 |
|
|
|||||||||
|
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Определение чувствительности бактерий к антибиотикамКак определяют чувствительность бактерий к антибиотикамВ медицине различают этиотропный и эмпирический подход к лечению препаратами. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам играет в этом разделении решающую роль.
Эмпирическое лечение подразумевает выяснение естественной бактериальной чувствительности и эпидемиологических сведений об устойчивости микроорганизмов. Учитываются также данные клинических исследований, которые контролируются специалистами. Преимуществом эмпирического подхода в назначении больному антибиотиков является то, что исключаются затраты времени, финансовых расходов на дополнительные, диагностически неинформативные исследования. При полном отсутствии эффекта от такого лечения антибиотиками, назначают этиотропное. Назначение больному антибактериальных препаратов этиотропно подразумевает выделение возбудителя заболевания из биологического материала больного, определение чувствительности инфекционного агента к антибиотикам различных групп. Методики установления восприимчивостиМетоды определения чувствительности бактерий к антибиотикам разделяют на две группы. К диффузионным относятся методы:
Методики разведения для определения чувствительности выполняются:
Согласно полученным данным, все бактерии разделяют на 3 типа:
Пограничные концентрации зафиксированы в стандартизированных данных NCCLS (США). Данные нормы применяются в клинических либо микробиологических научных исследованиях чувствительности. Наиболее часто применяют методы дисков и серийных разведений.
Чувствительность бактерий к антибиотикам предполагает анализ результатов на основании двух принципов: клинический и морфологический. Клинически определяется эффективность ведения лечения, а морфологически оценивается распределение действующих антибиотиков. Для клинической расшифровки результата исследования оцениваются в случае использования стандартизированных доз антибактериальных препаратов для заболеваний. Лечение дает хороший положительный эффект. Устойчивые же к антибиотикам бактерии отличаются тем, что в процессе лечения не теряют своей жизнедеятельности и способности к размножению. Такие микробы именуются как резистентные. Существует также группа с промежуточной резистентностью бактериальной клетки. Вызываемые такими бактериями заболевания могут успешно лечиться только при использовании максимальных дозировок антибактериального препарата. Показатель чувствительности по МБКИногда проведенных результатов оказывается недостаточно. В таких случаях стоит определить минимальную бактерицидную концентрацию (МБК). Данный показатель отражает минимальное количество антибактериального препарата для ликвидации микробов практически на 100% на протяжении некоторого времени. Методика с применением дисковИсследование чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам методом дисков заключается в засевании исследуемой культуры бактерий на среду АГВ либо питательный агар. Затем на засеянный участок при помощи пинцета располагают специальные диски из бумаги, содержащие разные дозы лекарственных средств. При температурном режиме 37°С выжидают сутки, одновременно оценивая зоны задержки роста культуры. Для наиболее точных результатов рекомендуется применять стандартные питательные среды и диски. Методика дисков не отличается 100% достоверностью. Большей информативностью обладает метод серийных разведений. Серийные разведения и их значение
Метод серийных разведений позволяет определить минимально возможную концентрацию антибактериального препарата, которая угнетает рост и размножение микробов. Начинают с приготовления основного раствора с содержанием специального растворителя и медикаментозного средства. Затем к каждому разведению прибавляют по 0,1 мл культуры бактерий (до 107 микробов в 1 мл), одна из них (последняя) – контрольная. Затем также выжидают сутки при температуре 37°С. Все пробирки мутнеют (кроме контрольной). В результате сравнения степени помутнения с эталоном определяют, какая бактерия подлежит устранению. Оценивают результаты метода серийных разведений соответственно таблицам пограничных значений. При применении метода серийных разведений определяют группы чувствительных, умеренно устойчивых и устойчивых бактериальных микроорганизмов. probakterii.ru Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикамНекоторые возбудители инфекционных заболеваний со временем открытия антибиотиков мало изменили характер первоначальной чувствительности к этим препаратам (стрептококки группы А, пневмококки, менингококки, бруцеллы, некоторые сальмонеллы). Вместе с тем, большинство патогенных микробов со временем приобрело устойчивость к широко, подчас неконтролируемо и необоснованно применяемым противомикробным средствам. Наибольшее значение проблема устойчивости микроорганизмов имеет в отношении стафилококков, шигелл, эшерихий, протея, среди которых антибиотикоустойчивые штаммы выделяются с наибольшей частотой. По степени чувствительности к основным антибиотикам микробы подразделяются на чувствительные, умеренно чувствительные и устойчивые. В группу чувствительных входит большинство штаммов микроорганизмов, рост которых на питательных средах прекращается при использовании концентраций, соответствующих средним терапевтическим дозам антибиотиков. Если он угнетается при применении только максимальных доз препаратов, то такие микроорганизмы умеренно чувствительны к антибиотику. Если подавление роста достигается в опыте в лаборатории лишь при очень высоких концентрациях препарата, которые нельзя создать в организме, то такие возбудители инфекции относятся к устойчивым к антибиотику. Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ускоренные методы. Метод дисков прост, широко используется, но дает лишь качественный ответ. Более надежным и точным количественным методом является метод последовательных разведений антибиотиков в питательной среде в стандартных условиях опыта. В большинстве случаев корреляция данных лабораторных исследований с клиническими бывает достаточно полной, а терапия - эффективной при изучении в динамике не только клинического течения процесса, но и возможной смены возбудителя или его чувствительности к антибиотикам. Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антимикробная активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. При ее изучении наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности антибиотика задерживать рост тест-микроба. Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют: • Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). • Метод дисков — качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату. • Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов. Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри. Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией. На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам. Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106—107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика. Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов. К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз. Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл. Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска). biofile.ru Методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикамЭмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий к антибиотикам, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре. Несомненным преимуществом эмпирической антимикробной терапии является незамедлительное начало ее проведения. Однако из-за формирования резистентности у микроорганизмов этиотропная антибиотикотерапия может быть неэффективной. Поэтому важно проводить этиотропное назначение антибиотиков, основанное на выделении возбудителя инфекции из клинического материала и определении его чувствительности к антибиотикам (табл. 16). Определение антибиотикорезистентности проводят согласно утвержденным документам – стандартам или приказам, которые регламентируют процедуру определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. В РБ существует приказ Министерства здравоохранения по определению антибиотикорезистентности, в Америке и Европе – стандарты Комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS). Таблица 16 Классификация методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Основные понятия(МИК) минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация - наименьшая концентрация антибиотика, которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (в бульонных или на агаровых питательных средах) в стандартных условиях постановки опыта и выражается в мкг/мл (мг/л) или ед/мл. Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) наименьшая концентрация антибиотика, которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определённого периода времени. Чувствительный микроорганизм штамм микроорганизма, который не имеет механизмов резистентности к данному препарату. Его его на питательной среде прекращается при использовании антибиотика в терапевтической дозе. Умеренно-резистентный микроорганизм штамм микроорганизма, рост которого на питательной среде прекращается только при использовании антибиотика в высшей дозе. Лечение инфекций, вызываемых умеренно-резистентными микроорганизмами, проводится при отсутствии альтернативных препаратов, высшей (максимальной терапевтической) дозой антибиотика. Резистентный микроорганизм штамм микроорганизма, который имеет механизмы резистентности к данному препарату. Его рост на питательной среде прекращается лишь при использовании очень высоких концентраций препарата, которые нельзя создать в организме из-за их высокой токсичности. При лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, клинический эффект от терапии отсутствует даже при использовании высшей дозы антибиотика. При этом могут наблюдаться побочные действия антибиотика. Показания к определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам:
а) выделения микроорганизмов из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека; б) при выделении микроорганизмов из первично нестерильных биотопов, оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма; в) инфекций, резистентных к препаратам эмпирической терапии; г) уникальных инфекций и отсутствии опыта их терапии; д) инфекций, требующих пролонгированной терапии (каждую неделю терапии проводят детекцию антибиотикорезистености, так как возможна смена возбудителей). Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам нецелесообразно:
Выбор антибиотиков, подлежащих тестированию. В исследования включают антибиотики, обладающие природной активностью в отношении выделенных микроорганизмов с клинически подтвержденной эффективностью при соответствующих инфекциях. В перечень антибиотиков могут быть включены 12 дополнительных препарата по запросу лечащего врача, либо при появлении новых более эффективных средств. Этапы тестирования чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
studfiles.net 32.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:• Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качественныйи позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяетinvitroпредотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °Сдо следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106—107бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штаммS. aureus, а при определении стрептомицина — Е.coli. После инкубирования посевов при 37 °Св течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °Спитательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска). studfiles.net |
 г.Самара, ул. Димитрова 131 [email protected] |
 |