Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а. Вакцина сорбированная это

Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура, адъюванты гидроокись алюминия с сапонином и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока. 10 з.п. ф-лы, 7 пр., 8 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А.

Ящур - особо опасное, карантинное заболевание парнокопытных животных, характеризующееся типовой и вариантной изменчивостью вируса, высокой контагиозностью и аэрогенной передачей возбудителя, острым течением и эпизоотическим проявлением [1].

Широкое распространение ящура, равно как и сложности, возникающие при диагностике и подборе вакцинных штаммов при противоэпизоотических мероприятиях, обусловлены высокой мутационной изменчивостью генома и антигенным разнообразием вируса ящура [2, 3].

Профилактическая эффективность вакцин, определяемая по эпидемиологическим показателям, устанавливается в группах привитых животных при угрозе возникновения и распространения болезни. Вакцины должны обеспечивать создание массовой невосприимчивости и препятствовать распространению эпизоотических штаммов вируса ящура. Так, для успешного проведения профилактической групповой вакцинации необходима информация об антигенном соответствии вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов, циркулирующих в зоне профилактической вакцинации. При возникновении вспышек заболевания именно путем определения антигенного соответствия эпизоотического изолята производственному штамму можно наиболее оперативно определить подходящий штамм для производства вакцин, применяемых в угрожаемой зоне [1].

Для обеспечения устойчивого благополучия страны по ящуру в Российской Федерации реализуется система мероприятий, приоритетными в которой являются предупреждение заноса вируса ящура на территорию страны, а в районах высокой степени риска - вакцинопрофилактика. В Российской Федерации и странах СНГ для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота против ящура применяют, как правило, инактивированные сорбированные, а для иммунизации свиней - инактивированные эмульсионные вакцины [4].

Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа, с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.

Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении [5].

Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья животных, его иммунного статуса и множества других факторов.

Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами [2, 6].

Известны штаммы вируса ящура типа А, выделенные на территории СССР и использованные в качестве производственных при изготовлении противоящурных инактивированных вакцин. К ним относятся: штамм А7 №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; штамм Ат №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; штамм А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае. После ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в Коллекции эпизоотических штаммов вируса ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» [4, 5, 6].

Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А22 №550, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении [7].

Штамм А22 №550 вируса ящура выделен в 1964 году в Азербайджане и используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

В качестве чувствительной биологической системы используют новорожденных крольчат, а в качестве поддерживающей среды - фосфатно-буферный раствор.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.

Для инактивации вируса используют формальдегид, а из адъювантов - гидроокись алюминия (ГОА) с сапонином.

Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма А22 Ирак 24/64, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении.

Штамм А22 Ирак 24/64 вируса ящура был передан в виде афтозного материала из института Рази (Иран) в 1967 году. В Российской Федерации используется в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), а из адъювантов - гидроокись алюминия (ГОА) с сапонином.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма А №2045/Киргизия/2007, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъювантов и поддерживающую среду в соотношении, мкг [8]:

Штамм вируса ящура А №2045/Киргизия/2007 был выделен в Киргизской Республике от больной ящуром телки в 2007 г., принадлежит к генетической линии, получившей название А Иран/2005 [9, 10], используется в качестве производственного штамма при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

В качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН 7,4÷7,6.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют полигексаметиленгуанидин (ПГМГ), а для инактивации вируса - аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию добавляют тиосульфат натрия.

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2045/Киргизия/2007 представляет собой суспензию преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура. В качестве адъювантов используют ГОА с сапонином.

Основной недостаток известных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоит в недостаточной иммуногенной активности относительно эпизоотических изолятов вируса ящура типа А, циркулирующих в настоящее время в странах Закавказья, Центральной Азии и Ближнего Востока (Турция, Иран и т.д.), ввиду имеющихся существенных антигенных отличий. Они не обеспечивают надежной защиты восприимчивых животных от эпизоотического вируса ящура типа А, вызывающего заболевание в этих странах в последние годы.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины противоящурной инактивированной сорбированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных сорбированных против ящура типа А.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит в 1 см3 препарата: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученного предпочтительно в суспензионной культуре клеток ВНК-21, в количестве не менее 3,0 мкг и целевые добавки: ГОА предпочтительно в количестве 11000,0÷15000,0 мкг, сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг и поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг.

Исходный вирус для получения штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 выделен в июле 2013 году в селе Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7.4÷7.6.

Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025÷0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [11].

Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,005÷0,007% [12].

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 758 иммуногенные компоненты вируса ящура.

Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии [13].

Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см3 не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.

Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см3 готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОА в 1 см3 готового препарата в диапазоне от 11000,0 мкг до 15000,0 мкг.

К полученному концентрату добавляют дополнительно 10% водный раствор сапонина до его содержания в 1 см3 готового препарата в диапазоне от 500,0 мкг до 1500,0 мкг.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.

1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А;

2. активное вещество;

3. целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток животного происхождения и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

5. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА.

6. ГОА предпочтительно в количестве 11000,0÷15000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

7. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант сапонин.

8. Сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 в 1 см3 готового препарата.

9. В качестве целевой добавки вакцина содержит поддерживающую среду.

10. Поддерживающая среда в количестве до 1000000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг/см3:

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал из штамма

А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура серотипа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации обеспечивающего получение противоящурной вакцины сорбированной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А депонирован 28 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (производственный).

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А.

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура относится к типу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составила: А22 №550 - 22,65%, А22/Ирак/64 - 21,66%, А/Иран/96 - 21,43%, А/Армения/98 - 21,98%, А/Турция/Об -8,23%, А/Иран/05 - 8,75%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 принадлежит к генетической линии «Иран-2005» топотипа «Азия» вируса ящура серологического типа А и антигенно отличается от имеющихся производственных штаммов ВЯ типа А.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А22 Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/Об (А/Иран/05), А/Киргизия/07 (А/Иран/05).

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для А22 №550 - 0,013, А22 Ирак/64 - 0,02, А/Иран/97 - 0,03, А/Турция/06-0,19 и А/Киргизия/2007 - 0,03. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [14, 15].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 репродуцируется в монослойных культурах клеток: первично трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18÷24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах достигает значений от 6,00 до 7,50 Ig ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1÷10 ТЦД/клетка) вирус вызывает ЦПД через 5 часов. Вирус сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристика

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×109 Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А, обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.

Для снижения его эпизоотической опасности важна своевременная вакцинопрофилактика для предотвращения возникновения новых очагов болезни, для чего необходима высокоиммуногенная вакцина.

Получена высокоиммуногенная инактивированная сорбированная вакцина против ящура типа А из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена также примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем правовой охраны изобретения.

Пример 1

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вирус ящура типа А был изолирован из полевого материала, поступившего в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в виде эпителия афт от КРС, подозреваемого в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов.

Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопробы в первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1÷10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см3 поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18÷24 часов проявлялось (%) 90÷100 ЦПД в монослое.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2 использовали для получения антигена для РСК.

Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.

Результаты адаптации вируса к клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной активности штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.

Пример 2

При изучении свойств штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 выявлены значительные преимущества в сравнении с используемыми производственными штаммами.

В таблицах 3 и 4 приведены результаты культивирования штаммов А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 и А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А, из которых следует:

1) штаммы А№2171/Кабардино-Балкарский/2013 и А №2045/Киргизия/2007 имеют разное время репродукции, 10,30±0,35 и 12,40±0,45 часов соответственно;

2) процент выхода иммуногенных компонентов при культивировании вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 выше, чем у штамма А №2045/Киргизия/2007.

Пример 3

Инактивированную сорбированную вакцину против ящура типа А готовят из штамма вируса ящура А№2171/Кабардино-Балкарский/2013, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4+7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005÷0,2 ТЦД50 на клетку.

Культивирование вируса ведут при температуре 36-37°С. Через 6÷7 часов инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15÷20%, то инкубирование продолжают еще 2+3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90+95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см3. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15÷20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0÷8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025÷0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при 36÷37°С и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5+6 часов в течение 3÷5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.

В теплую суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005÷0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.

В таблице 5 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75S) компоненты вируса ящура штаммов А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 и А №2045/Киргизия/2007.

Приведенные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что иммуногенные компоненты вируса ящура штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 не уступают в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства вирусу ящура штамма А №2045/Киргизия/2007. Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 не произошло изменений в количестве 146S и 75S компонентов, полученных при репродукции вируса.

Пример 4

Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в 1 см3 адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена ГОА.

Расчетный объем ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,28±0.22 р<0,001 мг/см3 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 3,0 мкг/см3 готового препарата. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,05÷0,15%, что соответствует 500,0÷1500,0 мкг сапонина в 1 см3 готовой вакцины. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТом 28085-89.

Пример 5

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 см3, а затем подкожно в дозе 10,0 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура типа А приведен в таблице 6.

Пример 6

Изучен гуморальный иммунитет у КРС, привитого сорбированной вакциной из штамма вируса ящура А №2045/Киргизия/2007, против гетерологичного штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013. Уровень гуморального иммунитета оценивали против вакцинного штамма А №2045/Киргизия/2007 и против штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013.

Испытание провели на 10 головах КРС. Сорбированную вакцину вводили подкожно в дозе 2,0 см3. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Из приведенных в таблице 7 данных видно, что сорбированная вакцина стимулировала у КРС выработку вируснейтрализующих антител против штамма А №2045/Киргизия/2007 в количестве от 4,80±0,24 до 5,40±0,06 log2. Против гетерологичного штамма А№2171/Кабардино-Балкарский/2013 титр вируснейтрализующих антител был в 4,3÷7,5 раза меньше и составлял от 2,50±0,65 до 2,70±0,73 log2. Разница в титрах вируснейтрализующих антител является существенной и достоверной.

Из этого следует, что вакцина, изготовленная из производственного штамма А №2045/Киргизия/2007, не создает гуморальный иммунитет для защиты животных от заражения гетерологичным вирусом ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013. По рекомендациям МЭБ титр вируснейтрализующих антител должен составлять не менее 5,00 log2 [14].

Пример 7

Проведены испытания адсорбат-вакцины против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примерах 3 и 4, и содержащей, мкг:

Авирулентность и безвредность полученной вакцины проверили на 5 головах КРС. Препарат вводили каждому животному под слизистую языка в дозе 2,0 см3, а затем подкожно в дозе 10,0 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток. На протяжении всего срока наблюдения отклонений в клиническом состоянии животных не выявлено, а это значит, что введенная вакцина авирулентна и безвредна.

По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность вакцины для КРС. Испытание провели на 15 головах КРС. Результаты представлены в таблице 8. ИмД50 препарата была равна 0,11 см3, т.е. в прививной дозе вакцины содержалось 18 PD50.

По рекомендациям МЭБ, вакцина против ящура должна содержать не менее 6 PD50 в прививном объеме для КРС [14].

Следовательно, изготовленная инактивированная сорбированная вакцина из штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 имеет высокую иммуногенную активность.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления изобретения; вакцина, изготовленная из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.

Источники информации

1. Дудников А.И. Противоящурный иммунитет и практические достижения в области противоящурной защиты / А.И. Дудников, В.В. Борисов, С.А. Дудников // Пробл. зооiнженерii та вет. Медицини: зб. наук. прац. - Харькiв, 2007. - Вип. 15 (40). - Ч.2 - Т.1. - С.116-120.

2. Domingo, E. Evolution of FMD virus / E. Domingo, C. Escarmis, E. Baranovski // Virus Res. - 2003. - Vol.91, №1. - P.47-63.

3. Узюмов В.Л. Ультраструктура и физико-химические свойства вируса ящура / В.Л. Узюмов: Фрунзе: Кыргызстан, 1970. - 246 с.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев [и др.]. - М.: ВНИИТИБП, 1998. - С.532-548.

5. Ререр X. Ящур: пер. с нем. / Г.А. Сурковой; под ред. и с предисл. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.

6. Ящур: монография / A.M. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

7. Временная инструкция по изготовлению и контролю противоящурной концентрированной гидроокись алюминиевой формолвакцины из лапинизированного вируса А22. Утверждена ГУВ СССР 25.03.1971 г.

8. Заявка 2012134084 Российская Федерация, МПК A61K 39/135, Вакцина против ящура типа А инактивированная / Д.А. Лозовой, В.В. Михалишин, Д.В. Михалишин, В.А. Стариков [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Заявл. 09.08.2012; опубл. 20.02.2014 г.

9. Изучение биологических свойств вируса ящура линии А Иран/05 производственным штаммам типа А22 / М.В. Жильцова, С.Р. Кременчугская, А.И. Егорова, В.В. Борисов // Российский ветеринарный журнал. - 2008. - Сентябрь. - С.15-16.

10. Пат. 2451745 Российская Федерация, МПК A61K 39/135, Штамм А 2045/Киргизия/2007 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А / Е.В. Белик, В.В. Борисов, А.В. Щербаков, С.Р. Кременчугская [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Заявл. 26.07.2010; опубл. 27.05.2012 г.

11. Пат. 594771 Российская Федерация, МПК A61K 39/12, Средство для инактивации вирусов при изготовлении противовирусных препаратов / Н.А. Улупов, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий, Д.С. Жук; ВНИЯИ. - Заявл. 07.05.1973; опубл. 07.07.93 г.

12. Пат. 2054039 Российская Федерация, МПК А61К 39/135, Способ очистки и стерилизации культурального вируса ящура / Т.Н. Лезова, Н.А. Улупов, В.В. Борисов, В.В. Михалишин, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий; ВНИЯИ. - Заявл. 07.02.1992; опубл. 10.02.1996 г.

13. Авт. свид. 784335 СССР, C12Q 1/02, Способ определения качества вирусного сырья / А.Ф. Бондаренко; ВНИЯИ. - Заявл. 04.07.1979; опубл. 20.03.2000 г.

14. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - 7th ed. - Paris. 2012. - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P.166-169.

15. Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains a review / D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol.24, №3. - P.981-983.

1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа А, коллекция ФГБУ "ВНИИЗЖ" А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, в эффективном количестве.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171 /Кабардино-Балкарский/2013, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

4. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

5. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адъювант-сорбент гидроокись алюминия (ГОА).

6. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что она содержит ГОА предпочтительно в количестве 11000,0÷15000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

7. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адъювант сапонин.

8. Вакцина по п. 7, отличающаяся тем, что она содержит адъювант сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

9. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит поддерживающую среду.

10. Вакцина по п. 9, отличающаяся тем, что она содержит поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

11. Вакцина по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171 / Кабардино-Балкарский / 2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг/см3:

www.findpatent.ru

инактивированная сорбированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц - патент РФ 2283136

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц, инактивант димер этиленимина, адъюванты гидроокись алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Штамм (авторское наименование «К-58») депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером - штамм «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц. Штамм «К-58 №122-ДЕП» репродуцируется на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см3. Вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета. Вакцину применяют клинически здоровой птице в возрасте 110-120 суток в объеме 0,5 см3 однократно. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ птиц «родительской» стаи и обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 15-25-суточного возраста, безвредна, 12 з.п. ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц.

ИББ птиц (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) - широко распространенная высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят, преимущественно в возрасте 15-80 суток, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. ИББ поражает, в основном, -лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов.

ИББ протекает остро, с характерной клиникой заболевания и субклинически. Субклиническая форма имеет широкое распространение.

При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднение при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза заболевания.

ИББ птиц зарегистрирована во всех странах мира. В последние годы ИББ получила широкое распространение в большинстве крупных птицеводческих хозяйств России. Применение отечественных и импортных биопрепаратов в очагах инфекции не обеспечило ожидаемого эффекта. Это объясняется тем, что их применению не предшествовало изучение антигенных свойств циркулирующих изолятов вируса ИББ, не определялись специфические антитела птицы до и после вакцинации, а также уровень пассивного материнского иммунитета у цыплят. Не учитывалась известная особенность возбудителя ИББ - его антигенная изменчивость в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки и на разных территориях и зависящая от видового и породного состава птичьего поголовья, его иммунного статуса, и множество других факторов.

В связи с этим выбор вакцинного штамма вируса ИББ птиц должен проводиться с учетом антигенной структуры эпизоотического изолята и для приготовления вакцинных препаратов необходимо использовать производственные штаммы, обладающие наибольшей степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическими изолятами вируса ИББ.

Экономический ущерб от ИББ, обусловленный гибелью до 20-70% поголовья цыплят при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также в результате возникновения вторичных инфекций, очень велик.

В настоящее время общепризнано, что единственно правильным и надежным направлением в борьбе с инфекцией является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики ИББ используют живые и инактивированные вакцины из гомологичных штаммов возбудителя инфекции, выращенных в различных чувствительных биологических системах.

В большинстве птицехозяйств цыплят прививают 2-кратно живыми вакцинами, а ревакцинируют в 16-20-недельном возрасте инактивированной вакциной. Это обусловлено тем, что при ИББ введение живых вакцин взрослой птице не формирует у нее напряженный иммунитет, что связано с ее возрастными особенностями. По этой причине для специфической профилактики ИББ взрослой птицы широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

При изготовлении инактивированной вакцины широко используют вирулентные штаммы вируса ИББ птиц.

Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма Д78, АТСС №VP-2041, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур [1].

Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, сордержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма GP/82, NCAJM №V(Р)-001033, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали культуру клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур [2].

Известна инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма 689, ЕСАСС №V00012609, полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и адъювант в эффективном соотношении [3].

Основной недостаток известных вакцин состоит в том, что они являются импортными препаратами и не обеспечивают удовлетворительной защиты против вируса ИББ птиц, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма "БГ" №102-ДЕП", полученный в чувствительной биологической системе, инактивант и, по меньшей мере, один адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур [4].

Недостаток вакцины-прототипа состоит в том, что она обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной сорбированной вакцины на основе нового штамма вируса ИББ птиц, обладающего более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью в нативном виде и после инактивации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности и безвредности предлагаемой вакцины.

Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:

1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц.

2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, в эффективном количестве.

3. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц.

4. В качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур.

5. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации.

6. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%.

7. Инактивант.

8. Из инактивантов димер этиленимина (ДЭИ).

9. ДЭИ в виде 15% водного раствора.

10. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.

11. Адъювант.

12. Из адъювантов гидроокись алюминия (ГОА).

13. ГОА в виде 3-4% геля.

14. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%.

15. Из адъювантов дополнительно сапонин.

16. Сапонин в виде 10% водного раствора.

17. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%.

18. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Предлагаемое изобретение содержит следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц.

2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, в эффективном количестве.

3. Инактивант.

4. По меньшей мере, один адъювант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД 50/0,2см3 и подвергнутый инактивации.

2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%.

3. Из инактивантов ДЭИ.

4. ДЭИ в виде 15% водного раствора.

5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.

6. Из адъювантов ГОА.

7. ГОА в виде 3-4% геля.

8. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%.

9. Из адъювантов дополнительно сапонин.

10. Сапонин в виде 10% водного раствора.

11. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%.

12. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц.

2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации.

3. Инактивант.

4. По меньшей мере, один адъювант.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что она содержит эффективное количество антигенного материала из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации.

2. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД 50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%.

3. Из инактивантов ДЭИ.

4. ДЭИ в виде 15% водного раствора.

5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.

6. Из адъювантов ГОА.

7. ГОА в виде 3-4% геля.

8. ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%.

9. Из адъювантов дополнительно сапонин.

10. Сапонин в виде 10% водного раствора.

11. Сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%.

12. Антигенный материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

По сравнению с вакциной-прототипом инактивированная сорбированная вакцина на основе штамма "К-58 №122-ДЕП" обладает более высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной.

Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что в ее состав введен вирусный материал из нового аттенуированного штамма "К-58 №122-ДЕП", гомологичного возбудителю инфекции и не вызывающего иммуносупрессии у привитой птицы.

Исходный вирус (авторское наименование изолята "К-58") для получения штамма "К-58 №122-ДЕП" выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров на птицефабрике "Васильевская" Пензенской области в 1994 году. Вакцинный штамм "К-58 №122-ДЕП" получен путем многократных последовательных пассажей исходного изолята на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и SPF-цыплятах.

Штамм "К-58" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц.

По сравнению со штаммом "БГ" №102-ДЕП" штамм "К-58 №122-ДЕП" не вызывает иммуносупрессии и обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц.

Штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц относится к семейству Birnaviri-dae, роду Avibirnavirus, серотипу I и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона икосаэдрическая, размер вириона 58-60 нм. Капсид Т13, оболочка отсутствует.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм "К-58 №122-ДЕП" относится к сероварианту I. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА-1:400-1:10000 и более, при гипериммунизации в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА>1:10000. Для определения генотаксономической гомологии вакцинного штамма "К-58 №122-ДЕП" и полевых изолятов вируса ИББ сравнили вариабельные области VP2 полевых изолятов (37 образцов, выделенных в 1993-1996 гг. на территории РФ и странах СНГ) и вакцинных штаммов (7 образцов коммерческих живых вакцин). Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Taq-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный эпитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей-Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) на 5-8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму "К-58 №122-ДЕП".

Биотехнологические характеристики

Штамм "К-58 №122-ДЕП" предназначен для изготовления живой и инактивированной вакцин и диагностических биопрепаратов. Штамм "К-58 №122-ДЕП" репродуцируется в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур при температуре 37,7°С и влажности 55-64%. В течение 72-96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см 3.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм "К-58 №122-ДЕП" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой РНК 2,16×106 Da. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирус имеет белковую оболочку, образованную 5 видами белков (VP1, VP2, VP3, VP4 и VP5):

VP1 - РНК-зависимая РНК-полимераза;

VP2, VP3 - структурные белки;

VP4 - протеаза;

VP5 - не идентифицирован.

Липиды отсутствуют.

Штамм "К-58 №122-ДЕП" проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в области РНК, кодирующей VP2. Мутации, ведущие к замене аминокислот, определяют антигенную вариабельность VP2.

Штамм "К-58 №122-ДЕП" проявляет высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993-1996 г.

Физические свойства

Масса вириона составляет 55,0×106 Da. Коэффициент седиментации 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33-1,34 г/см 3 в градиенте CsCl.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "К-58 №122-ДЕП" устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, -облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%.

Реактогенность - отсутствует.

Патогенность - отсутствует.

Вирулентность - отсутствует.

Онкогенность - отсутствует.

Контагиозность - отсутствует.

Штамм "К-58 №122-ДЕП" является стабильным и не вызывает иммуносупрессии.

По безопасности и иммуногенности штамм "К-58 №122-ДЕП" полностью отвечает требованиям О.I.E. (МЭБ).

Комиссионные испытания подтвердили полное соответствие штамма "К-58 №122-ДЕП" предъявляемым требованиям и явились основанием для его депонирования во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц.

На основании приведенных сведений можно утверждать, что штамм "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц по антигенному и иммуногенному спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ИББ птиц.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Матровую расплодку вируса из штамма "К-58 №122-ДЕП" в эмбрионах SPF-кур получают следующим образом. На границе подскорлупной оболочки и хориоаллантоисной оболочки (ХАО) делают насечку, не повреждая ХАО, и затем с помощью шприца вводят вируссодержащий материал в количестве 0,2 см3 на ХАО. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают, экстрагируют при температуре 4°С в течение 45 минут, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5, центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Полученную вируссодержащую жидкость с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см3 используют в качестве матровой расплодки.

Пример 2

На первом этапе готовят матровый материал из штамма "К-58 №122-ДЕП" вируса ИББ птиц так, как описано в примере 1. Полученную вируссодержащую жидкость используют для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур. Вирусный материал в количестве 0,2 см3 вводят на ХАО и инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С и полученное сырье используют для изготовления вакцины. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют в течение 45 минут при температуре 4°С, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5 и центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин, очищая его таким образом от балластных примесей.

Очищенную суспензию подают в стерильный реактор для инактивации вируса. Из инактивантов используют ДЭИ в виде 15% водного раствора, рН 7,9-8,0. В подогретую до 27°С вируссодержащую суспензию с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см3 вносят ДЭИ в количестве, соответствующем его 0,1-0,3 мас.% содержанию в готовом препарате. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 27°С в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8°С. Из адъювантов - сорбентов в вакцине используют стерильный 3-4% гель ГОА. Значение рН ГОА устанавливают в пределах 7,5-7,6 и охлаждают до 2-8°С. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют ГОА в количестве, соответствующем его 12,7-44,4 мас.% содержанию в готовом препарате. Затем к смеси дополнительно добавляют 10% водный раствор сапонина в количестве, соответствующем его 0,5-2,0 мас.% содержанию в готовом препарате. Смесь перемешивают в течение часа, определяют рН препарата и при необходимости доводят его значение до 7,4-7,6.

Полученная вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность и фасуют в стерильные флаконы. Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89 (ст. СЭВ 6280-88).

Авирулентность препарата определяют методом трехкратных "слепых" пассажей вакцины на развивающихся SPF-эмбрионах 10-суточного возраста.

Вакцину применяют клинически здоровой птице для создания высокого уровня иммунитета. Птиц вакцинируют в возрасте 110-120 суток однократно. Препарат вводят внутримышечно в объеме 0,5 мл.

Иммунитету вакцинированной птицы наступает на 14-21 сутки после вакцинации и сохраняется до 12 месяцев. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ у птиц "родительской стаи" и обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 15-25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевого вирулентного вируса ИББ в ранний период жизни.

Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав (мас.%), представленный в таблице 1.

Содержание антигена в предлагаемой вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающем достижение технического результата.

Пример 3.

Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 сутки у птиц брали кровь, получали сыворотки и затем исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной сорбированой вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП".

Пример 4.

Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра.

Через 21 сутки после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител против ИББ.

Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП".

Пример 5.

Проведено определение иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Иммуногенную активность определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 сутки у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма "К-58 №122-ДЕП".

Пример 6.

Проведена сравнительная оценка иммуногенной активности вакцины-прототипа и инактивированной сорбированной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Иммуногенную активность вакцин определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител против вируса ИББ. Вакцины вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 мл. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что жидкая инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, изготовленная из аттенуированного штамма "К-58 №122-ДЕП", значительно превосходит вакцину против ИББ (титр антител выше в 1,88 раза), изготовленную из штамма "БГ" №102-ДЕП", и обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 15-25-суточного возраста, что позволяет защитить его от заболевания ИББ в ранний период жизни.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, приготовленная из штамма "К-58 №122-ДЕП" в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Пат. США №4530831, 424-89, 23.07.85 г.

2. Пат. Венгрии №203781; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12; 28.08.90 г.

3. Пат. США №6451321, 424-204.1, 17.09.02 г.

4. Пат. РФ №2127603; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 20.03.99 г. (прототип).

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Инактивированная сорбированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и, по меньшей мере, один адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигенного материала она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц (Bursitis infectiosa gallinae), семейства Birnaviridae, рода Avibirnavirus, серотипа 1, коллекция ФГУ ВГНКИ «К-58 №122-ДЕП», в эффективном количестве.

2. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД 50/0,2см3 и подвергнутый инактивации.

3. Инактивированная сорбированная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД 50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, в количестве 55,0-85,0 мас.%.

4. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из инактивантов она содержит димер этиленимина (ДЭИ).

5. Инактивированная сорбированная вакцина по п.4, отличающаяся тем, что она содержит ДЭИ в виде 15%-ного водного раствора.

6. Инактивированная сорбированная вакцина по п.5, отличающаяся тем, что она содержит ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.

7. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит гидроокись алюминия (ГОА).

8. Инактивированная сорбированная вакцина по п.7, отличающаяся тем, что она содержит ГОА в виде 3-4% геля.

9. Инактивированная сорбированная вакцина по п.8, отличающаяся тем, что она содержит ГОА в количестве 12,7-44,4 мас.%.

10. Инактивированная сорбированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит дополнительно сапонин.

11. Инактивированная сорбированная вакцина по п.10, отличающаяся тем, что она содержит сапонин в виде 10%-ного водного раствора.

12. Инактивированная сорбированная вакцина по п.11, отличающаяся тем, что она содержит сапонин в количестве 0,5-2,0 мас.%.

13. Инактивированная сорбированная вакцина по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/0,2см3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

www.freepatent.ru

Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против ящура типа А. Охарактеризованная вакцина является инактивированной сорбированной и содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса ящура, депонированного в коллекции ФГБУ “ВНИИЗЖ” под регистрационным номером ВЯ А №2187/Кути/2013 (производственный), адъюванты гидроокись алюминия с сапонином и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Штамм получен в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ. 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А.

Ящур животных продолжает оставаться мировой проблемой, к которой приковано внимание ветеринарных служб большинства государств мира и международных организаций (МЭБ, ФАО, ЕС, их комиссий и комитетов) [1].

Ящур представляет собой высококонтагиозное и быстро распространяющееся заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытцевой щели и сопровождающееся нарушением движения. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению [2].

Контроль над ящуром значительно осложняется плюралитетом его возбудителя. Различают 7 серотипов вируса ящура (ВЯ): А, О, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. В пределах каждого серотипа обнаружены многочисленные антигенные варианты.

Причиной антигенного многообразия ВЯ является его чрезвычайно высокая изменчивость. Антигенные различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций в определенных участках генома из-за ошибок вирусной РНК-полимеразы в процессе репликации вирусной РНК. Из всех участков генома максимальной вариабельностью отличается ген VP1, кодирующий основной иммуногенный белок вируса [3].

Для обеспечения устойчивого благополучия страны по ящуру в Российской Федерации реализуется система мероприятий, приоритетными в которой являются предупреждение заноса вируса ящура на территорию страны, а в районах высокой степени риска - вакцинопрофилактика. В Российской Федерации и странах СНГ для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота против ящура применяют, как правило, инактивированные сорбированные, а для иммунизации свиней - инактивированные эмульсионные вакцины [4].

Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.

Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении [5].

Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья животных, его иммунного статуса и множества других факторов.

Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами [2,5].

Известны штаммы вируса ящура типа А, выделенные на территории СССР и использованные в качестве производственных при изготовлении противоящурных инактивированных вакцин. К ним относятся: штамм Ау №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; штамм Ат №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; штамм А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае. После ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в Коллекции эпизоотических штаммов вируса ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» [2, 5].

Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А22 №550, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении [6].

Штамм А22 №550 вируса ящура выделен в 1964 году в Азербайджане и используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

В качестве чувствительной биологической системы используют новорожденных крольчат, а в качестве поддерживающей среды -фосфатно-буферный раствор.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.

Для инактивации вируса используют формальдегид, а из адъювантов - гидроокись алюминия (ГОА) с сапонином.

Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма А22 Ирак 24/64, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении.

Штамм А22 Ирак 24/64 вируса ящура был передан в виде афтозного материала из института Рази (Иран) в 1967 году. В Российской Федерации используется в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

В качестве чувствительной биологической системы используют новорожденных крольчат, а в качестве поддерживающей среды -фосфатно-буферный раствор.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), а из адъювантов ГОА с сапонином.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма А №2045/Киргизия/2007, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъювантов и поддерживающую среду в соотношении, мкг [7]:

Штамм вируса ящура А №2045/Киргизия/2007 был выделен в Киргизской Республике от больной ящуром телки в 2007 г. Принадлежит к генетической линии, получившей название А Иран/2005 [8]. Используется в качестве производственного штамма при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

В качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН 7,4÷7,6.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют полигексаметиленгуанидин (ПГМГ), а для инактивации вируса - АЭЭИ. Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию добавляют тиосульфат натрия.

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2045/Киргизия/2007 представляет собой суспензию преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура. В качестве адъювантов используют ГОА с сапонином.

Основной недостаток известных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоит в том, что они не обеспечивают надежной защиты восприимчивых животных от эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины противоящурной инактивированной сорбированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных сорбированных против ящура типа А.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит в 1 см3 препарата: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013, полученного предпочтительно в суспензионной культуре клеток ВНК-21, в количестве не менее 3,0 мкг, и целевые добавки: ГОА предпочтительно в количестве 11000,0÷15000,0 мкг, сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг и поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг.

Исходный вирус для получения штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 выделен в 2013 году в России. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4÷7,6.

Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025÷0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [9].

Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,005÷0,007% [10].

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 758 иммуногенные компоненты вируса ящура.

Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии [11].

Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см3 не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.

Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см3 готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОА в 1 см3 готового препарата в диапазоне от 11000,0 мкг до 15000,0 мкг.

К полученному концентрату добавляют дополнительно 10% водный раствор сапонина до его содержания в 1 см3 готового препарата в диапазоне от 500,0 мкг до 1500,0 мкг.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.

1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А;

2. активное вещество;

3. целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток животного происхождения и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

5. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА.

6. ГОА предпочтительно в количестве 11000,0÷15000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

7. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант сапонин.

8. Сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

9. В качестве целевой добавки вакцина содержит поддерживающую среду.

10. Поддерживающая среда в количестве до 1000000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг:

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.

Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного Вещества антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура серотипа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации обеспечивающего получение противоящурной вакцины сорбированной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013, был выделен в сентябре 2013 года от больных свиней в селе Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187). Производственный штамм получен из данного изолята путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А депонирован 22 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 (производственный).

Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетическое взаимоотношения штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А.

Штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм вируса ящура А№2187/Кути/2013 типа А относится к семейству Picomaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А№2187/Кути/2013 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2187/Кути/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А22 №550 - 21,49%, А22/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/Об - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2187/Кути/2013 принадлежит к генетической линии Юго-Восточная Азия 97 (Sea-97) топотипа Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2187/Кути/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2187/Кути/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А №2179/Щелковский биокомбинат, А/Иран/97, А/Киргизия/07 (А/Иран/05). Штамм ВЯ А №2187/Кути/2013 имеется слабо выраженное антигенное родство со штаммом А/Турция/06 (А/Иран/05).

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для А22 №550 - 0,13, А №2179/Щелковский биокомбинат - 0,11, А/Иран/97 - 0,004, А/Турция/06 - 0,37, А №2045/Киргизия/07 - 0,13. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [12, 13].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2187/Кути/2013 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1÷10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Генотаксономическая характеристика

Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106 Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2187/Кути/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А №2187/Кути/2013 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А, который обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.

Для снижения его эпизоотической опасности важна своевременная вакцинопрофилактика для предотвращения возникновения новых очагов болезни, для чего необходима высокоиммуногенная вакцина.

Разработана новая инактивированная сорбированная вакцина против ящура из штамма А №2187/Кути/2013. Экспериментально подтверждена возможность ее использования для профилактической иммунизации животных.

Пример 1.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в сентябре 2013 года от подозреваемых в заболевании ящуром свиней из села Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187/2013). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 26 сентября 2013 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [14].

Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса, которое проводили на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1÷10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см3 поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18÷24 часов проявлялось (%) 90÷100 ЦПД в монослое.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК.

Эпизоотический изолят А №2187/Кути/2013, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в РСК с целью идентификации его типовой принадлежности (таблица 3). Проведена проверка штамма на отсутствие контаминации посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2187/Кути/2013 выявлен антиген вируса ящура типа А в разведении 1:2 в РСК. Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.

Полученному штамму вируса ящура типа А присвоено авторское наименование: штамм А №2187/Кути/2013.

Пример 2.

В таблице 4 приведены результаты культивирования штамма А№2187/Кути/2013 вируса ящура типа А в суспензии клеток ВНК-21, из которых следует:

1) штамм А №2187/Кути/2013 имеет время репродукции 12,60±0,47 ч;

2) у штамма А №2187/Кути/2013 наблюдается накопление вирусспецифического белка в пределах 2,98±0,13 мкг/см3;

3) накопление иммуногенных компонентов (146S+75S) у штамма А №2187/Кути/2013 - 2,54±0,14 мкг/см3.

Пример 3.

Инактивированную сорбированную вакцину против ящура типа А готовят из штамма вируса ящура А№2187/Кути/2013, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4÷7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005÷0,2 ТЦД50 на клетку.

Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15÷20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0÷8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025÷0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при 36÷37°С и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5÷6 часов в течение 3÷5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.

В теплую суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005÷0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.

В таблице 5 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75S) компоненты вируса ящура штаммов А №2187/Кути/2013 и А №2045/Киргизия/2007.

Из приведенных в таблице 5 данных видно, что компоненты вируса ящура штамма А №2187/Кути/2013 сохраняются после инактивации и очистки в условиях производства. Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса из штамма А №2187/Кути/2013 не произошло изменений в количестве 146S и 75S компонентов, полученных при репродукции вируса.

Пример 4.

Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в 1 см3 адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена ГОА.

Расчетный объем ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,28±0,22 р<0,001 мг/см3 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 3,0 мкг/см3 готового препарата. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,05÷0,15%, что соответствует 500,0÷1500,0 мкг сапонина в 1 см3 готовой вакцины. Вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТом 28085-89.

Пример 5.

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 см3, а затем подкожно в дозе 10,0 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.

Вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура типа А приведен в таблице 6.

Пример 6.

Изучена антигенная активность сорбированной вакцины из производственного штамма вируса ящура А №2045/Киргизия/2007 против гетерологичного штамма А №2187/Кути/2013. Уровень гуморального иммунитета оценивали против вакцинного штамма А №2045/Киргизия/2007 и против штамма А №2187/Кути/2013.

Испытание провели на 10 головах КРС. Сорбированную вакцину вводили подкожно в дозе 2,0 см3. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Из приведенных в таблице 7 данных видно, что сорбированная вакцина стимулировала у КРС выработку вируснейтрализующих антител против гомологичного штамма А №2045/Киргизия/2007 в количестве 4,80÷5,40 log2. Против гетерологичного штамма А№2187/Кути/2013 титр вируснейтрализующих антител был в 3,7÷4,4 раза меньше и составлял 2,90÷3,25 log2. Разница в титрах вируснейтрализующих антител является существенной и достоверной.

На 4 сутки после ревакцинации КРС количество вируснейтрализующих антител против вакцинного штамма А №2045/Киргизия/2007 возросло в 2 раза. Количество антител против вируса ящура штамма А №2187/Кути/2013 возросло незначительно.

Из опыта видно, что вакцина из производственного штамма А №2045/Киргизия/2007 не стимулирует выработку гуморального иммунитета для защиты животных от гетерологичного штамма А №2187/Кути/2013.

По рекомендациям МЭБ, титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных, иммунизированных цельной дозой вакцины, должны быть не менее 5,00 log2 [12].

Пример 7.

Проведены испытания сорбированной вакцины против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примерах 3 и 4, и содержащей, мкг:

авирулентный и очищенный

антигенный материал из штамма

Авирулентность и безвредность полученной вакцины проверили на 5 головах КРС. Препарат вводили каждому животному под слизистую языка в дозе 2,0 см3, а затем подкожно в дозе 10,0 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток. На протяжении всего срока наблюдения отклонений в клиническом состоянии животных не выявлено, а это значит, что введенная вакцина авирулентна и безвредна.

По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность для КРС. Испытание провели на 15 головах КРС. Результаты представлены в таблице 8. ИмД50 препарата была равна 0,25 см3, т.е. в прививной дозе вакцины содержалось 8 PD50.

По рекомендациям МЭБ, вакцина против ящура должна содержать, не менее 6 PD50 в прививном объеме для КРС [12].

Отсюда следует, что изготовленная вакцина из штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 имеет высокую иммуногенную активность.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления изобретения; вакцина, изготовленная из штамма А №2187/Кути/2013 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке.

Источники информации

1. Рахманов A.M. Программа совместных действий государств участников СНГ по профилактике и борьбе с ящуром и ее реализация // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2011. - Т.9. - С.29-46.

2. Ящур: монография / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

3. Antigenic heterogeneity of a foot-and-mouth disease virus serotype in the field is mediated by very limited sequence variation at several antigenic sites / М. G. Mateu, J. Hernandez, М. A. Martinez [et al.] // J. Virol. - 1994. - Vol.68. - P.1407-1417.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев [и др.]. - М.: ВНИИТИБП, 1998. - С.532-548.

5. Ререр X. Ящур: пер. с нем. / ГА. Сурковой; под ред. и с предисл. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.

6. Временная инструкция по изготовлению и контролю противоящурной концентрированной гидроокись алюминиевой формолвакцины из лапинизированного вируса А22. Утверждена ГУВ СССР 25.03.1971 г.

7. Заявка 2012134084 Российская Федерация, МПК А61К 39/135, Вакцина против ящура типа А инактивированная / Д.А. Лозовой, В.В. Михалишин, Д. В. Михалишин, В.А. Стариков [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ» - Заявл. 09.08.2012; опублик. заявл. 20.02.2014 г.

8. Изучение биологических свойств вируса ящура линии А Иран/05 производственным штаммам типа Ag2 / М.В. Жильцова, С.Р. Кременчугская, А.И. Егорова, В.В. Борисов // Российский ветеринарный журнал - 2008. - Сентябрь. - С.15-16.

9. Пат.594771 Российская Федерация, МПК А61К 39/12, Средство для инактивации вирусов при изготовлении противовирусных препаратов/ Н.А. Улупов, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий, Д.С. Жук; ВНИЯИ - Заявл. 07.05.1973; опубл. 07.07.93 г.

10. Пат.2054039 Российская Федерация, МПК А61К 39/135, Способ очистки и стерилизации культурального вируса ящура/ Т.Н. Лезова, Н.А. Улупов, В.В. Борисов, В.В. Михалишин, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий; ВНИЯИ - Заявл. 07.02.1992; опубл. 10.02.1996 г.

11. Авт. свид. 784335 СССР, C12Q 1/02, Способ определения качества вирусного сырья / А.Ф. Бондаренко; ВНИЯИ - Заявл. 04.07.1979; опубл. 20.03.2000 г.

12. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - 7th Ed. - Paris, 2012. - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P.166-169.

13. Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains a review / D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol.24(3). - P.981-983.

14. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса ящура Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа А, депонированный в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ А №2187/Кути/2013 (производственный), в эффективном количестве.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма ВЯ А №2187/Кути/2013, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма ВЯ А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

4. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма ВЯ А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

5. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адъювант-сорбент гидроокись алюминия (ГОА).

6. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что она содержит ГОА предпочтительно в количестве 11000,0 - 15000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

7. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адъювант сапонин.

8. Вакцина по п. 7, отличающаяся тем, что она содержит адъювант сапонин предпочтительно в количестве 500,0 - 1500,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

9. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит поддерживающую среду.

10. Вакцина по п. 9, отличающаяся тем, что она содержит поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.

11. Вакцина по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма ВЯ А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг:

www.findpatent.ru

Смотрите также

• Туберкулин это вакцина
• 
  Холодовая цепь вакцины
• 
  Вакцина от бронхита
• 
  Вакцина от диабета
• 
  Вангард плюс вакцина
• 
  Вакцины кто разрабатывает
• 
  Вакцины для поросят
• 
  Чума свиней вакцина
• 
  Полисахаридные вакцины это
• 
  Вакцина рожа свиней
• 
  Вакцины в ветеринарии