2.7 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное № 4.

3.2.8 Пипетка градуированная по ГОСТ 29227, 2-го класса точности, вместимостью 25 см3.

3.2.9 Гидролизат кормовых дрожжей.

3.2.10 Диски со стрептомицином.

3.2.11 Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.

3.2.12 Препарат СКИВ.

3.2.13 Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.

3.2.14 Тест-микроб Вас. stearothermophilus ВКМВ-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

3.2.15 Фуксин основной, спиртовой раствор концентрации 50 г/дм3.

3.2.16 Экстракт дрожжевой.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.

3.3 Отбор проб

3.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225.

3.3.2 Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 24 ч.

3.3.3 Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.

3.4 Подготовка к анализу

3.4.1 Подготовка посуды и материалов

3.4.1.1 Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1 % - 2 %) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.

Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160 ± 5) °С в течение 2 ч или в автоклаве при (121 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин с последующим подсушиванием.

Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

3.4.2 Приготовление питательных сред

3.4.2.1 Для получения спор Вас. stearothermophilus ВКМВ-510 используют питательную среду следующего состава: дрожжевой экстракт - 10,0 г, пептон - 20,0 г, глюкоза - 0,5 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см3.

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают все компоненты питательной среды, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем раствора водой до метки и устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,1 ± 0,1). Разливают раствор в колбы по 200,0 см3 и стерилизуют его при температуре (121 ± 2) °С в течение (15 ± 1) мин.

3.4.2.2 Для проведения анализа готовят агаровую среду следующего состава: гидролизат кормовых дрожжей - 1,0 г, пептон - 0,4 г, хлористый натрий - 0,1 г, агар - 1,6 г, дистиллированная вода - до 100,0 см3.

В колбу вместимостью 200 см3 вносят 100 см3 дистиллированной воды и все компоненты среды, перемешивают до полного растворения и нагревают до кипения. Затем охлаждают до температуры (55 ± 5) °С, устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,3 ± 0,1), и стерилизуют при температуре (121 ± 2) °С в течение (15 ± 1) мин.

3.4.2.3 Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.

3.4.3 Получение спор тест-микроба

3.4.3.1 Среду по 3.4.2.1 засевают 2 - 3 см3 18 - 20-часовой тест-культуры Вас. stearothermophilus ВКМВ-510, выращенной в пробирках с этой же средой, тщательно перемешивают и помещают в термостат температурой (55 ± 1) °С на 3 сут.

После окончания инкубации из посевов делают мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина 50 г/дм3 и микроскопируют.

При наличии в поле зрения 90 % - 95 % свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16 - 18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. Пробирки центрифугируют 20 - 30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.

Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.

3.4.4 Приготовление засеянной агаровой среды

3.4.4.1 В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.

3.4.4.2 К 100 см3 расплавленной и охлажденной до (60 ± 2) °С среды по 3.4.2.2 добавляют 2,5 см3 водного раствора глюкозы массовой долей 40 % и 4 см3 суспензии спор по 3.4.4.1. Смесь среды и спор тщательно перемешивают и разливают градуированной пипеткой по (11 ± 1) см3 в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности стола.

3.4.4.3 Чашки засевают непосредственно перед употреблением.

В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

3.4.5 Приготовление обезжиренного стерильного молока

3.4.5.1 Обезжиренное стерильное молоко получают из цельного молока кислотностью 16 - 18 Т, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. В пробирки разливают обезжиренное молоко по 10 см3 и стерилизуют при 105 Па (1 атм) в течение (10 ± 1) мин.

Допускается использовать препарат СКИВ.

3.4.6 Приготовление контрольного разведения стрептомицина активностью 2,5 мкг/см3 (Ед/г).

3.4.6.1 Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.

3.4.6.2 Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.

Состав раствора 1: двузамещенный фосфорнокислый калий - 2,0 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 8,0 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см3.

В мерной колбе вместимостью 1000 см3 растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (6,1 ± 0,1), и стерилизуют при температуре (112 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5 ± 1) °С.

Состав раствора 2: двузамещенный фосфорнокислый калий - 16,73 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,523 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см3.

В мерной колбе вместимостью 1000 см3 растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (7,9 ± 0,1), и стерилизуют при температуре (112 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5 ± 1) °С.

3.4.6.3 Контрольное разведение готовят из основного раствора стрептомицина активностью 500 мкг/см3, который получают растворением 5 мг стандарта антибиотика, взвешенного с отсчетом показания весов до 0,1 мг, в буферном растворе 1 по 3.4.6.2. Объем буферного раствора составляет 0,01 активности антибиотика.

Пример: При активности стандарта стрептомицина 760 мкг/мг навеску антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см3 буферного раствора 1 и получают основной раствор активностью 500 мкг/см3.

Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5 ± 1) °С.

Из основного раствора в трех пробирках готовят серию разведений антибиотика. В первую пробирку наливают 1 см3 буферного раствора 2 по 3.4.6.2 и 1 см3 основного раствора, во вторую - 9 см3 буферного раствора 2 и 1 см3 раствора из первой пробирки, в третью - 9 см3 стерильного обезжиренного молока по 3.4.5 и 1 см3 раствора из второй пробирки. Активность антибиотика в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см3. Разведение антибиотика в молоке активностью 2,5 мкг/см3 является контрольным.

Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего дня.

3.4.6.4 Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.

3.4.7 Подготовка проб молока к анализу

Каждую пробу молока наливают по 5 - 10 см3 в чистую стерильную пробирку, прогревают в течение (10 ± 1) мин на водяной бане при температуре внутри пробирки (87 ± 2) °С и охлаждают в холодной воде до температуры 18 % - 25 °С.

3.5 Проведение анализа

3.5.1 Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.

3.5.2 В центральную лунку вносят 0,05 см3 контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.3 или в центре чашки на поверхность засеянной агаровой среды помещают диск со стрептомицином по 3.2.10. В лунки, расположенные по окружности чашки, вносят по 0,05 см3 исследуемых проб молока по 3.4.7.

3.5.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20 ± 1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 ± 1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

Рисунок 1 – Схема вырезания лунок в агаровой среде

3.6 Обработка результатов

3.6.1 Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.

Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.

3.6.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.

3.6.3 При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии - 12 мм и более.

3.7 Метрологические характеристики

3.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.

Таблица 1

4.1 Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis С953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски - при их наличии.

4.2 Аппаратура, материалы и реактивы

4.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру от 30 °С до 70 °С с допускаемыми отклонениями ± 0,5 °С от заданной.

(Измененная редакция, Изм. № 2).

4.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

4.2.3 Ампулы «Delvotest ® SP», герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см3 с агаровой средой, содержащей споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.

4.2.4 Среда питательная таблетированная «Delvotest ® SP», фасованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком.

4.2.3, 4.2.4 (Измененная редакция, Изм. № 1).

4.2.5 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см3, настроенный на объем пробы 0,1 см3.

4.2.6 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см3.

4.2.7 Пинцет.

4.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.2.9 Ампулы «Delvotest ® SP-NT» или «Delvotest ® SP MINI-NT», герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см3 с агаровой и питательной средой, содержащей споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.

(Введен дополнительно, Изм. № 1).

4.2.10 Тестовый набор «Copan Test®» - комплект, включающий герметично укупоренные пробирки, собранные в блоки, и содержащие споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis, помещенные в агар с питательными веществами и индикатором бромкрезолпурпуром; пипетки мерные вместимостью 0,1 см3 одноразового использования и цветовую шкалу [3].

4.2.11 Пипетки вместимостью 0,1 см3 для отбора образцов молока для исследования по ГОСТ 29169.

4.2.10, 4.2.11 (Введены дополнительно, Изм. № 2).

4.3 Отбор проб

4.3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 9225.

4.3.2 Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6 ± 2) °С.

4.4 Подготовка к анализу

4.4.1 Подготовка к анализу ампул по 4.2.3 и бутылочек по 4.2.4

Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °С.

(Измененная редакция, Изм. № 1).

4.4.2 Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6 ± 2) °С.

(Измененная редакция, Изм. № 2).

4.4.3 Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.

4.4.4 Подготовка к анализу ампул или пробирок - по 4.2.9 или 4.2.10.

Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6 ± 2) °С.

(Измененная редакция, Изм. № 2).

4.5 Проведение анализа

4.5.1 Проведение анализа с использованием ампул «Delvotest® SP», «Delvotest® SP-NT» или «Delvotest® SP MINI-NT»

4.5.1.1 Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул по 4.2.3 или 4.2.9.

4.5.1.2 В каждую открытую ампулу по 4.2.3 пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды «Delvotest® SP», взятой из колпачка бутылочки по 4.4.3. Затем бутылочку плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20 ± 2) °С.

4.5.1.3 Шприцем-дозатором отбирают 0,1 см3 анализируемого молока и вносят в каждую ампулу по 4.5.1.2 или 4.2.9. Для каждой пробы анализируемого молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6 ± 2) °С.

4.5.1.4 Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0 ± 0,5) °С в течение 3 ч.

4.5.2 Проведение анализа с использованием тестового набора «Сорап Test®»

4.5.2.1 Одноразовой мерной пипеткой отбирают 0,1 см3 анализируемого молока и вносят в пробирку с приоткрытой фольгой по 4.2.10. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6 ± 2) °С.

4.5.2.2 Пробирки с анализируемым молоком закрывают фольгой и помещают в блок термостатируемых ячеек и выдерживают при температуре (64,5 ± 0,5) °С в течение 3 ч.

4.5.2.3 Контрольное определение проводят в соответствии с 4.5.1, 4.5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см3 предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ».

4.5 – 4.5.2.3 (Измененная редакция, Изм. № 2).

4.6 Обработка результатов

4.6.1 Ампулы или пробирки извлекают из термостата или блока термостатируемых ячеек и определяют цвет содержимого.

4.6.2 Желтый цвет содержимого ампул или пробирок с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.

4.6.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул или пробирок с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.

4.6.1 - 4.6.3 (Измененная редакция, Изм. № 2).

4.6.4 Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065 - ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.

4.7 Метрологические характеристики

4.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.

Таблица 2

(Измененная редакция, Изм. № 2).

5.1 Рецепторный метод с 3,3,5,5-триметилбензидином и диметилсульфоксидом

5.1.1 Сущность метода

Метод основан на иммуноферментной реакции, в процессе которой антибиотики бета-лактамного типа захватываются специфическими белковыми рецепторами, меченными ферментом, содержащим индикатор, с образованием химически прочного окрашенного комплекса при взаимодействии с молоком, содержащим антибиотики.

Наличие или отсутствие пенициллина и антибиотиков бета-лактамного типа (ампициллина, цефапирина, амоксициллина, цефтиофура, клоксациллина, диклоксациллина, цефалониума, цефалексина, нафцил-лина, цефазолина, цефкуинома, цефацетрила, оксациллина, цефапера-зона) устанавливают, сравнивая цвет зоны анализируемого молока с цветом контрольной зоны индикаторного устройства «Snap®».

5.1.2 Аппаратура, материалы и реактивы

5.1.2.1 Термостат, позволяющий поддерживать температуру (45 ± 5) °С.

5.1.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.1.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.1.2.4 Тест-набор Бета-лактам «Snap®», одноразовый комплект в герметичной упаковке, включающий пробирку «Snap®» с 3,3,5,5-триметилбензидином, укупоренную; пипетку мерную вместимостью 0,4 см3; индикаторное устройство «Snap®» с диметилсульфоксидом по [1].

Тест-набор Бета-лактам «Snap®» хранят в холодильнике при температуре от 0 °С до 7 °С. Необходимое число комплектов для работы в течение суток допускается хранить при температуре (20 ± 2) °С.

5.1.3 Отбор проб

5.1.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6 ± 2) °С.

5.1.4 Подготовка к анализу

5.1.4.1 Термостат нагревают до температуры (45 ± 5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.1.4.2 Вскрывают упаковку тест-набора Бета-лактам «Snap®», проверяют положение шарика реактива в пробирке по 5.1.2.4. Шарик реактива при заполнении пробирки молоком должен находиться на ее дне. При необходимости шарик реактива устанавливают встряхиванием пробирки на ее дно.

5.1.5 Проведение анализа

5.1.5.1 Мерную пипетку по 5.1.2.4 наполняют анализируемым молоком до метки.

5.1.5.2 Анализируемое молоко из пипетки выливают в пробирку. Пробирку закрывают и тщательно перемешивают круговыми движениями до растворения реактива. Пробирку и индикаторное устройство помещают в термостат и выдерживают при температуре (45 ± 5) °С в течение 5 - 6 мин.

5.1.5.3 Вынимают подогретое индикаторное устройство из термостата и устанавливают на горизонтальной поверхности так, чтобы приемная воронка для заливки анализируемым молоком находилась слева от оператора.

5.1.5.4 Содержимое пробирки переливают в приемную воронку индикаторного устройства.

5.1.5.5 При появлении анализируемого молока в круглом окне клавиши индикаторного устройства клавишу нажимают до упора для изменения тока жидкости и промывки пористого материала раствором антибиотиков. Включение индикаторного устройства сопровождается характерным щелчком клавиши.

5.1.5.6 Индикаторное устройство повторно помещают в термостат, выдерживают при температуре (45 ± 5) °С в течение 4 мин и извлекают из термостата. Стабильность окраски сохраняется в течение 15 мин после извлечения устройства из термостата.

5.1.6 Обработка результатов

5.1.6.1 Сравнивают цвет контрольной зоны в индикаторном окне с цветом зоны анализируемого молока.

5.1.6.2 Контрольная зона должна быть синего цвета. Если изменение цвета контрольной зоны после проведения процедур по 5.1.5.4 - 5.1.5.6 не произошло, то определение повторяют с новым тест-набором Бета-лактам «Snap®».

5.1.6.3 Если цвет зоны анализируемого молока на индикаторном устройстве аналогичен или темнее цвета контрольной зоны - пенициллин или антибиотики бета-лактамного типа в анализируемом молоке отсутствуют.

Белый или менее интенсивный цвет зоны анализируемого молока по сравнению с цветом контрольной зоны свидетельствует о наличии в анализируемом молоке пенициллина или антибиотиков бета-лактамного типа.

5.1 – 5.1.6.3 (Измененная редакция, Изм. № 1, 2).

5.2 Рецепторный метод с коллоидным золотом

5.2.1 Сущность метода

5.2.1.1 Метод основан на проведении реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционную и контрольную зоны.

5.2.2 Аппаратура, материалы и реактивы

5.2.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру (47,5 ± 0,5) °С.

5.2.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.2.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.2.2.4 Тест-набор «Beta Star®» [4], включающий флаконы со специфическими рецепторами, меченными коллоидным золотом; полоски хроматографической бумаги с зоной исследуемого молока и контрольной зоной; шприц-дозатор вместимостью 0,2 см3 с наконечниками.

5.2.3 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6 ± 2) °С.

5.2.4 Подготовка к анализу

5.2.4.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек нагревают до температуры (47,5 ± 0,5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.2.4.2 Флакон встряхивают для осаждения содержимого в нем на дно.

5.2.5 Проведение анализа

5.2.5.1 Шприцем-дозатором с наконечником отбирают 0,2 см3 анализируемого молока и переливают во флакон по 5.2.4.2. Флакон закрывают крышкой и встряхивают до полного растворения сухих веществ без образования пены.

5.2.5.2 Помещают флакон в термостат или блок термостатируемых ячеек по 5.2.2.1.

5.2.5.3 Не менее чем через 3 мин термостатирования во флакон, находящийся в термостате или в блоке термостатируемых ячеек, помещают входящую в комплект полоску хроматографической бумаги.

5.2.5.4 Хроматографирование проводят в течение 2 мин. Затем полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона.

5.2.6 Обработка результатов

5.2.6.1 Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появляющихся после проведения процедуры по 5.2.5.4 в виде линий на полосках хроматографической бумаги.

5.2.6.2 Зона на верхней части полоски является контрольной. Если ее окрашивания не произошло после выполнения требований по 5.2.5.3, 5.2.5.4, то повторяют все процедуры в соответствии с 5.2.

5.2.6.3 Зона исследуемого молока расположена под контрольной зоной. Большая или равная интенсивность цвета контрольной зоны, а также отсутствие окраски зоны образца является признаком наличия антибиотиков бета-лактамного типа в молоке.

5.2.6.4 Меньшая интенсивность цвета контрольной зоны, по сравнению с интенсивностью цвета зоны под ней, является признаком отсутствия антибиотиков.

5.2.6.5 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.1 и 5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см3 предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

5.2 – 5.2.6.5 (Введены дополнительно, Изм. № 2).

5.3 Метрологические характеристики

Наименьшие пределы определения антибиотиков бета-лактамного типа представлены в таблице 3.

Таблица 3

(Измененная редакция, Изм. № 1, 2).

Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [2].

Раздел 6. (Введен дополнительно, Изм. № 1).

ПРИЛОЖЕНИЕ А (Измененная редакция, Изм. № 1, 2).

Ключевые слова: молоко, ингибирующие вещества, антибиотики, тест-микроб, зона ингибиции, антибиотики бета-лактамного типа, сульфаниламидные препараты

СОДЕРЖАНИЕ

files.stroyinf.ru

ГОСТ Р 51600-2000 Молоко. Методы определения наличия антибиотиков (с Изменениями N 1, 2), ГОСТ Р от 26 апреля 2000 года №51600-2000

ГОСТ Р 51600-2000

Группа Н19

Методы определения наличия антибиотиков

Milk. Methods for determination of the antibiotics indication*

______________* Наименование стандарта. Измененная редакция, Изм. N 1.

ОКС 67.100.10ОКСТУ 9209

Дата введения 2001-07-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 года N 127-ст

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ПЕРЕИЗДАНИЕВНЕСЕНЫ: Изменение N 1, утвержденное и введенное в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 09.02.2006 N 6-ст с 01.07.2007, Изменение N 2, утвержденное и введенное в действие Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст с 01.07.2008Изменения N 1, 2 внесены изготовителем базы данных по тексту ИУС N 4 2006 год, ИУС N 4 2008 год

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на натуральное коровье молоко - сырье, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее - молоко) и устанавливает микробиологические и рецепторные методы определения наличия антибиотиков.(Измененная редакция, Изм. N 1, 2).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условияГОСТ 2493-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условияГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условияГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализаГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условияГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения содыГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиакаГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водородаГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размерыГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкойГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования(Измененная редакция, Изм. N 2).

3 Чашечный метод с Вас. stearothermophilus

3.1 Сущность метода

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.

3.2 Аппаратура, реактивы и материалы

3.2.1 Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2-3.2.16.

3.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

3.2.3 Центрифуга частотой вращения 3000 мин и разделяющим фактором 750 м/с.

3.2.4 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

3.2.5 Колба коническая по ГОСТ 25336, вместимостью 250 см.

3.2.6 Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.

3.2.7 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное N 4.

3.2.8 Пипетка градуированная по ГОСТ 29227, 2-го класса точности, вместимостью 25 см.

3.2.9 Гидролизат кормовых дрожжей.

3.2.10 Диски со стрептомицином.

3.2.11 Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.

3.2.12 Препарат СКИВ.

3.2.13 Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.

3.2.14 Тест-микроб Вас. stearothermophilus BKMB-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

3.2.15 Фуксин основной, спиртовой раствор концентрации 50 г/дм.

3.2.16 Экстракт дрожжевой.Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.

3.3 Отбор проб

3.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225.

3.3.2 Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 24 ч.

3.3.3 Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.

3.4 Подготовка к анализу

3.4.1 Подготовка посуды и материалов

3.4.1.1 Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1-2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160±5) °С в течение 2 ч или в автоклаве при (121±2) °С в течение (30±1) мин с последующим подсушиванием.Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

3.4.2 Приготовление питательных сред

3.4.2.1 Для получения спор Вас. stearothermophilus BKMB-510 используют питательную среду следующего состава: дрожжевой экстракт - 10,0 г, пептон - 20,0 г, глюкоза - 0,5 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.В мерную колбу вместимостью 1000 см помещают все компоненты питательной среды, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем раствора водой до метки и устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,1±0,1). Разливают раствор в колбы по 200,0 см и стерилизуют его при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

3.4.2.2 Для проведения анализа готовят агаровую среду следующего состава: гидролизат кормовых дрожжей - 1,0 г, пептон - 0,4 г, хлористый натрий - 0,1 г, агар - 1,6 г, дистиллированная вода - до 100,0 см.В колбу вместимостью 200 см вносят 100 см дистиллированной воды и все компоненты среды, перемешивают до полного растворения и нагревают до кипения. Затем охлаждают до температуры (55±5) °С, устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,3±0,1), и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

3.4.2.3 Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.

3.4.3 Получение спор тест-микроба

3.4.3.1 Среду по 3.4.2.1 засевают 2-3 см 18-20-часовой тест-культуры Вас. stearothermophilus BKMB-510, выращенной в пробирках с этой же средой, тщательно перемешивают и помещают в термостат температурой (55±1) °С на 3 сут.После окончания инкубации из посевов делают мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина 50 г/дм и микроскопируют.При наличии в поле зрения 90-95% свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16-18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67±2) °С в течение (30±1) мин. Пробирки центрифугируют 20-30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67±2) °С в течение (30-1)* мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.________________* Соответствует оригиналу. - Примечание "КОДЕКС".

3.4.4 Приготовление засеянной агаровой среды

3.4.4.1 В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.

3.4.4.2 К 100 см расплавленной и охлажденной до (60±2) °С среды по 3.4.2.2 добавляют 2,5 см водного раствора глюкозы массовой долей 40% и 4 см суспензии спор по 3.4.4.1. Смесь среды и спор тщательно перемешивают и разливают градуированной пипеткой по (11±1) см в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности стола.

3.4.4.3 Чашки засевают непосредственно перед употреблением.В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55±1) °С в течение (20±1) мин.

3.4.5 Приготовление обезжиренного стерильного молока

3.4.5.1 Обезжиренное стерильное молоко получают из цельного молока кислотностью 16-18 °Т, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. В пробирки разливают обезжиренное молоко по 10 см и стерилизуют при 105 Па (1 атм) в течение (10±1) мин.Допускается использовать препарат СКИВ.

3.4.6 Приготовление контрольного разведения стрептомицина активностью 2,5 мкг/см (Ед/г)

3.4.6.1 Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.

3.4.6.2 Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.Состав раствора 1: двузамещенный фосфорнокислый калий по ГОСТ 2493 - 2,0 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 8,0 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (6,1±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.Состав раствора 2: двузамещенный фосфорнокислый калий - 16,73 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,523 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (7,9±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.

3.4.6.3 Контрольное разведение готовят из основного раствора стрептомицина активностью 500 мкг/см, который получают растворением 5 мг стандарта антибиотика, взвешенного с отсчетом показания весов до 0,1 мг, в буферном растворе 1 по 3.4.6.2. Объем буферного раствора составляет 0,01 активности антибиотика.Пример: При активности стандарта стрептомицина 760 мкг/мг навеску антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см буферного раствора 1 и получают основной раствор активностью 500 мкг/см.Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5±1) °С.Из основного раствора в трех пробирках готовят серию разведений антибиотика. В первую пробирку наливают 1 см буферного раствора 2 по 3.4.6.2 и 1 см основного раствора, во вторую - 9 см буферного раствора 2 и 1 см раствора из первой пробирки, в третью - 9 см стерильного обезжиренного молока по 3.4.5 и 1 см раствора из второй пробирки. Активность антибиотика в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см. Разведение антибиотика в молоке активностью 2,5 мкг/см является контрольным.Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего

дня.

3.4.6.4 Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.

3.4.7 Подготовка проб молока к анализуКаждую пробу молока наливают по 5-10 см в чистую стерильную пробирку, прогревают в течение (10±1) мин на водяной бане при температуре внутри пробирки (87±2) °С и охлаждают в холодной воде до температуры 18-25 °С.

3.5 Проведение анализа

3.5.1 Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.

Рисунок 1 - Схема вырезания лунок в агаровой среде

Рисунок 1 - Схема вырезания лунок в агаровой среде

3.5.2 В центральную лунку вносят 0,05 см контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.3 или в центре чашки на поверхность засеянной агаровой среды помещают диск со стрептомицином по 3.2.10. В лунки, расположенные по окружности чашки, вносят по 0,05 см исследуемых проб молока по 3.4.7.

3.5.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20±1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55±1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

3.6 Обработка результатов

3.6.1 Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.

3.6.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.

3.6.3 При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии - 12 мм и более.

3.7 Метрологические характеристики

3.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.Таблица 1

4 Метод с индикатором бромкрезолпурпуром

4.1 Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски - при их наличии.

4.2 Аппаратура, материалы и реактивы

4.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 70 °С с допускаемыми отклонениями ±0,5 °С от заданной.(Измененная редакция, Изм. N 2).

4.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

4.2.3 Ампулы "DelvotestSP", герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см с агаровой средой, содержащей споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.

4.2.4 Среда питательная таблетированная "Delvotest SP", фасованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком.

4.2.3, 4.2.4 (Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2.5 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см, настроенный на объем пробы 0,1 см.

4.2.6 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см.

4.2.7 Пинцет.

4.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.2.9 Ампулы "Delvotest SP-NT" или "Delvotest SP MINI-NT", герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см с агаровой и питательной средой, содержащей споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.(Введен дополнительно, Изм. N 1).

4.2.10 Тестовый набор "Copan Test®" - комплект, включающий герметично укупоренные пробирки, собранные в блоки, и содержащие споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis, помещенные в агар с питательными веществами и индикатором бромкрезолпурпуром; пипетки мерные вместимостью 0,1 см одноразового использования и цветовую шкалу [3].

4.2.11 Пипетки вместимостью 0,1 см для отбора образцов молока для исследования по ГОСТ 29169.

4.2.10, 4.2.11 (Введены дополнительно, Изм. N 2).

4.3 Отбор проб

4.3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 9225.

4.3.2 Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.

4.4 Подготовка к анализу

4.4.1 Подготовка к анализу ампул по 4.2.3 и бутылочек по 4.2.4Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °С.(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.4.2 Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6±2) °С. (Измененная редакция, Изм. N 2).

4.4.3 Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.

4.4.4 Подготовка к анализу ампул или пробирок - по 4.2.9 или 4.2.10.Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6±2) °С.(Введен дополнительно, Изм. N 1. Измененная редакция, Изм. N 2).

4.5 Проведение анализа

4.5.1 Проведение анализа с использованием ампул "Delvotest® SP", "Delvotest® SP-NT" или "Delvotest® SP MINI-NT"

4.5.1.1 Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул по 4.2.3 или 4.2.9.

4.5.1.2 В каждую открытую ампулу по 4.2.3 пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest® SP", взятой из колпачка бутылочки по 4.4.3. Затем бутылочку плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20±2) °С.

4.5.1.3 Шприцем-дозатором отбирают 0,1 см анализируемого молока и вносят в каждую ампулу по 4.5.1.2 или 4.2.9. Для каждой пробы анализируемого молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.

4.5.1.4 Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0±0,5) °С в течение 3 ч.

4.5.2 Проведение анализа с использованием тестового набора "Сораn Test®"

4.5.2.1 Одноразовой мерной пипеткой отбирают 0,1 см анализируемого молока и вносят в пробирку с приоткрытой фольгой по 4.2.10. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.

4.5.2.2 Пробирки с анализируемым молоком закрывают фольгой и помещают в блок термостатируемых ячеек и выдерживают при температуре (64,5±0,5) °С в течение 3 ч.

4.5.2.3 Контрольное определение проводят в соответствии с 4.5.1, 4.5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

4.5, 4.5.1, 4.5.1.1-4.5.1.4, 4.5.2, 4.5.2.1-4.5.2.3 (Измененная редакция, Изм. N 2).

4.6 Обработка результатов

4.6.1 Ампулы или пробирки извлекают из термостата или блока термостатируемых ячеек и определяют цвет содержимого.(Измененная редакция, Изм. N 2).

4.6.2 Желтый цвет содержимого ампул или пробирок с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.

4.6.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул или пробирок с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.

4.6.2, 4.6.3 (Измененная редакция, Изм. N 2).

4.6.4 Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065-ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.

4.7 Метрологические характеристики

4.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.Таблица 2

(Измененная редакция, Изм. N 2).

5 Рецепторные методы

5.1 Рецепторный метод с 3,3,5,5-триметилбензидином и диметилсульфоксидом

5.1.1 Сущность методаМетод основан на иммуноферментной реакции, в процессе которой антибиотики бета-лактамного типа захватываются специфическими белковыми рецепторами, меченными ферментом, содержащим индикатор, с образованием химически прочного окрашенного комплекса при взаимодействии с молоком, содержащим антибиотики.Наличие или отсутствие пенициллина и антибиотиков бета-лактамного типа (ампициллина, цефапирина, амоксициллина, цефтиофура, клоксациллина, диклоксациллина, цефалониума, цефалексина, нафциллина, цефазолина, цефкуинома, цефацетрила, оксациллина, цефаперазона) устанавливают, сравнивая цвет зоны анализируемого молока с цветом контрольной зоны индикаторного устройства "Snap".5.1.2 Аппаратура, материалы и реактивы

5.1.2.1 Термостат, позволяющий поддерживать температуру (45±5) °С.

5.1.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.1.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.1.2.4 Тест-набор Бета-лактам "Snap", одноразовый комплект в герметичной упаковке, включающий пробирку "Snap" с 3,3,5,5-триметилбензидином, укупоренную; пипетку мерную вместимостью 0,4 см; индикаторное устройство "Snap" с диметилсульфоксидом по [1].Тест-набор Бета-лактам "Snap" хранят в холодильнике при температуре от 0 °С до 7 °С. Необходимое число комплектов для работы в течение суток допускается хранить при температуре (20±2) °С.5.1.3 Отбор проб

5.1.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.

5.1.4 Подготовка к анализу

5.1.4.1 Термостат нагревают до температуры (45±5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.1.4.2 Вскрывают упаковку тест-набора Бета-лактам "Snap", проверяют положение шарика реактива в пробирке по 5.1.2.4. Шарик реактива при заполнении пробирки молоком должен находиться на ее дне. При необходимости шарик реактива устанавливают встряхиванием пробирки на ее дно.

5.1.5 Проведение анализа

5.1.5.1 Мерную пипетку по 5.1.2.4 наполняют анализируемым молоком до метки.

5.1.5.2 Анализируемое молоко из пипетки выливают в пробирку. Пробирку закрывают и тщательно перемешивают круговыми движениями до растворения реактива. Пробирку и индикаторное устройство помещают в термостат и выдерживают при температуре (45±5) °С в течение 5-6 мин.

5.1.5.3 Вынимают подогретое индикаторное устройство из термостата и устанавливают на горизонтальной поверхности так, чтобы приемная воронка для заливки анализируемым молоком находилась слева от оператора.

5.1.5.4 Содержимое пробирки переливают в приемную воронку индикаторного устройства.

5.1.5.5 При появлении анализируемого молока в круглом окне клавиши индикаторного устройства клавишу нажимают до упора для изменения тока жидкости и промывки пористого материала раствором антибиотиков. Включение индикаторного устройства сопровождается характерным щелчком клавиши.

5.1.5.6 Индикаторное устройство повторно помещают в термостат, выдерживают при температуре (45±5) °С в течение 4 мин и извлекают из термостата. Стабильность окраски сохраняется в течение 15 мин после извлечения устройства из термостата.

5.1.6 Обработка результатов

5.1.6.1 Сравнивают цвет контрольной зоны в индикаторном окне с цветом зоны анализируемого молока.

5.1.6.2 Контрольная зона должна быть синего цвета. Если изменение цвета контрольной зоны после проведения процедур по 5.5.4-5.5.6 не произошло, то определение повторяют с новым тест-набором Бета-лактам "Snap".

5.1.6.3 Если цвет зоны анализируемого молока на индикаторном устройстве аналогичен или темнее цвета контрольной зоны - пенициллин или антибиотики бета-лактамного типа в анализируемом молоке отсутствуют.Белый или менее интенсивный цвет зоны анализируемого молока по сравнению с цветом контрольной зоны свидетельствует о наличии в анализируемом молоке пенициллина или антибиотиков бета-лактамного типа.

5.2 Рецепторный метод с коллоидным золотом

5.2.1 Сущность метода

5.2.1.1 Метод основан на проведении реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционную и контрольную зоны.5.2.2 Аппаратура, материалы и реактивы

5.2.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру (47,5±0,5) °С.

5.2.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.2.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.2.2.4 Тест-набор "Beta Star®" [4], включающий флаконы со специфическими рецепторами, меченными коллоидным золотом; полоски хроматографической бумаги с зоной исследуемого молока и контрольной зоной; шприц-дозатор вместимостью 0,2 см с наконечниками.

5.2.3 Отбор пробОтбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.

5.2.4 Подготовка к анализу

5.2.4.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек нагревают до температуры (47,5±0,5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.2.4.2 Флакон встряхивают для осаждения содержимого в нем на дно.

5.2.5 Проведение анализа

5.2.5.1 Шприцем-дозатором с наконечником отбирают 0,2 см анализируемого молока и переливают во флакон по 5.2.4.2. Флакон закрывают крышкой и встряхивают до полного растворения сухих веществ без образования пены.

5.2.5.2 Помещают флакон в термостат или блок термостатируемых ячеек по 5.2.2.1.

5.2.5.3 Не менее чем через 3 мин термостатирования во флакон, находящийся в термостате или в блоке термостатируемых ячеек, помещают входящую в комплект полоску хроматографической бумаги.

5.2.5.4 Хроматографирование проводят в течение 2 мин. Затем полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона.5.2.6 Обработка результатов

5.2.6.1 Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появляющихся после проведения процедуры по 5.2.5.4 в виде линий на полосках хроматографической бумаги.

5.2.6.2 Зона на верхней части полоски является контрольной. Если ее окрашивания не произошло после выполнения требований по 5.2.5.3, 5.2.5.4, то повторяют все процедуры в соответствии с 5.2.

5.2.6.3 Зона исследуемого молока расположена под контрольной зоной. Большая или равная интенсивность цвета контрольной зоны, а также отсутствие окраски зоны образца является признаком наличия антибиотиков бета-лактамного типа в молоке.

5.2.6.4 Меньшая интенсивность цвета контрольной зоны, по сравнению с интенсивностью цвета зоны под ней, является признаком отсутствия антибиотиков.

5.2.6.5 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.1 и 5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

5.3 Метрологические характеристикиНаименьшие пределы определения антибиотиков бета-лактамного типа представлены в таблице 3.Таблица 3

Раздел 5. (Измененная редакция, Изм. N 1, 2)

6 Требования безопасности

Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [2].Раздел 6. (Введен дополнительно, Изм. N 1).

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное). Библиография

ПРИЛОЖЕНИЕ А(справочное)

ПРИЛОЖЕНИЕ А. (Измененная редакция, Изм. N 1, 2).Текст документа сверен по:официальное изданиеМолоко и молочные продукты.Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2004 Редакция документа с учетомизменений и дополнений подготовлена АО "Кодекс"

docs.cntd.ru

ГОСТ Р 53912-2010 Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков, ГОСТ Р от 10 ноября 2010 года №53912-2010

ГОСТ Р 53912-2010

Группа Н09

ОКС 67.050ОКСТУ 9209

Дата введения 2012-01-01

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 ноября 2010 г. N 364-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕИнформация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети ИнтернетВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 5, 2012 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает ускоренный метод качественного определения (обнаружения) антибиотиков.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализаГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требованияГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоныГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасностиГОСТ 12.1.019-2009* Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты________________* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживаниеГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требованияГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условияГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условияГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условияГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовки их к анализуГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условияГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размерыГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализовГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытанийПримечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Настоящий экспресс-метод устанавливает качественное определение (обнаружение) антибиотиков в пищевых продуктах, основанное на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде.

4 Средства измерения, вспомогательное оборудование, посуда, материалы и реактивы

4.1 Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,01.

4.2 Баня водяная с обогревом, поддерживающим температуру до 100 °С.

4.3 Термометр стеклянный жидкостный (нертутный) по ГОСТ 28498, с диапазоном измерения до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С.

4.4 Мясорубка или гомогенизатор.

4.5 Ножницы.

4.6 Чашки Петри по ГОСТ 25336.

4.7 Пробирки по ГОСТ 25336.

4.8 Центрифуга со скоростью вращения не менее 3000 об/мин.

4.9 Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

4.10 Мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА).

4.11 Метиленовый синий, индикатор (0,5%-ный водный раствор).

4.12 Глюкоза 40%-ный раствор.

4.13 Тест-культуры

5 Проведение исследования

5.1 Отбор проб продукцииОтбор проб - по ГОСТ Р 53430, ГОСТ 13928, ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26809.

5.1.1 Подготовка проб к исследованию

5.1.1.1 Молоко и сливки жидкие (в сыром или пастеризованном виде)Сырое молоко исследуют непосредственно в день отбора проб. До начала анализа пробы молока и сливок хранят в холодильнике при температуре (4±1) °С. Затем отбирают пробу для анализа (не менее 10 см) и помещают ее в пробирку.

5.1.1.2 Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока)Непосредственно перед исследованием продукт подвергают восстановлению в кипяченой воде при температуре не более (45±1) °С. Пробу тщательно перемешивают, она не должна содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробу для анализа в объеме не менее 10 см и переносят ее в пробирку.

5.1.1.3 Яйца, меланжЯйца или меланж, предназначенные для исследования, предварительно нагревают на водяной бане при температуре (65±1) °С в течение 10-15 мин до коагуляции белка, затем содержимое яиц или меланж тщательно перемешивают и отбирают пробу для анализа массой не менее 10 г.

5.1.1.4 Мясо и субпродуктыМясо и субпродукты (печень, почки, язык и т.д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают ножницами или при помощи мясорубки или гомогенизатора, затем 10 г пробы мышечной ткани помещают в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевый сок в объеме не менее 10 см переносят в пробирку.

5.1.2 Термическая обработка проб пищевых продуктовПеред проведением исследования пробирку с пробой, отобранной по 5.1.1, помещают в водяную баню с температурой (60±1) °С. Время прогревания 30 мин отмечают от момента достижения постоянной температуры внутри пробирки.

5.1.3 Тест-культуры для определения антибиотиковТест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Bacillus subtilis, вар. 6633; Bacillus subtilis, вар. L2; Bacillus mycoides 537; Micrococcus luteum ATCC 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.Для пенициллина и стрептомицина используют следующие тест-культуры - Bacillus subtilis, вар. 6633; Basillus mycoides 537 и Micrococcus luteum ATCC 9341, для тетрациклина - Bacillus subtilis, вар. L2.Музейные штаммы вегетативных форм тест-культур хранят в пробирке со столбиком полужидкого 0,4%-го питательного агара.

5.1.3.1 Приготовление тест-культурВначале тест-культуру рассеивают на чашки Петри с 2%-ным мясо-пептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят на (20±3) ч в термостат при температуре (37±1) °С. После чего мелкие колонии отсевают в пробирки с 2%-ным мясо-пептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (20±3) ч.Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков.Срок хранения полученной взвеси в холодильнике при температуре (4±1) °С - 7 дн.

5.1.3.2 "Рабочая доза" тест-культур"Рабочая доза" тест-культуры - наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре (37±1) °С. При этом учитывают, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток тест-культуры в смыве. Время постановки реакции равно одному часу. Оно выявляет в суспензиях различной плотности одну и ту же клеточную нагрузку для каждой тест-культуры. "Рабочую дозу" тест-культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.

5.1.3.3 Приготовление "рабочей дозы" тест-культурыПолученную взвесь тест-культуры (5.1.3.1) титруют путем последовательных разведений в 1 см питательного бульона в соотношении 1:2. Пробирки с тест-культурой встряхивают и помещают на 3 ч в термостат при температуре (37±1) °С. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 см растопленного и охлажденного до температуры (45±1) °С 1%-ного питательного агара с метиленовым синим и глюкозой (оба ингредиента асептично вносят в растопленный 1%-ный питательный агар из расчета: на 100 см среды 0,4 см 0,5-ного* водного раствора метиленового синего и 1 см 40%-ного раствора глюкозы). Пробирки встряхивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение 1-2 ч, после чего учитывают результат (таблица 1)._________________* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных. Таблица 1 - Определение "рабочей дозы" тест-культур

Дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных условиях, и содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается. Разведение тест-культуры в последней пробирке с обесцвеченным метиленовым синим (+) принимают за "рабочую дозу". Функциональная активность дегидрогеназ тест-культур стабилизируется через сутки после получения смыва, который хранится в холодильнике в течение одной недели. Поэтому "рабочую дозу" первый раз определяют через сутки, а затем - через три дня.Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное через один час инкубации в термостате при температуре 37 °С, принимают за "рабочую дозу".В среднем, "рабочую дозу" тест-культур определяют:

6 Определение антибиотиков в анализируемой пробе

6.1 Подготовленные к исследованию анализируемые пробы по 5.1.1 в объеме 0,5 см вносят в пробирки с таким же (0,5 см) объемом мясо-пептонного бульона и тщательно перемешивают. Во все пробирки добавляют 0,5 см взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 ч (5.1.3.3).Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест-культуры с испытуемым субстратом.После этого в каждую пробирку вносят по 2 м растопленного и охлажденного до температуры (45±1) °С мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение 1-2 ч.

6.2 Учет результатов определения антибиотиков

6.2.1 При отсутствии в испытуемых пробах антибиотика дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур не нарушаются и восстанавливают (т.е. обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий.

6.2.2 В контрольной пробирке, где отсутствует анализируемая проба, также происходит обесцвечивание в течение 1-2 ч наблюдения в термостате при температуре (37±1) °С (контроль ферментативной активности бактериальных клеток тест-культуры).

6.2.3 При наличии антибиотика в анализируемой пробе дыхательные ферменты бактериальных клеток блокируются, метиленовый синий не восстанавливается, цвет остается синим.

7 Требования, обеспечивающие безопасность

_______________* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать: обеспечивающие. - Примечание изготовителя базы данных.При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021;- содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;- безопасность при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;- требования безопасности при работе в микробиологической лаборатории с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) по документу, утвержденному в установленном порядке;- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019.Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.Электронный текст документаподготовлен АО "Кодекс" и сверен по:официальное изданиеМ.: Стандартинформ, 2011

docs.cntd.ru

ГОСТ Р 51600-2000 Молоко. Методы определения наличия антибиотиков

ГОСТ Р 51600-2000

Группа Н19

Методы определения наличия антибиотиков

Milk. Methods for determination of the antibiotics indication*

______________* Наименование стандарта. Измененная редакция, Изм. N 1.

ОКС 67.100.10ОКСТУ 9209

Дата введения 2001-07-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 года N 127-ст

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ПЕРЕИЗДАНИЕВНЕСЕНЫ: Изменение N 1, утвержденное и введенное в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 09.02.2006 N 6-ст с 01.07.2007, Изменение N 2, утвержденное и введенное в действие Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст с 01.07.2008Изменения N 1, 2 внесены изготовителем базы данных по тексту ИУС N 4 2006 год, ИУС N 4 2008 год

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на натуральное коровье молоко - сырье, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее - молоко) и устанавливает микробиологические и рецепторные методы определения наличия антибиотиков.(Измененная редакция, Изм. N 1, 2).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условияГОСТ 2493-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условияГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условияГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализаГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условияГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения содыГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиакаГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водородаГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размерыГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкойГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования(Измененная редакция, Изм. N 2).

3 Чашечный метод с Вас. stearothermophilus

3.1 Сущность метода

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.

3.2 Аппаратура, реактивы и материалы

3.2.1 Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2-3.2.16.

3.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

3.2.3 Центрифуга частотой вращения 3000 мин и разделяющим фактором 750 м/с.

3.2.4 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

3.2.5 Колба коническая по ГОСТ 25336, вместимостью 250 см.

3.2.6 Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.

3.2.7 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное N 4.

3.2.8 Пипетка градуированная по ГОСТ 29227, 2-го класса точности, вместимостью 25 см.

3.2.9 Гидролизат кормовых дрожжей.

3.2.10 Диски со стрептомицином.

3.2.11 Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.

3.2.12 Препарат СКИВ.

3.2.13 Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.

3.2.14 Тест-микроб Вас. stearothermophilus BKMB-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

3.2.15 Фуксин основной, спиртовой раствор концентрации 50 г/дм.

3.2.16 Экстракт дрожжевой.Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.

3.3 Отбор проб

3.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225.

3.3.2 Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 24 ч.

3.3.3 Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.

3.4 Подготовка к анализу

3.4.1 Подготовка посуды и материалов

3.4.1.1 Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1-2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160±5) °С в течение 2 ч или в автоклаве при (121±2) °С в течение (30±1) мин с последующим подсушиванием.Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

3.4.2 Приготовление питательных сред

3.4.2.1 Для получения спор Вас. stearothermophilus BKMB-510 используют питательную среду следующего состава: дрожжевой экстракт - 10,0 г, пептон - 20,0 г, глюкоза - 0,5 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.В мерную колбу вместимостью 1000 см помещают все компоненты питательной среды, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем раствора водой до метки и устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,1±0,1). Разливают раствор в колбы по 200,0 см и стерилизуют его при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

3.4.2.2 Для проведения анализа готовят агаровую среду следующего состава: гидролизат кормовых дрожжей - 1,0 г, пептон - 0,4 г, хлористый натрий - 0,1 г, агар - 1,6 г, дистиллированная вода - до 100,0 см.В колбу вместимостью 200 см вносят 100 см дистиллированной воды и все компоненты среды, перемешивают до полного растворения и нагревают до кипения. Затем охлаждают до температуры (55±5) °С, устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,3±0,1), и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

3.4.2.3 Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.

3.4.3 Получение спор тест-микроба

3.4.3.1 Среду по 3.4.2.1 засевают 2-3 см 18-20-часовой тест-культуры Вас. stearothermophilus BKMB-510, выращенной в пробирках с этой же средой, тщательно перемешивают и помещают в термостат температурой (55±1) °С на 3 сут.После окончания инкубации из посевов делают мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина 50 г/дм и микроскопируют.При наличии в поле зрения 90-95% свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16-18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67±2) °С в течение (30±1) мин. Пробирки центрифугируют 20-30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67±2) °С в течение (30-1)* мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.________________* Соответствует оригиналу. - Примечание "КОДЕКС".

3.4.4 Приготовление засеянной агаровой среды

3.4.4.1 В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.

3.4.4.2 К 100 см расплавленной и охлажденной до (60±2) °С среды по 3.4.2.2 добавляют 2,5 см водного раствора глюкозы массовой долей 40% и 4 см суспензии спор по 3.4.4.1. Смесь среды и спор тщательно перемешивают и разливают градуированной пипеткой по (11±1) см в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности стола.

3.4.4.3 Чашки засевают непосредственно перед употреблением.В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55±1) °С в течение (20±1) мин.

3.4.5 Приготовление обезжиренного стерильного молока

3.4.5.1 Обезжиренное стерильное молоко получают из цельного молока кислотностью 16-18 °Т, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. В пробирки разливают обезжиренное молоко по 10 см и стерилизуют при 105 Па (1 атм) в течение (10±1) мин.Допускается использовать препарат СКИВ.

3.4.6 Приготовление контрольного разведения стрептомицина активностью 2,5 мкг/см (Ед/г)

3.4.6.1 Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.

3.4.6.2 Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.Состав раствора 1: двузамещенный фосфорнокислый калий по ГОСТ 2493 - 2,0 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 8,0 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (6,1±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.Состав раствора 2: двузамещенный фосфорнокислый калий - 16,73 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,523 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (7,9±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.

3.4.6.3 Контрольное разведение готовят из основного раствора стрептомицина активностью 500 мкг/см, который получают растворением 5 мг стандарта антибиотика, взвешенного с отсчетом показания весов до 0,1 мг, в буферном растворе 1 по 3.4.6.2. Объем буферного раствора составляет 0,01 активности антибиотика.Пример: При активности стандарта стрептомицина 760 мкг/мг навеску антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см буферного раствора 1 и получают основной раствор активностью 500 мкг/см.Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5±1) °С.Из основного раствора в трех пробирках готовят серию разведений антибиотика. В первую пробирку наливают 1 см буферного раствора 2 по 3.4.6.2 и 1 см основного раствора, во вторую - 9 см буферного раствора 2 и 1 см раствора из первой пробирки, в третью - 9 см стерильного обезжиренного молока по 3.4.5 и 1 см раствора из второй пробирки. Активность антибиотика в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см. Разведение антибиотика в молоке активностью 2,5 мкг/см является контрольным.Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего

дня.

3.4.6.4 Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.

3.4.7 Подготовка проб молока к анализуКаждую пробу молока наливают по 5-10 см в чистую стерильную пробирку, прогревают в течение (10±1) мин на водяной бане при температуре внутри пробирки (87±2) °С и охлаждают в холодной воде до температуры 18-25 °С.

3.5 Проведение анализа

3.5.1 Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.

Рисунок 1 - Схема вырезания лунок в агаровой среде

Рисунок 1 - Схема вырезания лунок в агаровой среде

3.5.2 В центральную лунку вносят 0,05 см контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.3 или в центре чашки на поверхность засеянной агаровой среды помещают диск со стрептомицином по 3.2.10. В лунки, расположенные по окружности чашки, вносят по 0,05 см исследуемых проб молока по 3.4.7.

3.5.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20±1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55±1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

3.6 Обработка результатов

3.6.1 Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.

3.6.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.

3.6.3 При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии - 12 мм и более.

3.7 Метрологические характеристики

3.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.Таблица 1

4 Метод с индикатором бромкрезолпурпуром

4.1 Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски - при их наличии.

4.2 Аппаратура, материалы и реактивы

4.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 70 °С с допускаемыми отклонениями ±0,5 °С от заданной.(Измененная редакция, Изм. N 2).

4.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

4.2.3 Ампулы "DelvotestSP", герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см с агаровой средой, содержащей споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.

4.2.4 Среда питательная таблетированная "Delvotest SP", фасованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком.

4.2.3, 4.2.4 (Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2.5 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см, настроенный на объем пробы 0,1 см.

4.2.6 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см.

4.2.7 Пинцет.

4.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.2.9 Ампулы "Delvotest SP-NT" или "Delvotest SP MINI-NT", герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см с агаровой и питательной средой, содержащей споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.(Введен дополнительно, Изм. N 1).

4.2.10 Тестовый набор "Copan Test®" - комплект, включающий герметично укупоренные пробирки, собранные в блоки, и содержащие споры Вас. stearothermophilus var. calidolactis, помещенные в агар с питательными веществами и индикатором бромкрезолпурпуром; пипетки мерные вместимостью 0,1 см одноразового использования и цветовую шкалу [3].

4.2.11 Пипетки вместимостью 0,1 см для отбора образцов молока для исследования по ГОСТ 29169.

4.2.10, 4.2.11 (Введены дополнительно, Изм. N 2).

4.3 Отбор проб

4.3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 9225.

4.3.2 Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.

4.4 Подготовка к анализу

4.4.1 Подготовка к анализу ампул по 4.2.3 и бутылочек по 4.2.4Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °С.(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.4.2 Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6±2) °С. (Измененная редакция, Изм. N 2).

4.4.3 Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.

4.4.4 Подготовка к анализу ампул или пробирок - по 4.2.9 или 4.2.10.Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6±2) °С.(Введен дополнительно, Изм. N 1. Измененная редакция, Изм. N 2).

4.5 Проведение анализа

4.5.1 Проведение анализа с использованием ампул "Delvotest® SP", "Delvotest® SP-NT" или "Delvotest® SP MINI-NT"

4.5.1.1 Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул по 4.2.3 или 4.2.9.

4.5.1.2 В каждую открытую ампулу по 4.2.3 пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest® SP", взятой из колпачка бутылочки по 4.4.3. Затем бутылочку плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20±2) °С.

4.5.1.3 Шприцем-дозатором отбирают 0,1 см анализируемого молока и вносят в каждую ампулу по 4.5.1.2 или 4.2.9. Для каждой пробы анализируемого молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.

4.5.1.4 Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0±0,5) °С в течение 3 ч.

4.5.2 Проведение анализа с использованием тестового набора "Сораn Test®"

4.5.2.1 Одноразовой мерной пипеткой отбирают 0,1 см анализируемого молока и вносят в пробирку с приоткрытой фольгой по 4.2.10. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.

4.5.2.2 Пробирки с анализируемым молоком закрывают фольгой и помещают в блок термостатируемых ячеек и выдерживают при температуре (64,5±0,5) °С в течение 3 ч.

4.5.2.3 Контрольное определение проводят в соответствии с 4.5.1, 4.5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

4.5, 4.5.1, 4.5.1.1-4.5.1.4, 4.5.2, 4.5.2.1-4.5.2.3 (Измененная редакция, Изм. N 2).

4.6 Обработка результатов

4.6.1 Ампулы или пробирки извлекают из термостата или блока термостатируемых ячеек и определяют цвет содержимого.(Измененная редакция, Изм. N 2).

4.6.2 Желтый цвет содержимого ампул или пробирок с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.

4.6.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул или пробирок с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.

4.6.2, 4.6.3 (Измененная редакция, Изм. N 2).

4.6.4 Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065-ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.

4.7 Метрологические характеристики

4.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.Таблица 2

(Измененная редакция, Изм. N 2).

5 Рецепторные методы

5.1 Рецепторный метод с 3,3,5,5-триметилбензидином и диметилсульфоксидом

5.1.1 Сущность методаМетод основан на иммуноферментной реакции, в процессе которой антибиотики бета-лактамного типа захватываются специфическими белковыми рецепторами, меченными ферментом, содержащим индикатор, с образованием химически прочного окрашенного комплекса при взаимодействии с молоком, содержащим антибиотики.Наличие или отсутствие пенициллина и антибиотиков бета-лактамного типа (ампициллина, цефапирина, амоксициллина, цефтиофура, клоксациллина, диклоксациллина, цефалониума, цефалексина, нафциллина, цефазолина, цефкуинома, цефацетрила, оксациллина, цефаперазона) устанавливают, сравнивая цвет зоны анализируемого молока с цветом контрольной зоны индикаторного устройства "Snap".5.1.2 Аппаратура, материалы и реактивы

5.1.2.1 Термостат, позволяющий поддерживать температуру (45±5) °С.

5.1.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.1.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.1.2.4 Тест-набор Бета-лактам "Snap", одноразовый комплект в герметичной упаковке, включающий пробирку "Snap" с 3,3,5,5-триметилбензидином, укупоренную; пипетку мерную вместимостью 0,4 см; индикаторное устройство "Snap" с диметилсульфоксидом по [1].Тест-набор Бета-лактам "Snap" хранят в холодильнике при температуре от 0 °С до 7 °С. Необходимое число комплектов для работы в течение суток допускается хранить при температуре (20±2) °С.5.1.3 Отбор проб

5.1.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.

5.1.4 Подготовка к анализу

5.1.4.1 Термостат нагревают до температуры (45±5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.1.4.2 Вскрывают упаковку тест-набора Бета-лактам "Snap", проверяют положение шарика реактива в пробирке по 5.1.2.4. Шарик реактива при заполнении пробирки молоком должен находиться на ее дне. При необходимости шарик реактива устанавливают встряхиванием пробирки на ее дно.

5.1.5 Проведение анализа

5.1.5.1 Мерную пипетку по 5.1.2.4 наполняют анализируемым молоком до метки.

5.1.5.2 Анализируемое молоко из пипетки выливают в пробирку. Пробирку закрывают и тщательно перемешивают круговыми движениями до растворения реактива. Пробирку и индикаторное устройство помещают в термостат и выдерживают при температуре (45±5) °С в течение 5-6 мин.

5.1.5.3 Вынимают подогретое индикаторное устройство из термостата и устанавливают на горизонтальной поверхности так, чтобы приемная воронка для заливки анализируемым молоком находилась слева от оператора.

5.1.5.4 Содержимое пробирки переливают в приемную воронку индикаторного устройства.

5.1.5.5 При появлении анализируемого молока в круглом окне клавиши индикаторного устройства клавишу нажимают до упора для изменения тока жидкости и промывки пористого материала раствором антибиотиков. Включение индикаторного устройства сопровождается характерным щелчком клавиши.

5.1.5.6 Индикаторное устройство повторно помещают в термостат, выдерживают при температуре (45±5) °С в течение 4 мин и извлекают из термостата. Стабильность окраски сохраняется в течение 15 мин после извлечения устройства из термостата.

5.1.6 Обработка результатов

5.1.6.1 Сравнивают цвет контрольной зоны в индикаторном окне с цветом зоны анализируемого молока.

5.1.6.2 Контрольная зона должна быть синего цвета. Если изменение цвета контрольной зоны после проведения процедур по 5.5.4-5.5.6 не произошло, то определение повторяют с новым тест-набором Бета-лактам "Snap".

5.1.6.3 Если цвет зоны анализируемого молока на индикаторном устройстве аналогичен или темнее цвета контрольной зоны - пенициллин или антибиотики бета-лактамного типа в анализируемом молоке отсутствуют.Белый или менее интенсивный цвет зоны анализируемого молока по сравнению с цветом контрольной зоны свидетельствует о наличии в анализируемом молоке пенициллина или антибиотиков бета-лактамного типа.

5.2 Рецепторный метод с коллоидным золотом

5.2.1 Сущность метода

5.2.1.1 Метод основан на проведении реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционную и контрольную зоны.5.2.2 Аппаратура, материалы и реактивы

5.2.2.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру (47,5±0,5) °С.

5.2.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.2.2.3 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.2.2.4 Тест-набор "Beta Star®" [4], включающий флаконы со специфическими рецепторами, меченными коллоидным золотом; полоски хроматографической бумаги с зоной исследуемого молока и контрольной зоной; шприц-дозатор вместимостью 0,2 см с наконечниками.

5.2.3 Отбор пробОтбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.

5.2.4 Подготовка к анализу

5.2.4.1 Термостат или блок термостатируемых ячеек нагревают до температуры (47,5±0,5) °С и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.2.4.2 Флакон встряхивают для осаждения содержимого в нем на дно.

5.2.5 Проведение анализа

5.2.5.1 Шприцем-дозатором с наконечником отбирают 0,2 см анализируемого молока и переливают во флакон по 5.2.4.2. Флакон закрывают крышкой и встряхивают до полного растворения сухих веществ без образования пены.

5.2.5.2 Помещают флакон в термостат или блок термостатируемых ячеек по 5.2.2.1.

5.2.5.3 Не менее чем через 3 мин термостатирования во флакон, находящийся в термостате или в блоке термостатируемых ячеек, помещают входящую в комплект полоску хроматографической бумаги.

5.2.5.4 Хроматографирование проводят в течение 2 мин. Затем полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона.5.2.6 Обработка результатов

5.2.6.1 Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появляющихся после проведения процедуры по 5.2.5.4 в виде линий на полосках хроматографической бумаги.

5.2.6.2 Зона на верхней части полоски является контрольной. Если ее окрашивания не произошло после выполнения требований по 5.2.5.3, 5.2.5.4, то повторяют все процедуры в соответствии с 5.2.

5.2.6.3 Зона исследуемого молока расположена под контрольной зоной. Большая или равная интенсивность цвета контрольной зоны, а также отсутствие окраски зоны образца является признаком наличия антибиотиков бета-лактамного типа в молоке.

5.2.6.4 Меньшая интенсивность цвета контрольной зоны, по сравнению с интенсивностью цвета зоны под ней, является признаком отсутствия антибиотиков.

5.2.6.5 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.1 и 5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

5.3 Метрологические характеристикиНаименьшие пределы определения антибиотиков бета-лактамного типа представлены в таблице 3.Таблица 3

Раздел 5. (Измененная редакция, Изм. N 1, 2)

6 Требования безопасности

Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [2].Раздел 6. (Введен дополнительно, Изм. N 1).

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное). Библиография

ПРИЛОЖЕНИЕ А(справочное)

ПРИЛОЖЕНИЕ А. (Измененная редакция, Изм. N 1, 2).Текст документа сверен по:официальное изданиеМолоко и молочные продукты.Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2004 Редакция документа с учетомизменений и дополнений подготовлена АО "Кодекс"

docs.cntd.ru

Смотрите также

• 
  Кандида антибиотики
• 
  Антибиотики смекта
• 
  Клебсиелла антибиотик
• 
  Антибиотик клебсиелла
• 
  Антибиотик проба
• 
  Антибиотики убивают
• 
  Влияние антибиотиков
• 
  Антибиотики клещ
• 
  Антибиотики месячные
• 
  Антибиотик эминем
• 
  Миллионник антибиотик