standartgost.ru

%PDF-1.4 % 1 0 obj > >> endobj 4 0 obj /CreationDate (D:20160212144136+03'00') /Creator (Adobe Acrobat 11.0) /Keywords /ModDate (D:20170201113612+03'00') /Producer (Adobe Acrobat 11.0.11) /Subject /Title >> endobj 239 0 obj > endobj 240 0 obj > >> >> endobj 241 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 242 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 243 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 244 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 245 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 246 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 247 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 248 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 249 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 250 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 251 0 obj > >> >> endobj 252 0 obj > /FirstChar 1 /FontDescriptor 253 0 R /LastChar 111 /ToUnicode 254 0 R /Widths [ 278 833 667 904 567 778 722 622 712 0 722 667 0 611 722 722 979 719 719 719 626 730 278 702 854 610 333 333 278 722 611 667 722 667 722 722 778 722 611 611 722 611 833 778 667 703 740 556 604 611 875 556 611 490 854 635 604 635 615 583 556 581 618 500 615 556 556 556 556 333 556 778 497 615 615 556 556 1000 278 278 556 556 611 611 889 611 389 611 611 556 333 556 278 556 500 556 611 333 611 556 556 615 400 556 333 417 1115 556 854 556 709 ] >> endobj 253 0 obj > endobj 254 0 obj > stream x]n@E "* !yh|

files.stroyinf.ru

Способ иммунохроматографического определения антибиотиков в молоке и молочных продуктах

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу иммуноанализа антибиотиков в молочных продуктах. Используют мультимембранный композит, в определенные зоны которого нанесены: 1) частицы окрашенного маркера в комплексе с антителами 1, специфичными к антибиотику; 2) конъюгат антибиотика с молекулой-носителем, обеспечивающей иммобилизацию конъюгата на мембране; 3) иммобилизованные на мембране антитела 2, специфичные к антителам 1 (контрольная зона). При контакте мультимембранного композита с тестируемой пробой молока или молочного продукта в определенной зоне или зонах мультимембранного композита образуются окрашенные полосы или полоса, которые интерпретируют как: а) при окрашивании только контрольной зоны - наличие в пробе определяемого антибиотика; б) при окрашивании аналитической и контрольной зон - отсутствие в пробе определяемого антибиотика. Особенностью предлагаемого подхода является использование специально подобранного сочетания антител 1 с высокой скоростью взаимодействия с антигеном, при кинетической константе реакции ассоциации не менее 105 М-1 сек-1, мембранных носителей с размером пор не менее 10 мкм и частиц окрашенного маркера со средним диаметром не менее 30 нм. Изобретение позволяет проводить экспресс-анализ определения антибиотиков в молочных продуктах во внелабораторных условиях. 4 ил.

Изобретение относится к аналитической биохимии и биохимии пищевых продуктов и может применяться для целей управления технологическими процессами и контроля готовой продукции.

В настоящее время антибиотики широко используются не только для борьбы с инфекционными заболеваниями человека, но и как средство профилактики и лечения заболеваний животных. В связи с этим существенным фактором риска становится поступление антибиотиков в организм человека с продуктами питания, которое может вызывать ряд нежелательных эффектов: дисбактериозы, развитие устойчивых форм микроорганизмов, аллергические реакции, подавление активности некоторых ферментов и т.д. (Bennish M.L. Animals, humans, and antibiotics: implications of the veterinary use of antibiotics on human health. Adv. Pediatr. Infect. Dis. 1999; 14: 269-290; Pedersen K.B., Aarestrup F.M., Jensen N.E., Bager F., Jensen L.B., Jorsal S.E., Nielsen Т.К., Hansen H.C., Meyling A, Wegener H.C. The need for a veterinary antibiotic policy. Vet. Rec. 1999; 145 (2): 50-53; Schwarz S., Kehrenberg C., Walsh T.R. Use of antimicrobial agents in veterinary medicine and food animal production. Int. J. Antimicrob. Agents. 2001; 17 (6): 431-437; Hardy B. The issue of antibiotic use in the livestock industry: what have we learned? Anim. Biotechnol. 2002; 13 (1): 129-147; Ibrahim C. Management options with the regard to authorization of antibiotics in veterinary medicine. Int. J. Med. Microbiol. 2006; 296 (Suppl. 41): 51-54).

Для контроля содержания антибиотиков в продуктах питания предложены и используются различные аналитические методы как микробиологические, так и химические.

Микробиологическое тестирование основано на подавлении антибиотиками, содержащимися в пробе, роста тест-культуры микроорганизма или синтеза данным микроорганизмом специфического фермента. Поскольку используемые в практике антибиотики характеризуются широким спектром действия, для тестирования могут использоваться представители различных систематических групп микроорганизмов. Так, в патенте РФ №2000112381 (Леви М.И., Сучков Ю.Г. Способ экспрессного определения антибиотиков биологическим методом) предлагается применение высокочувствительных к антибиотикам штаммов термофильных бактерий с температурным оптимумом роста (50-60)°C. Авторы патента РФ №2063030 (Гудков А.В., Гудкова М.Я., Карликанова С.Н., Немирова B.C., Скобелев В.И. Способ определения ингибирующих веществ в молоке) рекомендуют использование специально подобранного штамма Streptococcus tnermophilus B-19. Применение тест-культуры Е. coli описано в патенте РФ №2002112511 (Лазаренко В.Н., Ветровая P.P., Сунагатуллин Ф.А., Царева О.М., Юсупова P.M., Галимов Д.М. Способ определения бактерицидной активности молока). Для детекции влияния антибиотиков на жизнедеятельность тестовых микроорганизмов, как правило, характеризуют изменения их метаболической активности, что существенно менее трудоемко, чем контроль количества микроорганизмов. Окислительная активность ферментов тестовых микроорганизмов в среде, содержащей пробу молока, сопровождается сдвигом pH. В качестве pH-индикатора используют растворы лакмуса или бромкрезолового пурпурного. Из восстановительных методов применяют пробы с метиленовой синью или с трифенил-тетразолхлоридом, а также диффузионный метод с использованием агара, который содержит окислительно-восстановительный индикатор и тестовые микроорганизмы (Кильвайн Г. Руководство по молочному делу и гигиене молока. М.: Россельхозиздат, 1980).

Хотя микробиологические методы предоставляют адекватную информацию о содержании в пробе физиологически активных молекул антибиотиков, их реализация требует довольно длительного времени - как правило, несколько часов.

Альтернативой микробиологическим методам являются химико-аналитические методы определения антибиотиков. Для детекции антибиотиков разработаны разнообразные методики, основанные на принципах капиллярного электрофореза, газовой и жидкостной хроматографии (Shaikh В., Moats W.A. Liquid chromatographic analysis of antibacterial drug residues in food products of animal origin. J. Chromatogr. 1993; 643 (1-2): 369-378; Schenck F.J., Callery P.S. Chromatographic methods of analysis of antibiotics in milk. J. Chromatogr. A. 1998; 812 (1-2): 99-109; Flurer C.L. Analysis of antibiotics by capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2003; 24 (22-23): 4116-4127; Stolker A.A., Brinkman U.A. Analytical strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in food-producing animals - a review. J. Chromatogr. A. 2005; 1067 (1-2): 15-53; Castro-Puyana M., Crego A.L, Marina M.L. Recent advances in the analysis of antibiotics by CE and CEC. Electrophoresis. 2008; 29 (1): 274-293; Samanidou V., Nisyriou S. Multi-residue methods for confirmatory determination of antibiotics in milk. J Sep Sci 2008; 31 (11): 2068-2090). Однако, несмотря на высокую чувствительность (до 1 нг/мл и ниже), эти методы имеют существенные ограничения как средства массового скрининга. Для их реализации необходимо сложное дорогостоящее оборудование и квалифицированный персонал. К тому же хроматографический анализ предполагает проведение специальной пробоподготовки - экстракции детектируемого соединения, его концентрирования и других предварительных манипуляций.

Применение же простых качественных реакций на антибиотики с фотометрической детекцией результатов (Patetta C.F., Fischer L. Spectrophotometric assay for quantitative determination of 7-aminocephalosporanic acid from direct hydrolysis of cephalosporin C. Anal. Biochem. 2006,350 (2): 304-306; Darwish I.A., Refaat I.H., Askal H.F., Marzouq M.A. Generic nonextractive spectrophotometric method for determination of 4-quino-naphthollone antibiotics by formation of ion-pair complexes with β-naphthol. J. AOAC Intern. 2006, 89 (2): 334-340; Kanakapura В., Rangachar A.K.U. Sensitive spectrophotometric methods for quantitative determination of gatifloxacin in pharmaceutical formulations using bromate-bromide, thiocyanate and tiron as reagents. J. Мех. Chem. Soc. 2007, 51 (2): 106-112; Okoye N.N., Nwokedi G.I.C., Ukwueze N.N., Okoye F.B.C. Spectrophotometric determination of some cephalosporin antibiotics using Prussian blue reaction. Sci. Res. & Essay. 2007, 2 (8): 342-347), как правило, не обеспечивает достаточной чувствительности анализа. Ведь в соответствии с установленными пороговыми уровнями их допустимого содержания антибиотиков в пищевой продукции может требоваться их выявление в концентрациях до 10 нг/мл, что в среднем на 1-2 порядка ниже, чем пределы детекции фотометрических методов.

С учетом рассмотренных выше ограничений микробиологических и химических методов определения антибиотиков существует необходимость создания альтернативных аналитических методов, которые являются экспрессными, могут быть реализованы с минимальной трудоемкостью и превосходят по чувствительности традиционную спектрофотометрию. Перечисленные требования могут быть выполнены при использовании в качестве реагента, взаимодействующего с молекулами антибиотиков, специфических антител. Разработан ряд методов иммунохимической детекции антибиотиков. Большую часть из них составляют микропланшетные твердофазные иммуноферментные аналитические системы, в которых образующиеся иммунные комплексы выявляются на основании измерения каталитической активности фермента, соединенного с одним из взаимодействующих иммунореагентов (Martlbauer Е., Usleber Е., Schneider Е., Dietrich R. Immunochemical detection of antibiotics and sulfonamides. Analyst. 1994; 119 (12): 2543-2548; Kolosova A.Y., Samsonova J.V., Egorov A.M. Competitive ELISA of chloramphenicol: influence of immunoreagent structure and application of the method for the inspection of food of animal origin. Food Agric. Immunol. 2000. 12: 115-125; Loomans E.E., Van Wiltenburg J., Koets M., Van Amerongen A. Neamin as an immunogen for the development of a generic ELISA detecting gentamicin, kanamycin, and neomycin in milk. J. Agric. Food Chem. 2003.29; 51 (3): 587-593; Kumar K., Thompson A., Singh A.K., Chander Y., Gupta S.C. Enzyme-linked immunosorbent assay for ultratrace determination of antibiotics in aqueous samples. J. Environ. Qual. 2004; 33 (1): 250-256; Pattarawarapan M., Nangola S., Ayapiwatana С.Establishment of competitive ELISA for detection of chloramphenicol. Chiang Mai J. Sci. 2006. 33 (1): 85-94; Fitzgerald S.P., O'Loan N., Mcconnell R.I., Benchikh el O., Kane N.E. Stable competitive enzyme-linked immunosorbent assay kit for rapid measurement of 11 active beta-lactams in milk, tissue, urine, and serum. J. AOAC Intern. 2007; 90 (1): 334-342). Однако иммуноферментный анализ в силу диффузионных ограничений характеризуется продолжительностью от одного до нескольких часов и, кроме того, предполагает использование специального оборудования для решения двух задач: отделения прореагировавших молекул от непрореагировавших и фотометрической регистрации активности связавшейся с носителем ферментной метки.

Требованиям экспрессности и низкой трудоемкости в полной мере удовлетворяет иммунохроматографический вариант иммунохимического анализа. В иммунохроматографических аналитических системах на мультимембранный композит (тест-полоску) нанесены реагенты, необходимые для выявления определяемого соединения, и контакт тест-полоски с анализируемой жидкой пробой непосредственно инициирует протекание специфических взаимодействий в ходе движения жидкости по мембранам композита и формирования в определенных его зонах окрашенных полос, свидетельствующих о наличии или отсутствии в пробе определяемого соединения. Системы иммунохроматографического анализа разработаны для ряда соединений разных классов, в том числе и для антибиотиков (Muir D.D. Report of a survey of antibiotic test methods for raw milk, commissioned by the Dairy Industry Federation. 1999. Hannah Research Institute: Ayr; Legg D.R., Baumgartner A., Salter R., Wheeler A. ROSA (Rapid One Step Assay) for antibiotics in honey. Apiacta. 2003. 38: 207-217). Однако при анализе молока и молочных продуктов методом иммунохроматографии возникает необходимость в исключении блокирующего действия компонентов пробы на взаимодействие с иммобилизованными иммунореагентами, а также в предотвращении препятствия вязкости проб движению жидкости по мультимембранному композиту. В качестве принципиального решения, исключающего негативное влияние этих факторов, используется инкубация тест-полоски при повышенной температуре. Данный подход реализован, в частности, в тест-системах Charm Rosa® (Charm Science Inc.). Ниже представлено изложение предлагаемого разработчиками этих тест-систем способа проведения анализа бета-лактамных антибиотиков в молоке (согласно руководству пользователя «Charm SL. Beta-lactam test for amoxicillin, ampicillin, ceftiofur, cephapirin and penicillin G. Operator's manual for raw, commingled bovine or goat milk» (http://www.idfa.org/reg/ncims/M-I-03-3-ATTACHMENT-FrNAL.pdf)), рассматриваемого в настоящей заявке в качестве прототипного:

Подготовка

Инкубатор ROSA для тест-полосок должен находиться в закрытом состоянии все время, когда он не используется для проведения анализа. Зеленый индикатор инкубатора ROSA должен показывать, что температура внутри инкубатора равняется 56±1°C. Рекомендуется проводить ежедневную проверку, используя для этого термометр. Инкубатор должен находиться в чистом состоянии.

Перед тестированием пробу молока необходимо хорошо перемешать. При тестировании замороженного или восстановленного порошкового молока его необходимо центрифугировать в течение 3 мин при 1200±200 g и отбирать надосадок для проведения анализа Множественные образцы могут инкубироваться одновременно в 2- или 4-местном инкубаторе.

Процедура

1. Пометьте тест-полоску для идентификации анализируемого образца. Вскройте упаковку и поместите тест-полоску для анализа бета-лактамов SL Beta-lactam Test в инкубатор ROSA так, чтобы ее плоская сторона оказалась сверху. Тест-полоска должна занимать предназначенное для нее углубление в инкубаторе.

Удерживая тест-полоску в инкубаторе в том же положении, отогните белую наклейку, закрывающую подложку для нанесения образца. Избегайте изгиба белой наклейки и ее попадания под тест-полоску.

2. Тщательно перемешайте пробу молока.

Медленно, чтобы избежать разлива, нанесите пипеткой 300±15 мкл молока или отцентрифугированного образца на подложку для нанесения образца. Наклейте белую наклейку на подложку для нанесения образца, надавив на нее. При тестировании нескольких образцов необходимо проделать полный цикл по отклеиванию, нанесению образца и заклеиванию, прежде чем переходить к следующей тест-полоске.

Закройте крышку инкубатора и зажмите ее с помощью защелки <…>

3. Инкубируйте в течение как минимум 8 мин, но не более чем 10 мин. После 8 мин индикатор инкубатора начнет мигать желтым светом и издавать звуковой сигнал в течение 2 мин. Уберите тест-полоску из инкубатора, прежде чем закончится звуковой сигнал, и закройте крышку.

Визуальная оценка результатов

Осторожно положите тест-полоску, избегая ее сминания. Если на полоске находятся посторонние компоненты (молоко, высохшее молоко, пыль и т.д.), аккуратно удалите их. Визуально оцените результаты анализа, сравнив тестовую и контрольную линии <…> Если контрольная линия отсутствует, смазана или неравномерна, то результаты тестирования следует считать недействительными, а анализ повторить.

Отметим, что из-за использования дополнительного оборудования - специального термостата для тест-полосок - проведение анализа непосредственно на месте отбора проб становится невозможным. К тому же необходимость приобретения термостата повышает стоимость анализа и тем самым препятствует широкому применению тест-систем для скринингового контроля.

Использование в прототипном способе анализа инкубирования тест-полоски при повышенной температуре (56±1°C) является принципиальным элементом методики, исключение которой при работе с той же тест-системой не позволит получать достоверные результаты тестирования проб. Отказ от инкубирования и проведение анализа при комнатной температуре увеличивают как вязкость пробы, так и степень неспецифического блокирования ее компонентами сайтов связывания окрашенного маркера на мембране. В связи с этим для перехода к анализу, проводимому при комнатной температуре, необходимо конструктивное решение, обеспечивающее высокую степень связывания маркера при детекции разных антибиотиков в молоке и молочных продуктах.

В настоящей заявке предлагается для этих целей использовать сочетание антител с высокой скоростью взаимодействия с антибиотиком-антигеном (кинетическая константа реакции ассоциации не менее 105 М-1сек-1), мембранных носителей с большим размером пор (не менее 10 мкм) и частиц окрашенного маркера с большими размерами (средний диаметр не менее 30 нм). Для такой комплектации мультимембранного композита одновременно обеспечиваются значительная степень протекания реакции специфических к антибиотику антител со свободными и иммобилизованными молекулами антибиотика-антигена и относительно небольшая степень блокирования компонентами тестируемой пробы взаимодействия между окрашенным маркером и иммобилизованными реагентами, что позволяет получать достоверные данные о содержании антибиотиков в пробах молока или молочных продуктов, проводя анализ при комнатной температуре. Благодаря этому анализ проводится без использования какого бы то ни было дополнительного оборудования, во внелабораторных условиях. Конкретные препараты антител и размерные характеристики мембран и маркера подбираются отдельно в каждом случае так, чтобы при их использовании пороговая концентрация антибиотика-антигена в пробе, при которой исчезает окрашивание аналитической полосы тест-полоски (зоны связывания конъюгата окрашенного маркера с антителами и иммобилизованного конъюгата антибиотик-носитель), соответствовала контролируемой предельно допустимой концентрации данного антибиотика в пищевой продукции.

Для иммунохроматографических систем известно, что эффективность связывания окрашенного маркера с носителем зависит от режима проведения взаимодействия между иммобилизованным и движущимся с потоком жидкости реагентом и степени достижения данной иммунохимической реакцией равновесия. Однако обычно (см., например, Rapid Lateral Flow Test Strips. Considerations for Product Development. Millipore. 2008) для увеличения степени связывания применяют замедление движения жидкости, что в данном случае неприемлемо, т.к. замедление приводит к росту неспецифической блокировки компонентами пробы сайтов связывания на мембране. Поэтому в предлагаемой системе используются крупнопористые мембраны, характеризующиеся высокой скоростью движения жидкости, а эффективность связывания обеспечивают антитела с высокой кинетической константой взаимодействия с антигеном. Тем самым выбор препарата антител против антибиотика, используемого в анализе, должен включать его характеристику по равновесной константе связывания, определяющей величину порогового уровня детекции (концентрации, при которой в аналитической зоне мультимембранного композита происходит исчезновение/появление окрашивания), и по кинетической константе, определяющей яркость полосы в аналитической зоне. При этом использование крупнопористых мембран предотвращает неспецифическую блокировку сайтов связывания, а использование крупных коллоидных частиц компенсирует меньшую объемную плотность сайтов связывания у крупнопористых мембран по сравнению с мелкопористыми.

Отказ от инкубации тест-полосок при повышенной температуре обеспечивает возможность проведения анализа проб молока и молочных продуктов без какого бы то ни было дополнительного оборудования во внелабораторных условиях. Тем самым становится возможным более широкий скрининг как сырья в молокоперерабатывающей промышленности, так и готовой продукции. Оперативное получение информации о содержании антибиотиков позволяет своевременно принимать решения о порядке использования сырья и готовой продукции, тем самым повышая производительность технологических процессов и расширяя возможности защиты здоровья населения.

Возможность реализации и эффективность предлагаемого подхода подтверждают представленные ниже примеры иммунохроматографического анализа различных антибиотиков. Выбранные концентрации антибиотиков - 10 нг/мл для хлорамфеникола, 500 нг/мл для стрептомицина и 10 нг/мл для ампициллина (представителя бета-лактамных антибиотиков) - соответствуют установленным максимальным допустимым уровням их содержания в молоке и молочных продуктах.

Пример 1. Иммунохроматографический анализ хлорамфеникола (левомицетина) в молоке

Формирование мультимембранного композита

Иммунохроматографическую систему собирают из набора мембран, включающего рабочую мембрану с размером пор 10 мкм, подложку под конъюгат, мембрану для нанесения образца, адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку. Конъюгаты коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и моноклональных антител к хлорамфениколу наносят на подложку под конъюгат в объеме 32 мкл на 1 см полосы в разведении, соответствующем A520=2,0. Для формирования аналитической зоны на рабочей мембране используют конъюгат хлорамфеникол-соевый ингибитор трипсина, контрольной зоны - антивидовые овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши. На 1 см полосы наносят 2 мкл конъюгата (0,5 мкг/мл) и 2 мкл антивидовых антител (0,5 мг/мл).

Проведение анализа.

В пластиковый флакон вносят 2 мл анализируемой пробы (молоко без разбавления). Тест-полоску погружают строго вертикально в анализируемую пробу до дна флакона на 2,5-3 мин.

Извлекают тест-полоску из флакона, кладут ее на горизонтальную поверхность и через 8-10 мин визуально оценивают результат анализа. При необходимости связывание коллоида в контрольной и аналитической зонах регистрируют количественно с помощью рефлектометрического компьютерного видеоцифрового анализатора «Рефлеком» (ООО «Окта-Медика», Россия).

Результаты тестирования проб молока с разным содержанием хлорамфеникола представлены на фиг.1. Появление двух параллельных линий розового цвета (фиг.1,a) свидетельствует о том, что в пробе не содержится хлорамфеникол или его концентрация ниже 10 нг/мл. Появление одной линии розового цвета (фиг.1,б) свидетельствует о том, что концентрация хлорамфеникола в пробе равна или выше 10 нг/мл.

Пример 2. Иммунохроматографический анализ хлорамфеникола (левомицетина) в кефире

Формирование мультимембранного композита

Иммунохроматографическую систему собирают из набора мембран, включающего рабочую мембрану с размером пор 10 мкм, подложку под конъюгат, мембрану для нанесения образца, адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку. Конъюгаты коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и моноклональных антител к хлорамфениколу наносят на подложку под конъюгат в объеме 32 мкл на 1 см полосы в разведении, соответствующем A520=2,0. Для формирования аналитической зоны на рабочей мембране используют конъюгат хлорамфеникол-соевый ингибитор трипсина, контрольной зоны - антивидовые овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши. На 1 см полосы наносят 2 мкл конъюгата (0,5 мкг/мл) и 2 мкл антивидовых антител (0,5 мг/мл).

Проведение анализа

В пластиковый флакон вносят 2 мл анализируемой пробы (смешивая 1,5 мл кефира и 0,5 мл воды). Тест-полоску погружают строго вертикально в анализируемую пробу до дна флакона на 2,5-3 мин.

Извлекают тест-полоску из флакона, кладут ее на горизонтальную поверхность и через 8-10 мин визуально оценивают результат анализа. При необходимости связывание коллоида в контрольной и аналитической зонах регистрируют количественно с помощью рефлектометрического компьютерного видеоцифрового анализатора «Рефлеком» (ООО «Окта-Медика», Россия).

Результаты тестирования проб кефира с разным содержанием хлорамфеникола представлены на фиг.2. Появление двух параллельных линий розового цвета (фиг.2,a) свидетельствует о том, что в пробе не содержится хлорамфеникол или его концентрация ниже 10 нг/мл. Появление одной линии розового цвета (фиг.2,б) свидетельствует о том, что концентрация хлорамфеникола в пробе равна или выше 10 нг/мл.

Пример 3. Иммунохроматографический анализ стрептомицина в молоке

Формирование мультимембранного композита

Иммунохроматографическую систему собирают из набора мембран, включающего рабочую мембрану с размером пор 10 мкм, подложку под конъюгат, мембрану для нанесения образца, адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку. Конъюгаты коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и моноклональных антител к стрептомицину наносят на подложку под конъюгат в объеме 32 мкл на 1 см полосы в разведении, соответствующем A520=2,0. Для формирования аналитической зоны на рабочей мембране используют конъюгат стрептомицин-яичный альбумин, контрольной зоны - антивидовые овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши. На 1 см полосы наносят 2 мкл конъюгата (0,5 мкг/мл) и 2 мкл антивидовых антител (0,5 мг/мл).

Проведение анализа.

В пластиковый флакон вносят 2 мл анализируемой пробы (молоко без разбавления). Тест-полоску погружают строго вертикально в анализируемую пробу до дна флакона на 2,5-3 мин.

Извлекают тест-полоску из флакона, кладут ее на горизонтальную поверхность и через 8-10 мин визуально оценивают результат анализа. При необходимости связывание коллоида в контрольной и аналитической зонах регистрируют количественно с помощью рефлектометрического компьютерного видеоцифрового анализатора «Рефлеком» (ООО «Окта-Медика», Россия).

Результаты тестирования проб молока с разным содержанием стрептомицина представлены на фиг.3. Появление двух параллельных линий розового цвета (фиг.3,a) свидетельствует о том, что в пробе не содержится стрептомицин или его концентрация ниже 500 нг/мл. Появление одной линии розового цвета (фиг.3,б) свидетельствует о том, что концентрация стрептомицина в пробе равна или выше 500 нг/мл.

Пример 4. Иммунохроматографический анализ ампициллина в молоке

Формирование мультимембранного композита

Иммунохроматографическую систему собирают из набора мембран, включающего рабочую мембрану с размером пор 10 мкм, подложку под конъюгат, мембрану для нанесения образца, адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку. Конъюгаты коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и моноклональных антител к бета-лактамным антибиотикам наносят на подложку под конъюгат в объеме 32 мкл на 1 см полосы в разведении, соответствующем A520=2,0. Для формирования аналитической зоны на рабочей мембране используют конъюгат пенициллин-бычий сывороточный альбумин, контрольной зоны - антивидовые овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши. На 1 см полосы наносят 1 мкл конъюгата (0,4 мкг/мл) и 2 мкл антивидовых антител (0,4 мг/мл).

Проведение анализа

В пластиковый флакон вносят 2 мл анализируемой пробы (молоко без разбавления). Тест-полоску погружают строго вертикально в анализируемую пробу до дна флакона на 2,5-3 мин.

Извлекают тест-полоску из флакона, кладут ее на горизонтальную поверхность и через 8-10 мин визуально оценивают результат анализа. При необходимости связывание коллоида в контрольной и аналитической зонах регистрируют количественно с помощью рефлектометрического компьютерного видеоцифрового анализатора «Рефлеком» (ООО «Окта-Медика», Россия).

Результаты тестирования проб молока с разным содержанием ампициллина представлены на фиг.4. Появление двух параллельных линий розового цвета (фиг.4,a) свидетельствует о том, что в пробе не содержится ампициллин или его концентрация ниже 10 нг/мл. Появление одной линии розового цвета (фиг.4,б) свидетельствует о том, что концентрация ампициллина в пробе равна или выше 10 нг/мл.

Способ иммунохроматографического определения антибиотика в молоке и молочных продуктах, включающий использование мультимембранного композита, в определенные зоны которого нанесены: 1) частицы окрашенного маркера в комплексе с антителами 1, специфичными к антибиотику, 2) конъюгат антибиотика с молекулой-носителем, обеспечивающей иммобилизацию конъюгата на мембране, 3) иммобилизованные на мембране антитела 2, специфичные к антителам 1 (контрольная зона), предусматривающий контакт мультимембранного композита с тестируемой пробой молока или молочного продукта и визуальную регистрацию образования в определенной зоне или зонах мультимембранного композита окрашенной полосы или полос, которую интерпретируют: а) при окрашивании только контрольной зоны - как свидетельство наличия в пробе определяемого антибиотика в концентрации, равной или превосходящей установленную пороговую концентрацию, б) при окрашивании аналитической и контрольной зон - как свидетельство отсутствия в пробе определяемого антибиотика или его наличия в пробе более низкой концентрации по сравнению с установленной пороговой концентрацией, отличающийся тем, что подбирают сочетания антител 1 с высокой скоростью взаимодействия с антигеном, при кинетической константе реакции ассоциации не менее 105 M-1 с-1, мембранных носителей с размером пор не менее 10 мкм и частиц окрашенного маркера со средним диаметром не менее 30 нм.

www.findpatent.ru

ГОСТ Р 51600-2010 «Молоко и молочные продукты. Микробиологические методы определения наличия антибиотиков»

Ваша корзина В корзине 0 товаров Заказать Очистить Каталог товаров Масла REDLINE Масла MOTUL AVS продукция

ГлавнаяАнтибиотикиОпределение антибиотиков в молочных продуктах 1 Область применения. Определение антибиотиков в молочных продуктах Молоко и молочные продукты. Иммуноферментные методы определения наличия антибиотиков

Наименование Наименьший предел определения антибиотиков с использованиемтест-наооров. мг/кг № 1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 Амоксициллин 0,0035 0,004 0,003 0,003 0,002 - 0,002 0,002 Ампициллин 0,0035 0,004 0,003 0,003 0,002 - 0,003 0,003 Бензициллин 0,003 - 0,003 - - - 0,003 - Гетациллин 0,01 - 0,005 - - - 0,005 - Дигидрострептомицин - - - - - - 0,05 - Диклоксациллин 0,02 0,03 0,006 0,011 0,002 - 0,006 0,003 Доксициклин - - 0,0025 - 0,002 - 0,002 0,002 Клоксациллин 0,022 0,03 0,006 0,018 0,002 - 0,006 0,003 Левомицетин (хло-рамфеникол) 0,0003 0,0003 0,0003 Нафциллин 0,052 - 0,03 0,046 0,0075 - 0,03 0,01 Оксациллин 0,024 0,03 0,012 0,032 0,003 - 0,012 0,003 Окситетрациклин - - 0,0075 0,01 0,01 - 0,007 0,01 Пенициллин G 0,002 0,004 0,003 0,001 0,002 - 0,003 0,003 Пенициллин'/ 0,003 - 0,003 - - - 0,003 - Пипер ациллин 0,006 - 0,005 - - - 0,005 - Прокаин-пенициллин 0,002 - 0,003 - - - 0,003 - Стрептомицин - - - - - 0,2 0,15 0,2 Тетрациклин - - 0,01 0,01 0,01 - 0,01 0,01 Тикарциллин 0,04 - - - - - - - Хлортетрациклин - - 0,006 0,026 0,006 - 0,005 0,006 Цефадроксил 0,03 - 0,005 - - - 0,005 - Цефазолин 0,013 0,05 0,018 - 0,015 - 0,018 0,02 Цефалексин 0,025 0,1 0,75 0,01 0,4 - 1,0 - Цефалоний 0,04 - 0,003 - - - 0,003 - Цефалониум 0,04 0,02 0,003 0,04 0,003 - 0,003 0,003 Цефапирин 0,011 - 0,006 0,008 0,004 - 0,006 0,004 Цефацетрил 0,05 - 0,03 0,009 - - 0,03 - Цефкином 0,02 0,02 0,02 0,01 0,006 - 0,03 0,006 Цефоксазол 0,05 - - - - - - - Цефоперазон 0,01 0,05 0,003 0,004 0,003 - 0,003 0,004 Цефотаксим 0,01 - - - - - - - Цефрадин 0,03 - - - - - - - Цефтиофур 0,011 0,1 0,01 0,002 0,05 - 0,01 0,015 Цефуроксим 0,01 - - - - - - -

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Микробиологические методы определения наличия антибиотиков

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности Россельхозакадемии (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии) и Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 февраля 2010 г. № 25-ст

4 ВЗАМЕН ГОСТ Р 51600-2000

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Содержание

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Дата введения - 2011-01-01

Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое коровье молоко (далее - молоко) и устанавливает качественные микробиологические методы определения наличия антибиотиков:

- чашечный метод с Bacillus stearothermophilus,

- метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур,

- метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2493-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9285-78 Калия гидрат окиси технический. Технические условия

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля рН молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия

ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ

ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды

ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака

ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ± 0,0002 г.

3.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317, поддерживающий температуру от 0 °С до 12 °С.

3.3 Центрифуга с частотой вращения 3000 мин-1 и разделяющим фактором 750 м/с2.

3.4 Пробирки центрифужные термостойкие вместимостью 25 см3 по ГОСТ 1770.

3.5 Термостат или блок термостатированных ячеек, поддерживающий температуру от 30 °С до 70 °С с допустимой погрешностью ± 0,5 °С.

3.6 Баня водяная с терморегулятором, поддерживающая температуру от 60 °С до 90 °С.

3.7 Анализатор потенциометрический по ГОСТ 19881 2-го класса точности с диапазоном измерения от 5,5 до 8,0 единиц рН.

3.8 Сепаратор-сливкоотделитель.

3.9 Шкаф сушильный, поддерживающий температуру (160 ± 5) °С.

3.10 Автоклав, поддерживающий температуру (121 ± 2) °С.

3.11 Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, поддерживающий температуру (121 ± 2) °С.

3.12 Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

3.13 Микроскоп световой биологический.

3.14 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное № 4.

3.15 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

3.16 Линейка по ГОСТ 427 с пределом измерения 150 мм.

3.17 Аппарат «Микрофот 5ПО-1» или другой проекционный аппарат.

3.18 Колбы конические по ГОСТ 25336, вместимостью 25, 100, 250 см3.

3.19 Колбы мерные по ГОСТ 1770, вместимостью 200 и 1000 см3.

3.20 Пробирки по ГОСТ 1770, вместимостью 10 см3.

3.21 Чашка Петри по ГОСТ 25336.

3.22 Пипетки градуированные 2-го класса точности по ГОСТ 29227, вместимостью 5,10 и 25 см3.

3.23 Пипетки, отмеряющие объем 0,05 и 0,1 см3.

3.24 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 0,1 см3 или шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см3, настроенный на объем пробы 0,1 см3.

3.25 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см3.

3.26 Пинцет.

3.27 Гидролизат кормовых дрожжей.

3.28 Эталон стандартный мутности по [1].

3.29 Препарат сухой для контроля определения ингибирующих веществ в молоке (СКИВ) по [2].

3.30 Образец стандартный стрептомицина по [3].

3.31 Фуксин основной по [4], спиртовой раствор концентрации 0,05 г/см3.

3.32 Экстракт дрожжевой по [5].

3.33 Глюкоза по ГОСТ 975.

3.34 Пептон сухой ферментированный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

3.35 Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

3.36 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

3.37 Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.

3.38 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.

3.39 Калия гидрат окиси по ГОСТ 9285, раствор с массовой концентрацией 0,056 г/см3.

3.40 Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой концентрацией 0,0365 г/см3.

3.41 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

3.42 Тест-культура № 1 (тест-культура Bacillus stearothermophilus BKMB-510)1)- тест-культура Bacillus stearothermophilus.

3.43 Среда № 1 (среда агаровая питательная таблетированная «Delvotest® SP»)2)- питательком, капсулой силикагеля и поролоновым уплотнителем.

3.44 Среда № 2 (агаровая среда «Delvotest® SP»)3)- агаровая среда, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см3, собранные в блоки.

3.45 Среда № 3 (среда «Delvotest® SP-NT» или «Delvotest® SP MINI-NT»)4) - смесь агаровой и питательной сред, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бром-крезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см3, собранные в блоки.

3.46 Тест-набор № 1 (тест-набор «BRT Inhibitor Test»)5), включающий: герметично укупоренные пробирки или пластины с агаровой и питательной средой, содержащей споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.

Применение конкретных видов оборудования, средств измерений, материалов и реактивов осуществляется в соответствии с требованиями разделов 4 и 5.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

1) Тест-культура Bacillus stearothermophilus BKMB-510, выпускаемая Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

2) Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована питательная среда «Delvotest® SP» (OOO «ДСМ Восточная Европа»).

3) Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована агаровая среда «Delvotesl® SP» (OOO «ДСМ Восточная Европа»).

4) Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендованы среды «Delvotest® SP-NT» и «Delvotest® SP MINI-NT» (OOO «ДСМ Восточная Европа»)

5) Тест-набор является рекомендуемым к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанного тест-набора. Допускаются к использованию тест-наборы производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендован тест-набор «BRT Inhibitor Test» (OOO «Xp. Хансен»).

Отбор проб и подготовка проб - по ГОСТ Р 53430 с дополнением. Допускается хранить подготовленные пробы молока в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 24 ч.

5.1 Чашечный метод с Bacillus stearothermophilus

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами Bacillus stearothermophilus и препятствовать их росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в молоке устанавливают по размеру диаметра зоны ингибиции.

5.1.1 Подготовка к определению

5.1.1.1 Подготовка лабораторной посуды - по ГОСТ Р 51446.

5.1.1.2 Приготовление сред

Питательная среда: в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды по ГОСТ 6709 растворяют 10,0 г дрожжевого экстракта по 3.32, 20,0 г пептона по ГОСТ 13805, 0,5 г глюкозы по ГОСТ 975, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и потенциометрическим анализатором по 3.7 устанавливают активность питательной среды (7,1 ± 0,1) единиц рН. Затем в необходимое количество конических колб по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см3 наливают по 200 см3 приготовленной питательной среды и стерилизуют в стерилизаторе по 3.11 при температуре (121 ± 2) °С в течение (15 ± 1) мин.

Срок хранения питательной среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - 1 мес.

Агаровая среда: в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 200 см3 вносят 100 см3 дистиллированной воды, 1,0 ггидролизата кормовых дрожжей, 0,4 г пептона, 0,1 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 и 1,6 г микробиологического агара по ГОСТ 17206, перемешивают до полного растворения и нагревают на электроплитке до кипения. Затем агаровую среду охлаждают до температуры (55 ± 5) °С, устанавливают активность агаровой среды (7,3 ± 0,1) единиц рН и стерилизуют при температуре (121 ± 2) °С в течение (15 ± 1) мин.

Срок хранения агаровой среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - 1 мес.

Допускается применять среды промышленного изготовления, аналогичные указанным выше.

5.1.1.3 Получение спор тест-культуры

Питательную среду, подготовленную по 5.1.1.2, засеивают 2 - 3 см3 тест-культуры № 1 по 3.42, выращенной в пробирках с этой же средой в течение 18 - 20 ч, тщательно перемешивают, помещают в термостат и нагревают при температуре (55 ± 1) °С в течение 3 сут.

После окончания инкубации из посевов берут мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина по 3.31 с массовой концентрацией 50 г/дм3 и микроскопируют. При наличии в колбах с посевами 90 % - 95 % свободных сформировавшихся спор колбы помещают в холодильник на 16 - 18 ч для осаждения спор. Образовавшуюся надосадочную жидкость из колб сливают, а оставшийся осадок распределяют по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают на водяной бане при температуре (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. После этого пробирки помещают на центрифугу по 3.3 и центрифугируют 20 - 30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывают дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.

Взвесь спор повторно нагревают при температуре (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин и переносят в пробирки.

Срок хранения спор тест-культур в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - не более 2 мес.

5.1.1.4 Приготовление засеянной агаровой среды

В пробирки отбирают взвесь спор тест-культуры, подготовленной по 5.1.1.3, и разводят дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по стандартному эталону мутности по [1].

К 100 см3 расплавленной и охлажденной до (60 ± 2)°С агаровой среды, подготовленной по 5.1.1.2, добавляют 2,5 см3 40 %-ного водного раствора глюкозы и 4 см3 суспензии спор, подготовленной как указано выше. Смесь агаровой среды и суспензии спор тщательно перемешивают и градуированной пипеткой разливают по (11 ± 1) см3 в подготовленные для определения чашки Петри по ГОСТ 25336, установленные на горизонтальной поверхности.

Чашки Петри с засеянной смесью агаровой среды и суспензии спор допускается хранить в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 2 сут. Перед проведением определения чашки Петри прогревают в термостате при температуре (55 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

5.1.1.5 Подготовка проб и приготовление обезжиренного стерильного молока

а) Подготовка проб

Определению на наличие антибиотиков подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066, ГОСТ 24067. В стерильные пробирки пипеткой по ГОСТ 29227 отбирают по 5 - 10 см3 анализируемой пробы молока, нагревают на водяной бане при температуре (87 ± 2) °С в течение (10 ± 1) мин и охлаждают в холодной воде до температуры 18 °С - 25 °С.

б) Приготовление обезжиренного стерильного молока

Обезжиренное стерильное молоко получают из молока, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454, с кислотностью 16 - 18 °Т при помощи сепаратора-сливкоотделителя. Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см3 и стерилизуют при 101 кПа (1 атм.) в течение (10 ± 1) мин.

5.1.1.6 Приготовление контрольного раствора стрептомицина

Контрольный раствор стрептомицина используют для проверки активности роста спор тест-культуры.

а) Приготовление фосфатных буферных растворов 1 и 2

Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 2493 и 8,0 г однозамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 4198 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (6,1 ± 0,1)с помощью растворов гидрата окиси калия по 3.39 или соляной кислоты по 3.40.

Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 16,73 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 0,523 г однозамещенного фосфорнокислого калия и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (7,9 ± 0,1) с помощью растворов гидрата окиси калия или соляной кислоты.

Растворы стерилизуют при температуре (112 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин.

Срок хранения растворов в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - не более 30 сут.

б) Приготовление основного раствора стрептомицина с массовой концентрацией 500 мкг/см3

(5 ± 1) мг стрептомицина по [3] растворяют в конической колбе вместимостью 25 см3 в фосфатном буферном растворе 1. Соотношение фактического значения массовой концентрации стрептомицина к объему буферного раствора 1 должно быть 1:100.

Пример - При массовой концентрации стандарта стрептомицина 760 мкг/см3 5 мг антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см3 буферного раствора 1, получив основной раствор с массовой концентрацией 500 мкг/см3.

Срок хранения основного раствора стрептомицина в посуде из темного стекла с притертой пробкой при температуре (5 ± 1) °С - не более 30 сут.

в) Приготовление контрольного раствора стрептомицина с массовой концентрацией 2,5 мкг/см3 Подготавливают три стерильных пробирки вместимостью 10 см3. В первую пробирку наливают

1 см3 фосфатного буферного раствора 2 и 1 см3 основного раствора стрептомицина, во вторую - 9 см3 фосфатного буферного раствора 2 и 1 см3 раствора из первой пробирки, в третью - 9 см3 стерильного обезжиренного молока по 5.1.1.5 б) и 1 см3 раствора из второй пробирки.

Массовая концентрация стрептомицина в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см3. Третье разведение с массовой концентрацией 2,5 мкг/см3 является контрольным раствором.

Срок хранения контрольного раствора стрептомицина - не более 12 ч.

Допускается вместо контрольного раствора стрептомицина использовать предварительно восстановленный по ГОСТ 23454 (аналогично) препарат СКИВ по [2].

5.1.2 Проведение определения

5.1.2.1 На поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 5.1.1.4, пробойником по 3.14 или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм (см. рисунок 1). Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки в случае использования контрольного раствора стрептомицина.

5.1.2.2 В шесть лунок, расположенных по окружности чашки, пипеткой по 3.23 вносят по 0,05 см3 анализируемого молока, подготовленного по 5.1.1.5 а). В центральную лунку вносят 0,05 см3 контрольного раствора стрептомицина.

Рисунок 1 - Схема расположения лунок

5.1.2.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 ± 1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

5.1.3 Обработка результатов

5.1.3.1 Результаты определения оценивают непосредственно после инкубирования по 5.1.2.3, просматривая чашки Петри в проходящем свете от любого источника света.

Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых при взаимодействии с антибиотиками в пробах анализируемого молока и контрольным раствором стрептомицина, измеряют линейкой или на аппарате «Микрофот 5ПО-1» по краям окружностей зон.

5.1.3.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного раствора стрептомицина (центральная лунка) определение повторяют.

5.1.3.3 Зона ингибиции диаметром 12 мм и более свидетельствует о присутствии антибиотиков в анализируемой пробе молока.

Зона ингибиции диаметром не более 12 мм или ее отсутствие свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе.

(Поправка. ИУС 12-2010 г.)

5.2 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis C953 от фиолетовой до желтой - при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и сохранении фиолетовой окраски - при наличии антибиотиков.

5.2.1 Подготовка к определению

5.2.1.1 Подготовка бутылочек со средой № 1

Стеклянную бутылочку со средой № 1 по 3.43 вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре (20 ± 5) °С.

Открывают бутылочку, колпачок помещают на стол вниз донышком.

Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.

5.2.1.2 Подготовка ампул со средами № 2 и № 3

Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают необходимое число ампул от блока со средой № 2 по 3.44 или средой № 3 по 3.45 и маркируют их. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С.

Соединительной частью шприца-дозатора по 3.24 прокалывают укупорочный материал ампул со средами № 2 или № 3. В каждую открытую ампулу со средой № 2 пинцетом помещают по одной таблетке среды № 1 по 5.2.1.1. Затем бутылочку с таблетированной питательной средой по 5.2.1.1 плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20 ± 2) °С.

5.2.2 Проведение определения

5.2.2.1 В каждую ампулу по 5.2.1.2 шприцем-дозатором вносят 0,1 см3 анализируемого молока, используя каждый раз новый наконечник. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С до окончания определения.

Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0 ± 0,5) °С в течение 3 ч.

5.2.2.2 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.2.2.1. В ампулу вносят 0,1 см3 предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

5.2.3 Обработка результатов

5.2.3.1 Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого анализируемого молока.

5.2.3.2 Желтый цвет содержимого ампул с анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков. Фиолетовое кольцо, образовавшееся на поверхности содержимого ампул (диаметром не более 1 мм), не учитывают.

5.2.3.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул с контрольной пробой и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии антибиотиков.

5.3 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis от синей до желтой при отсутствии в испытуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении синей окраски - при наличии антибиотиков.

5.3.1 Подготовка к определению

Отрезают необходимое число полосок от тестовых пластин тест-набора № 1 по 3.46 или берут требуемое количество пластин или пробирок тест-набора № 1. Удаляют запаянную фольгу с тестовых полосок и пластин или откупоривают пробирки. Оставшиеся пластины или пробирки хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С.

5.3.2 Проведение определения

5.3.2.1 При использовании пластин или полосок в одну из ячеек каждой пластины или полоски одноразовой пипеткой вносят 0,1 см3 контрольного раствора молока без антибиотиков по 3.46, в другую ячейку - 0,1 см3 контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные ячейки пластины или полоски вносят по 0,1 см3 анализируемого молока в двукратной повторности.

5.3.2.2 При использовании пробирок в одну пробирку одноразовой пипеткой вносят 0,1 см3 контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую - 0,1 см3 контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные пробирки одноразовой пипеткой вносят по 0,1 см3 анализируемого молока в двукратной повторности.

5.3.2.3 Тестовые пластины и полоски заклеивают самоклеящейся лентой по 3.46, пробирки закупоривают и помещают в блок термостатированных ячеек по 3.5 или на водяную баню по 3.6 при температуре (65,0 ± 0,5) °С и выдерживают до тех пор, пока содержимое на дне ячейки тестовых пластин или полосок, или пробирки с контрольным раствором молока без антибиотиков не окрасится полностью в желтый цвет в течение (135 ± 15) мин.

5.3.3 Обработка результатов

5.3.3.1 Пробирки, тестовые пластины или тестовые полоски извлекают из блока термостатируемых ячеек или водяной бани и определяют цвет содержимого на дне, не нарушая их целостности.

5.3.3.2 Желтый цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков.

5.3.3.3. Синий цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии в нем антибиотиков.

Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке приведены в таблице 1.

Таблица 1

Ед/г (мкг/г)*

При работе с химическими реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007.

Работу со споровой тест-культурой в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [6].

Ключевые слова: молоко и молочные продукты, чашечный метод с Bacillus stearothermophilus, метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур, метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный, метрологические характеристики, требования безопасности

files.stroyinf.ru

Смотрите также

• 
  Антибиотики при эрозии шейки матки
• 
  Содержит ли мясо индейки антибиотики
• 
  Антибиотики при отите у кошек
• 
  Антибиотики при свище на десне
• 
  Антибиотик при язве двенадцатиперстной кишки
• 
  Антибиотик при красном горле ребенку
• 
  Антибиотики в таблетках при бронхите
• 
  Эпидермальный стафилококк чувствительность к антибиотикам
• 
  Планирование ребенка после приема антибиотиков
• 
  Ацикловир это антибиотик или противовирусное
• 
  Леденцы от кашля с антибиотиком