Н. К. Токаревич Академик рамн и. В. Тарасевич – руководитель разработки комбинированной инактивированной вакцины против Ку-лихорадки фгун санкт-Петербургский нииэм имени Пастера Роспотребнадзора. Вакцина против лихорадки ку

Академик РАМН И.В. Тарасевич – руководитель разработки

комбинированной инактивированной вакцины против Ку-лихорадки

ФГУН Санкт-Петербургский НИИЭМ имени Пастера

Роспотребнадзора

Ку-лихорадка (коксиеллез) – широко распространенная в мире [1], в том числе, и в России [2] зооантропонозная инфекция. Она выявлена более чем в 50 субъектах российской Федерации [3]. Возбудитель Ку-лихорадки - Сoxiella burnetii – облигатная внутриклеточная бактерия, способная к длительной персистенции в клетках системы мононуклеарных фагоцитов, что может приводить к хроническому течению болезни. Хроническая форма Ку-лихорадки достаточно частый исход этого заболевания, например, на юге Франции, от 5 до 8% всех случаев эндокардитов обусловлены С. burnetii [4]. Такое развитие болезни у людей нередко приводит к инвалидизации, а в значительном количестве случаев и к летальному исходу [5].

Кроме того, коксиеллёз наносит существенный экономический ущерб сельскому хозяйству, поскольку у заражённых коксиеллами овец и коз часто происходят аборты [6], а у коров заболевание вызывает бесплодие или снижение веса новорожденных животных [7]. Наконец, такие биологические свойства C.burnetii, как высокая патогенность для людей и устойчивость возбудителя к воздействию внешней среды позволяет рассматривать этот патоген в качестве потенциального агента для биологического терроризма [8, 9, 10].

Сказанное аргументирует необходимость профилактики коксиеллёзной инфекции, в том числе, с помощью разработки улучшенных вакцин против этой опасной болезни. Единственным профилактическим препаратом в отношении коксиеллёза, разрешённым к применению в России до настоящего времени, является живая вакцина, полученная на основе аттенуированного варианта «М-44» C.burnetii штамма Грита [11]. Создание этого препарата явилось важным этапом в развитии риккетсиологии в середине прошлого века, так как существенно расширило наши представления об изменчивости биологических свойств C.burnetii; его применение обеспечило надежную защиту вакцинированных. В дальнейшем на основе этого препарата была предпринята попытка разработки живой вакцины для энтерального применения [12].

Однако ряд сообщений свидетельствует о длительной персистенции C.burnetii у лабораторных животных, получавших вакцину «М-44» и об активации инфекции под воздействием метилпреднизолона и циклофосфамида. Более того, у значительной части морских свинок применение этой вакцины обусловило выраженные патологические изменения в селезёнке, печени и миокарде [13,14].

Исследования, выполненные с применением современных молекулярно-генетических методов, подтвердили возможность персистенции C.burnetii у лабораторных мышей, получавших вакцину «М-44». Так с помощью ПЦР было установлено, что ДНК этого возбудителя выявляется в селезёнке, почках и сердце этих животных даже через 214 дней (срок наблюдения) после инокуляции им вакцины [15, 16]. Кроме того, была показана реальная возможность передачи C.burnetii мышиному потомству [17].

Всё возрастающие требования к безопасности профилактических препаратов, перечисленные выше негативные свойства вакцины «М-44» в сочетании с общими для всех живых вакцин недостатками (опасность контаминации вирусами, наличие тканевых примесей, сложность стандартизации препаратов и др.), а также рекомендации ВОЗ отказаться от использования живых вакцин побуждает исследователей из разных стран разрабатывать инактивированные вакцины из C.burnetii 1-й фазы, протективная активность которых значительно выше, чем у C.burnetii 2-й фазы.

Практически все исследователи отмечали высокую реактогенность инактивированных корпускулярных вакцин, приготовленных из антигена C.burnetii 1-й фазы (АГ). Так установлено, что иммунизация ими может вызывать некрозы в печени, спленомегалию и гептомегалию [18,19], подавление нормальной реакции лимфоцитов на митогены [20], повышение чувствительности к токсическому действию других микроорганизмов [21].

Для преодоления перечисленных недостатков АГ были предложены, так называемые, субъединичные вакцины. В отличие от АГ они вызывают защиту против определённых антигенных субстанций возбудителя, содержат меньше балласта и легче поддаются контролю и стандартизации.

Наиболее полно изучены и описаны свойства двух типов таких вакцин. Одна из них является растворимым антигеном C.burnetii 1-й фазы, полученным путём обработки возбудителя Ку-лихорадки трихлоруксусной кислотой (АГ-ТХУ) и представляющий собой липополисахаридно-белковый комплекс [22]. Другая – осадок C.burnetii 1-й фазы после их обработки хлороформом и метанолом (АГ-ХМ) с целью удаления из бактериальной клетки фосфолипида [18, 23]. Введение этих препаратов лабораторным животным оказывает значительно меньшее токсическое действие на их организм, чем аналогичные дозы АГ. Существенным недостатком применения АГ-ТХУ и АГ-ХМ в качестве вакцинных препаратов является их, сравнительно с АГ, невысокая протективная активность, поэтому для получения удовлетворительной защиты от вирулентных штаммов возбудителя Ку-лихорадки необходима неоднократная вакцинация этими антигенами.

В конце 80-х годов прошлого века ЦВМУ МО СССР поставила весьма сложную и ответственную задачу - разработать инактивированную вакцину, обеспечивающую эффективную защиту после одноразовой иммунизации. Ее выполнение было поручено коллективу лаборатории экологии риккетсий НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Почётного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, которую возглавляет известный во всем мире риккетсиолог академик РАМН Ирина Владимировна Тарасевич. Вместе с ней в создании новой вакцины принимали участие В.А. Яблонская, С.Ф. Фаталиева и другие сотрудники лаборатории. Учитывая большой опыт экспериментальной работы с C.burnetii сотрудников Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, совместные многолетние и плодотворные научные исследования по коксиеллёзной проблеме, а также отсутствие в Институте им. Н.Ф. Гамалеи режимных условий для работы с данным опасным патогеном, Ирина Владимировна привлекла к участию в этом проекте сотрудников лаборатории природно-очаговых инфекций Ленинградского института (так тогда называлась лаборатория зооантропонозных инфекций). В те годы этой лабораторией руководил А.Б. Дайтер.

Создание принципиально нового препарата для профилактики Ку-лихорадки обосновывало необходимость проведения многоплановых исследований, направленных на изучение биологических свойств различных штаммов C.burnetii и отбора из них наиболее перспективных для создания вакцин, разработку количественных методов стандартизации коксиеллёзных препаратов, уточнение механизмов, с помощью которых реализуются защитные функции иммунизированного млекопитающего, и выяснение роли отдельных субстанций коксиелл в индукции различных звеньев иммунной системы, а также отбор адекватных критериев и методов для суждения об эффективности новых препаратов. Результаты этой работы нашли отражение в нашей диссертационной работе [24], научным консультантом которой была И.В. Тарасевич.

В ходе этих исследований были получены новые знания о гетерогенности различных штаммов возбудителя Ку-лихорадки, которые свидетельствуют об ошибочности доминировавшего в недавнем прошлом представления о том, что штаммовые различия коксиелл обусловлены лишь их фазовой изменчивостью. Так, впервые примененный в отношении отечественных штаммов С.burnetii рестрикционный анализ хромосомной ДНК позволил установить, что изоляты, выделенные на территории России, представляют генетически однородную группу, отличающуюся от западно-европейских штаммов [25]. Кроме того, показано, что коксиеллёзные штаммы различаются по способности индуцировать у лабораторных животных иммунный ответ. Так при сравнении отечественных и зарубежных референс-штаммов коксиелл, находящихся в 1-м фазовом состоянии, было установлено, что коксиеллы штамма «Вологда» обладают наиболее выраженными антителоиндуцирующими свойствами. Предложение использовать коксиеллёзный штамм «Вологда» для получения сыворотки с высоким содержанием соответствующих антител, защищено авторским свидетельством на изобретение [26].

Для оценки протективных свойств коксиеллёзных изолятов их сравнивали со штаммом коксиелл «Nine-Mile», который широко применяется для приготовления инактивированных вакцин за рубежом [27, 28]. С целью объективной оценки полученных результатов в качестве вирулентной культуры, используемой для заражения вакцинированных лабораторных животных, применяли коксиеллы штамма «Henzerling» (1-я фаза), гетерологичного по отношению к испытуемым штаммам. Оценку иммунитета у вакцинированных животных проводили на основании наблюдения за температурной и местной реакцией в течение 15 суток после заражения, а также результатов определения коксиелл в селезёнках морских свинок. Установлено, что иммунизация морских свинок корпускулярным антигеном, приготовленным из коксиелл штамма «Луга-1», создаёт более эффективную защиту животных по сравнению с антигенами, полученными из других испытанных штаммов, в том числе, «Nine-Mile». Решением Комитета РФ по патентам и товарным знакам штамм «Луга-1» признан в качестве вакцинного [29].

С целью стандартизации вакцины нами были разработаны два препарата: иммуноферментная тест-система для определения тканевых культуральных примесей в риккетсиальных препаратах и иммуноферментная тест-система для выявления коксиелл. Способ получения первой из них защищён авторским свидетельством на изобретение [30]. Испытание с помощью этой тест-системы нескольких серий коммерческих антигенов (из риккетсий Провачека, Сибирикус и C.burnetii) позволило установить, что содержание в них тканевых примесей варьируется в пределах 0,018 – 0,44 мг/мл. Количество примесных компонентов в коммерческой вакцине против Ку-лихорадки было существенно выше, что, вероятно, связано с трудностями очистки не инактивированных C.burnetii. Применение иммуноферментного анализа (ИФА) позволило добиться полного (5 – 1,89 х 106 коксиелл/мл [32]. При сравнении методов обнаружения корпускулярного антигена коксиелл (1-я фаза) было показано, что чувствительность ИФА превышает чувствительность метода флуоресцирующих антител (МФА), РНГА и реакции связывания комплемента (РСК) в 15, 40 и 1600 раз, соответственно. На производство препаратов для выявления C.burnetii в РНГА и ИФА составлены и утверждены технические документации; препараты рекомендованы в практику здравоохранения. Сочетанное применение разработанных иммуноферментных тест-систем позволяет контролировать содержание специфических и примесных компонентов в процессе производства коксиеллёзной вакцины с целью повышения её качества.

Конструирование инактивированной вакцины обусловило необходимость изучения повреждающего действия высокоочищенных препаратов, полученных из С. burnetii (штамм «Луга-1») на организм млекопитающих.

Результаты морфологических исследований органов мышей и морских свинок, инокулированных АГ, АГ-ХМ, АГ-ТХУ свидетельствуют, что все испытанные препараты малореактогенны. После их введения наблюдали небольшую местную и генерализованную реакции, наиболее выраженные у мышей, иммунизированных АГ. Этот препарат вызывает наибольшие иммунно-морфологические изменения, характерные для развития клеточного иммунитета: стимуляцию Т-лимфоцитов, бласттрансформацию, развитие лимфоидно-макрофагальных гранулём. Показано, что причиной развития некрозов в печени при введении АГ является тромбоз ветвей воротной вены, а в основе развития спленомегалии у животных, иммунизированных АГ, лежит гиперплазия ретикулярных клеток и макрофагов красной пульпы и Т-зависимых зон белой пульпы, а в основе развития гепатомегалии – выраженная очаговая лимфоидно-макрофагальная инфильтрация вокруг ветвей воротной вены и центральных вен [33, 34].

Как известно, решающая роль в формировании специфической резистентности против С.burnetii отводится клеточному иммунному ответу.

Стремление количественно in vitro оценить сенсибилизацию лимфоидных клеток при Ку-лихорадке побудило нас адаптировать применительно к этой инфекции реакцию торможения прилипания лейкоцитов (РТПЛ). Эта реакция, сравнительно широко используемая в экспериментальной и клинической онкологии, пока нашла лишь ограниченное применение в инфектологии. Результаты, полученные при исследовании спленоцитов мышей (иммунизированных гомологичными и гетерологичными антигенами) и лейкоцитов людей (здоровых доноров, больных раком лёгких, повторным сыпным тифом и коксиеллёзом), свидетельствуют о высокой специфичности и чувствительности этого иммунологического теста [35, 36], что явилось основанием его использования для сравнения способности коксиеллёзных препаратов специфически сенсибилизировать лимфоциты лабораторных животных. Установлено, что, начиная с пятых суток после иммунизации АГ мышей С3НА, выявляется сенсибилизация лимфоцитов. У мышей, получавших АГ-ТХУ и АГ-ХМ, положительную РТПЛ регистрировали на 7-е сутки. Максимальные уровни сенсибилизации лимфоцитов у мышей, иммунизированных коксиеллёзными препаратами, наблюдали на 11-15 сутки после их введения; они достигали 48±6%, 42±7% и 35±9% у животных, получавших АГ, АГ-ХМ и АГ-ТХУ, соответственно. РТПЛ оставалась положительной, по крайней мере, в течение 4 недель после введения мышам коксиеллёзных препаратов, в то время как у контрольных животных, иммунизированных R.prowazekii, РТПЛ была отрицательной в течение всего срока наблюдения [37]. Результаты РТПЛ были подтверждены данными реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), они в значительной степени совпадали с показателями реакции подавления миграции макрофагов.

Показана прямая зависимость между иммуногенными (по данным РТПЛ и РГЗТ) и протективными свойствами коксиеллёзных препаратов. Установлено, что защитить лабораторных животных от последующего заражения вирулентной культурой коксиелл возможно при введении лишь достаточно больших доз коксиеллёзных препаратов, потенциально способных вызвать неблагоприятные поствакцинальные реакции. При этом обладающий наибольшей протективностью препарат АГ обусловливает наибольшее повреждающее действие на макроорганизм.

Проведение специальных исследований на лабораторных животных позволило определить оптимальные соотношения АГ и АГ-ТХУ, обеспечивающие выраженный протективный эффект в отношении коксиеллёзной инфекции. При этом количество АГ и АГ-ТХУ, введённое морским свинкам было значительно меньше, чем необходимо для достижения такой же степени защиты животных при использовании этих же антигенов в качестве моновакцины. Для получения препарата приготовленный в Институте им. Пастера коксиеллезный корпускулярный антиген подвергали в Институте им. Гамалеи дополнительной очистке (способ защищен авторским свидетельством на изобретение) [38] и извлекли из него с помощью ультразвука растворимую фракцию, близкую по иммуногенным и протективным свойствам к АГ-ТХУ. Двухкомпонентный препарат, состоящий из АГ и растворимой фракции АГ, полученный на основе коксиелл штамма «Луга-1», был назван «комбинированной инактивированной вакциной из C.burnetii 1-й фазы против лихорадки Ку» (КВК). Способ получения этой вакцины защищён патентом на изобретение [39].

Иммуногенность КВК оценивали по способности индуцировать антителообразование и специфически сенсибилизировать лимфоциты у лабораторных животных (Н.К. Токаревич, Н.А. Карцева). Антителообразующую активность определяли у трёх лабораторных серий вакцины на морских свинках массой 340±40 г. Вакцину вводили подкожно в паховую область по 0,5 мл однократно. Животным контрольной группы аналогичным образом вводили плацебо. У иммунизированных животных не было отмечено снижения массы тела. Повышение температуры было зарегистрировано лишь у отдельных животных. Длительность лихорадочного периода не превышала 2-3 суток, при этом максимальные показатели температуры не превышали 40˚С.

При исследовании сывороток контрольных животных в РСК и РНИФ с антигеном C.burnetii 2-й фазы через 29 дней после введения им плацебо антитела не были выявлены. Напротив, при исследовании в эти же сроки 41 сыворотки крови опытных животных антитела к C.burnetii 2-й фазы были выявлены в 39 и 40 пробах с помощью РСК и РНИФ, соответственно. Различия в частоте обнаружения антител и высоте их титров у животных, иммунизированных разными сериями препарата, были не существенными.

Способность КВК вызывать специфическую сенсибилизацию лимфоцитов количественно оценивали с помощью РГЗТ и РТПЛ. Положительная РГЗТ была выявлена у опытных животных (мышей СЗНА массой 17±1 г), начиная с 15 суток после подкожной инокуляции вакцины на протяжении всего срока наблюдения (35 суток). Сенсибилизация лимфоцитов мышей, определяемая с помощью РТПЛ, была зарегистрирована через 7 суток после подкожного введения КВК и также выявлялась в течение всего срока наблюдения (35 суток). Максимальные уровни сенсибилизации были определены на 15-е сутки.

С целью оценки протективности КВК морские свинки, на которых изучена антителообразующая активность трех серий препарата, через 30 дней после подкожной вакцинации были внутрибрюшинно заражены C.burnetii штамма «Henzerling» (10 000 ИД в объёме 1 мл). С помощью стандартных и разработанных нами и защищённых авторским свидетельством на изобретение [40] и патентом на изобретение [41] двух взаимодополняющих методов оценки протективной активности коксиеллёзных вакцин, основанных как на количественном определении C.burnetii в спленоцитах, так и на антимикробном потенциале нейтрофильных гранулоцитов лабораторных животных, было установлено, что все исследуемые серии КВК обладают выраженными протективными свойствами, незначительно различающимися между собой. Так, поражённость спленоцитов C.burnetii у вакцинированных животных в 256-640 раз меньше, чем соответствующий показатель у контрольных морских свинок, а напряжённость иммунитета у опытных животных сохраняется на высоком уровне в течение 6 месяцев (срок наблюдения). Протективность КВК подтверждена специалистами НИИ военной медицины МО РФ (А.Ж. Василенко и О.П. Мисников) в опытах по аэрозольному заражению вакцинированных лабораторных животных. Например, показано, что все морские свинки, заражённые вирулентным штаммом коксиелл «Nine-Mile», через 5 месяцев после вакцинации остались живы, в то же время, гибель среди контрольных (не вакцинированных) животных составила 80%.

Введение КВК мышам вызывает выраженное повышение активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов, играющих важную роль в развитии резистентности при коксиеллёзе. Так, клетки перитонеального экссудата иммунизированных КВК мышей проявляют статистически достоверное увеличение цитотоксической активности в отношении клеток мишеней (Р-815) через 3 – 28 суток после вакцинации. Напротив, при иммунизации мышей коксиеллёзной вакциной производства Института вирусологии Словацкой Академии наук (Братислава), представляющей собой АГ-ТХУ, увеличение неспецифической цитотоксической активности отмечено не было. Кроме того, было показано, что введение двухкомпонентной вакцины обусловливает достоверное повышение кислородзависимой метаболической активности перитонеальных клеток мышей, в то время как АГ-ТХУ практически не влияет на эту активность [42]. Сказанное дополнительно аргументирует целесообразность включения АГ в состав рецептуры вакцины. Наконец, угнетение митогениндуцированной пролиферативной активности спленоцитов после иммунизации АГ-ТХУ вакциной при отсутствии такого эффекта у КВК свидетельствует о большей безвредности разработанного нами препарата.

В НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи были проведены исследования, посвящённые сравнению биохимических характеристик различных серий КВК, определению «острой» и «хронической» токсичности этого препарата, оценки его влияния на гематологические показатели, на центральную нервную систему и детоксицирующую функцию печени. В результате этих исследований было установлено, что различные серии вакцины существенно не различаются по биохимическим характеристикам [43]. Подкожное (в паховую область) введение КВК морским свинкам сопровождалось лишь умеренной местной воспалительной реакцией. Гистологическое исследование головного мозга, сердца, лёгких, печени, селезёнки, лимфатических узлов, надпочечников этих животных не выявило каких-либо патологических изменений. Близкие результаты были получены при исследовании органов и тканей мышей, получавших КВК внутривенно. Однако в этой серии опытов выявлена гиперемия сосудов печени и селезёнки. Прирост массы у вакцинированных мышей через 7 дней после получения КВК практически не отличался от контрольных животных (получавших физиологический раствор) и был выше, чем у другой группы контрольных животных, получавших препарат сравнения - брюшнотифозную химическую вакцину. Полученные данные свидетельствовали о практическом отсутствии «острой» токсичности КВК [44].

Определение «хронической» токсичности КВК также проводили на двух видах животных: морских свинках и белых мышах. С этой целью ежедневно в течение 10 дней морским свинкам подкожно, а мышам внутрибрюшинно, вводили КВК. В качестве контроля в этом опыте были исследованы животные, инокулированные физиологическим раствором и брюшнотифозной вакциной. У мышей, вакцинированных КВК, наблюдали уменьшение массы тела на 18,4%. При вскрытии животных спустя 24 часа и 7 дней после последнего введения КВК макроскопически не было обнаружено каких-либо патологических изменений, за исключением некоторого уменьшения размеров тимуса и увеличения размеров надпочечников, которые являются типичной стрессовой реакцией на введение антигена. У контрольных животных, инокулированных брюшнотифозной вакциной, патологические изменения были более выражены [45].

Кроме того, в опытах на морских свинках и мышах установлено, что гематологические показатели (количество лейкоцитов и эритроцитов, структура лейкоцитарной формулы) у животных, инокулированных КВК, практически не отличалась от аналогичных показателей инокулированных физиологическим раствором контрольных животных на протяжении всего срока наблюдения [46].

Наконец, в опытах на мышах с гексиналовой пробой было показано отсутствие у КВК негативного действия на детоксицирующую функцию печени, а результаты применения двух экспериментальных моделей – судорожных проб с тиосемикарбазидом и коразолом свидетельствовали об отсутствии негативного влияния разработанной вакцины на центральную нервную систему [47].

Данные о высокой иммуногенности, протективности и безвредности КВК, а также полученные в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (М.С. Воробьева, М. А. Горбунов, Н. А. Озерецковский) удовлетворительные результаты контроля трех серий вакцины на соответствия требованиям проекта научной документации на данный препарат, которые были разработанны в Институте им. Гамалеи и Институте им. Пастера, явились основанием для испытания вакцины на ограниченном контингенте. В этих испытаниях (проведенных под руководством А. Ж. Василенко) на добровольной основе приняли участие 40 практически здоровых лиц обоего пола в возрасте от 18 до 45 лет, из которых методом случайного выборочного распределения были сформированы две группы численностью по 20 человек – опытная и контрольная. Испытуемые первой группы были привиты вакциной подкожно-шприцевым методом, лица второй (контрольной) группы тем же методом получали изотонический раствор хлорида натрия в качестве плацебо. К участию в испытании были допущены только лица с отрицательными результатами предварительного серологического обследования на наличие антител к возбудителю Ку-лихорадки. Сыворотки исследовали с помощью РСК и разработанной нами иммуноферментной тест-системы с использованием для сенсибилизации планшетов HCl – гидролизного коксиеллезного антигена 1-й фазы [48] (в институте им. Пастера) и в РНИФ (в институте Военной медицины) в зашифрованном опыте.

Установлено, что у всех волонтёров контрольной группы антитела к коксиеллам не были выявлены ни одним из используемых серологических тестов на протяжении всего периода наблюдения. Напротив, у волонтёров опытной группы антитела были обнаружены в 80%, 55% и 40% с помощью ИФА, РНИФ и РСК, соответственно, при этом 67% проб, положительных в РСК, содержали антитела к коксиеллам 1-й и 2-й фаз [49].

Сыворотки, содержащие антитела по данным РСК, положительно реагировали с коксиеллёзным антигеном и в РНИФ, и в ИФА, а сыворотки, содержащие антитела по данным РНИФ, также положительно реагировали в ИФА.

Также было показано, что КВК обладает слабой местной и умеренной общей реактогенностью и не приводит к ухудшению функционального состояния организма или снижению работоспособности вакцинированных.

Исследование на базе НИИ микробиологии МО РФ (Р.А. Хамитов, А.Б. Предтеченский) трех новых серий КВК, необходимое для проведения Государственных испытаний, подтвердило полученные ранее результаты в НИИЭМ имени Пастера о высокой иммуногенности и протективности препарата. Так было показано, что КВК вызывает образование антител к коксиеллам у 100% иммунизированных животных и обеспечивает устойчивость 80% животных, получивших препарат к заражению вирулентным штаммом C.burnetii (10000 ИД).

Государственные полевые испытания КВК были проведены на базе НИИЦ (МБЗ) ГНИИИВМ МО РФ (В.М.Добрынин, А.В.Степанов). В них участвовало 200 волонтеров, из которых 100 получали вакцину и 100 – плацебо. Вакцину или плацебо вводили подкожно в объеме 0,5 мл. Результаты Государственных испытаний КВК и испытания этого препарата на ограниченной группе людей практически не различались. Так было подтверждено, что вакцина слабореактогенна и безопасна. По данным иммуноферментного анализа (применялась тест-система «COXIELLA BURNETII ELISA IgG»,производства фирмы «Vircell», Испания), у 84% и 81% вакцинированных были обнаружены в сыворотке крови IgG-антитела к C.burnetii 2-й фазы через один месяц и один год, соответственно.

Таким образом, под руководством и при непосредственном участии академика РАМН И. В. Тарасевич была разработана безопасная и высокоэффективная вакцина против Ку-лихорадки. Разноплановые исследования, обеспечившие создание этого инновационного препарата (защищенного 9 авторскими свидетельствами и патентами на изобретение), способствовали решению актуальных задач коксиеллёзной инфекции.

Литература

1. Kasar J. Coxiella burnetii infection. Ann NY Acad Sci 2005; 1063: 105-114.
2. Токаревич Н.К. Проблемы коксиеллёза на рубеже третьего тысячелетия. Актовая речь, С.-Петербург 2001.
3. Тарасевич И.В., Фетисова Н.Ф., Макарова В.А. и другие. Риккетсиозы. Природная очаговость болезней: исследования Института Гамалеи РАМН 2003; 64-98.
4. Tissot-Dupont H., Raoult D., Brougui P. et al. Epidemiologic features and clinical presentation of acute Q fever in hospitalized patients – 323 French cases. Am J Med 1992; 93: 427-434.
5. Raoult D., Tissot-Dupont H., Foucalt C. Q-fever 1985-1998: clinical and epidemiologic features of 1,383 infections. Medicine 2002; 79: 109 -123.
6. Lang G.H. Coxiellosis (Q-fever) in animals. In Q-Fever: The Disease T.J. Marrie Ed, CRC Press. Boca Raton, FL. 1990: 23-48.
7. Schmeer N., Muller P., Langel J. et al. Q fever vaccines for animals. Zentbl. Bakteriol. Microbiol. Hyg. Ser. A 1987; 267:79-88.
8. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. Public Health Assessment of Potential Biological Terrorism Agents. Emerg Infect Dis 2002; 8: 225-230.
9. Kagawa FT, Wehner JH, Mohindra V. Q fever as a biological weapon. Semin Respir Infect 2003; 18: 183-195.
10. Madariaga M.G., Rezal K., Trenholme G.M. et al. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis 2003; 3: 709-721.
11. Гениг В.А. Аттенуированный вариант «М» риккетсий Бернета, как возможная живая вакцина против Ку-лихорадки. Вестник АМН СССР 1960; 2: 46-57.
12. Михайлов В.В., Воробьев А.А., Махлай А.А. и др. Экспериментальное изучение иммуногенных и протективных свойств штамма М-44 Coxiella burnetii и живой энтеральной вакцины против лихорадки Ку. Журн. микробиол. 1996; 1: 38-42.
13. Johnson J.W., Eddy G.A., Pedersen J. Biological properties of M-44 strain of Coxiella burnetii. J. infect. Dis. 1976; 133: 334-338.
14. Johnson J.W., McLeod W.G., Stookey J.L. et al. Lesions in guinea pigs infected with Coxiella burnetii strain M-44. J. Infect. Dis. 1977; 135: 995-998.
15. Tokarevich N.K., Mossienko E.V., Suvorov A.N., Totolian A.A. Detection of Coxiella burnetii in different biological samples by polymerase chain reaction (PCR). American society for rickettsiology - Bartonella as an emerging pathogen group. Big Sky, Montana; 2001: 86.
16. Mossienko E.V., Tokarevich N.K., Suvorov A.N., Totolian A.A. Detection of Coxiella burnetii by PCR in Mice after Administration of Live M-44 Vaccine. Folia Microbiol. 2003: 48; 103-104.
17. Freylikhman O., Tokarevich N.K., Suvorov A.,et al. Coxiella burnetii persistence in three generations of mice after application of live attenuated human vaccine M-44 against Q fever. Annals of the NY Acad of sciences. 2003; 990: 496-499.
18. Williams J.C., Cantrell J.L. Biological and immunological properties of Coxiella burnetii vaccines in C 57BL/10ScN endotoxin-nonresponder mice. Inf. and Immun. 1982; 35, 3: 1091-1102.
19. Kasar J., Schramek S., Zajacova S. Индукция спленогамии у мышей убитыми клетками Coxiella burnetii. Acta virol. 1983; 27: 65-70.
20. Damrow T.A., Williams I.C., Waag D.M. Suppression of in vitro lymphocyte proliferation in C 57BL/10ScN mice vaccinated with phase I Coxiella burnetii. Inf. and Immun. 1985; 47: 149-156.
21. Kasar J., Schramek S. Сенсибилизация мышей к токсину риккетсий введением Coxiella burnetii. Acta virol. 1984; 28: 309-316.
22. Schramek S. Rickettsial endotoxic lipopolysaccharides. Rickettsia and Rickettsial diseases (J. Kasar, R. Ormsee, I. Tarasevich, eds.), Bratislava; 1978: 79-87.
23. Lukacova M., Schramek S. Kinetics of the extraction of phospholipids from Coxiella burnetii. Acta virol. 1988; 32: 85-88.
24. Токаревич Н.К. Биологические аспекты взаимоотношения C.burnetii и организма млекопитающего как основа совершенствования диагностики и специфической профилактики Ку-лихорадки. Автореф. дисс. на соиск. уч. ст.докт. мед. наук. СПб; 1997.
25. Демкин В.В., Токаревич Н.К., Редкина Е.Б. и др. Характеристика полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК штаммов C. burnetii, выделенных на территории России. Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 1993; 6: 13-16.
26. Токаревич Н.К., Дайтер А.Б., Рыбакова Н.А. Штамм Coxiella burnetii, используемый для получения гипериммунных сывороток. Авт свид. на изобретение № 1724683 от 8.12.1991 г.
27. Behymer D.E., Biberstein E.L., Riemann H.P. et al. Q-fever (Coxiella burnetii) investigation in dairy cattle: Challenge of immunity after vaccination. Am. J. Veter. Res. 1976; 6 (37): 631-634.
28. Lisak V. Опыт вакцинации сельскохозяйственных животных как мера профилактики лихорадки Ку у людей. Риккетсиозы: Труды института им. Пастера, Л. 1989; 66: 143-152.
29. Токаревич Н.К., Дайтер А.Б., Амосенкова Н.И. и др. Штамм коксиелл, используемый для получения инактивированной вакцины против Ку-лихорадки. Патент на изобретение № 2026342 от 9.01.1995 г.
30. Токаревич Н.К., Горбачев Е.Н. Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах. Авт свид. на изобретение № 1801494 от 9.10.1992 г.
31. Токаревич Н.К., Дайтер А.Б., Носков Ф.С., Шичкина В.П. Способ получения Ку-риккетсиального эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума. Авт. свид. на изобретение №1195501 от 1.08.1985г.
32. Горбачев Е.Н., Токаревич Н.К., Вербов В.Н. и др. Иммуноферментный метод индикации антигенов коксиелл Бернета. Журн. микробиол. 1991; 2: 56-60.
33. Полоцкий Ю.Е., Дайтер А.Б., Ефремов В.Е. и др. Реакция хозяина на введение различных компонентов Coxiella burnetii. Журн. микробиол. 1991; 9: 70-75.
34. Токаревич Н.К., Просверницин С.А., Карцева Н.А. и др. Морфологические изменения в организме морских свинок в ответ на введение различных антигенов Coxiella burnetii. Журн. микробиол. 1994; 5: 53-55.
35. Токаревич Н.К. Реакция торможения прилипания лейкоцитов для определения сенсибилизированности организма к риккетсиям (принцип и способ). Вопросы риккетсиологии: Матер. Всесоюз. конф. «эпидемиология диагностика и профилактика риккетсиозов». М. 1985:65-66.
36. Крыленков В.А., Малыгин А.М., Токаревич Н.К. и др. Количественная оценка сенсибилизации лимфоидных клеток к нормальным тканевым и бактериальным антигенам. Вестник хирургии 1987; 12: 54-56.
37. Токаревич Н.К. Применение реакции торможения прилипания лейкоцитов (РТПЛ) для оценки сенсибилизированности животных, иммунизированных различными антигенами C.burnetii. Актуальные проблемы инфекционной патологии. Ч.2., Санкт-Петербург, 1993: 63.
39. Тарасевич И.В., Яблонская В.А., Фаталиева С.Ф. и др. Способ получения вакцины против лихорадки Ку. Патент на изобретение № 2094057 от 27.10.1997 г.
40. Токаревич Н.К. Способ определения протективной активности Ку-риккетсиальных вакцин. Авт свид. на изобретение № 1253011 от 22.04.1986 г.
41. Кузина В.А., Токаревич Н.К., Мазинг Ю.А. Способ оценки эффективности иммунизации при Ку-риккетсиозе. Патент на изобретение № 2039982 от 20.07.1995 г.
42. Сидоренко С.В., Мацела А., Токаревич Н.К. и др. Динамика метаболической и функциональной активности иммунокомпетентных клеток мышей после иммунизации различными вакцинами против Ку-лихорадки. Антибиотики и химиотерапия 1993; 38 (12): 13-17.
43. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение I. Биохимическая характеристика вакцины. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 114-118.
44. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение III. Определение «острой» токсичности вакцины. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 123-127.
45. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение IV. Определение «хронической» токсичности вакцины. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 127-130.
46. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение V. Определение влияния комбинированной инактивированной вакцины на гематологические показатели. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 131-133.
47. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение VI. Определение влияния вакцины на центральную нервную систему и детоксицирующую функцию печени. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 134-138.
48. Горбачев Е.Н., Токаревич Н.К. Изучение иммунного ответа у больных и переболевших Ку-лихорадкой при использовании иммуноферментного анализа. Журн. микробиол. 1995; 3: 99-102.
49. Krutitskaya L., Tokarevich N., Zhebrun A. et al. Autoimmune component in individuals during immune response to inactivated combined vaccine against Q-fever. Acta virol. 1996; 40: 173-177.

Академик РАМН И.В. Тарасевич – руководитель разработки

комбинированной инактивированной вакцины против Ку-лихорадки

ФГУН Санкт-Петербургский НИИЭМ имени Пастера

Роспотребнадзора

Ку-лихорадка (коксиеллез) – широко распространенная в мире [1], в том числе, и в России [2] зооантропонозная инфекция. Она выявлена более чем в 50 субъектах российской Федерации [3]. Возбудитель Ку-лихорадки - Сoxiella burnetii – облигатная внутриклеточная бактерия, способная к длительной персистенции в клетках системы мононуклеарных фагоцитов, что может приводить к хроническому течению болезни. Хроническая форма Ку-лихорадки достаточно частый исход этого заболевания, например, на юге Франции, от 5 до 8% всех случаев эндокардитов обусловлены С. burnetii [4]. Такое развитие болезни у людей нередко приводит к инвалидизации, а в значительном количестве случаев и к летальному исходу [5].

Кроме того, коксиеллёз наносит существенный экономический ущерб сельскому хозяйству, поскольку у заражённых коксиеллами овец и коз часто происходят аборты [6], а у коров заболевание вызывает бесплодие или снижение веса новорожденных животных [7]. Наконец, такие биологические свойства C.burnetii, как высокая патогенность для людей и устойчивость возбудителя к воздействию внешней среды позволяет рассматривать этот патоген в качестве потенциального агента для биологического терроризма [8, 9, 10].

Сказанное аргументирует необходимость профилактики коксиеллёзной инфекции, в том числе, с помощью разработки улучшенных вакцин против этой опасной болезни. Единственным профилактическим препаратом в отношении коксиеллёза, разрешённым к применению в России до настоящего времени, является живая вакцина, полученная на основе аттенуированного варианта «М-44» C.burnetii штамма Грита [11]. Создание этого препарата явилось важным этапом в развитии риккетсиологии в середине прошлого века, так как существенно расширило наши представления об изменчивости биологических свойств C.burnetii; его применение обеспечило надежную защиту вакцинированных. В дальнейшем на основе этого препарата была предпринята попытка разработки живой вакцины для энтерального применения [12].

Однако ряд сообщений свидетельствует о длительной персистенции C.burnetii у лабораторных животных, получавших вакцину «М-44» и об активации инфекции под воздействием метилпреднизолона и циклофосфамида. Более того, у значительной части морских свинок применение этой вакцины обусловило выраженные патологические изменения в селезёнке, печени и миокарде [13,14].

Исследования, выполненные с применением современных молекулярно-генетических методов, подтвердили возможность персистенции C.burnetii у лабораторных мышей, получавших вакцину «М-44». Так с помощью ПЦР было установлено, что ДНК этого возбудителя выявляется в селезёнке, почках и сердце этих животных даже через 214 дней (срок наблюдения) после инокуляции им вакцины [15, 16]. Кроме того, была показана реальная возможность передачи C.burnetii мышиному потомству [17].

Всё возрастающие требования к безопасности профилактических препаратов, перечисленные выше негативные свойства вакцины «М-44» в сочетании с общими для всех живых вакцин недостатками (опасность контаминации вирусами, наличие тканевых примесей, сложность стандартизации препаратов и др.), а также рекомендации ВОЗ отказаться от использования живых вакцин побуждает исследователей из разных стран разрабатывать инактивированные вакцины из C.burnetii 1-й фазы, протективная активность которых значительно выше, чем у C.burnetii 2-й фазы.

Практически все исследователи отмечали высокую реактогенность инактивированных корпускулярных вакцин, приготовленных из антигена C.burnetii 1-й фазы (АГ). Так установлено, что иммунизация ими может вызывать некрозы в печени, спленомегалию и гептомегалию [18,19], подавление нормальной реакции лимфоцитов на митогены [20], повышение чувствительности к токсическому действию других микроорганизмов [21].

Для преодоления перечисленных недостатков АГ были предложены, так называемые, субъединичные вакцины. В отличие от АГ они вызывают защиту против определённых антигенных субстанций возбудителя, содержат меньше балласта и легче поддаются контролю и стандартизации.

Наиболее полно изучены и описаны свойства двух типов таких вакцин. Одна из них является растворимым антигеном C.burnetii 1-й фазы, полученным путём обработки возбудителя Ку-лихорадки трихлоруксусной кислотой (АГ-ТХУ) и представляющий собой липополисахаридно-белковый комплекс [22]. Другая – осадок C.burnetii 1-й фазы после их обработки хлороформом и метанолом (АГ-ХМ) с целью удаления из бактериальной клетки фосфолипида [18, 23]. Введение этих препаратов лабораторным животным оказывает значительно меньшее токсическое действие на их организм, чем аналогичные дозы АГ. Существенным недостатком применения АГ-ТХУ и АГ-ХМ в качестве вакцинных препаратов является их, сравнительно с АГ, невысокая протективная активность, поэтому для получения удовлетворительной защиты от вирулентных штаммов возбудителя Ку-лихорадки необходима неоднократная вакцинация этими антигенами.

В конце 80-х годов прошлого века ЦВМУ МО СССР поставила весьма сложную и ответственную задачу - разработать инактивированную вакцину, обеспечивающую эффективную защиту после одноразовой иммунизации. Ее выполнение было поручено коллективу лаборатории экологии риккетсий НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Почётного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, которую возглавляет известный во всем мире риккетсиолог академик РАМН Ирина Владимировна Тарасевич. Вместе с ней в создании новой вакцины принимали участие В.А. Яблонская, С.Ф. Фаталиева и другие сотрудники лаборатории. Учитывая большой опыт экспериментальной работы с C.burnetii сотрудников Ленинградского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, совместные многолетние и плодотворные научные исследования по коксиеллёзной проблеме, а также отсутствие в Институте им. Н.Ф. Гамалеи режимных условий для работы с данным опасным патогеном, Ирина Владимировна привлекла к участию в этом проекте сотрудников лаборатории природно-очаговых инфекций Ленинградского института (так тогда называлась лаборатория зооантропонозных инфекций). В те годы этой лабораторией руководил А.Б. Дайтер.

Создание принципиально нового препарата для профилактики Ку-лихорадки обосновывало необходимость проведения многоплановых исследований, направленных на изучение биологических свойств различных штаммов C.burnetii и отбора из них наиболее перспективных для создания вакцин, разработку количественных методов стандартизации коксиеллёзных препаратов, уточнение механизмов, с помощью которых реализуются защитные функции иммунизированного млекопитающего, и выяснение роли отдельных субстанций коксиелл в индукции различных звеньев иммунной системы, а также отбор адекватных критериев и методов для суждения об эффективности новых препаратов. Результаты этой работы нашли отражение в нашей диссертационной работе [24], научным консультантом которой была И.В. Тарасевич.

В ходе этих исследований были получены новые знания о гетерогенности различных штаммов возбудителя Ку-лихорадки, которые свидетельствуют об ошибочности доминировавшего в недавнем прошлом представления о том, что штаммовые различия коксиелл обусловлены лишь их фазовой изменчивостью. Так, впервые примененный в отношении отечественных штаммов С.burnetii рестрикционный анализ хромосомной ДНК позволил установить, что изоляты, выделенные на территории России, представляют генетически однородную группу, отличающуюся от западно-европейских штаммов [25]. Кроме того, показано, что коксиеллёзные штаммы различаются по способности индуцировать у лабораторных животных иммунный ответ. Так при сравнении отечественных и зарубежных референс-штаммов коксиелл, находящихся в 1-м фазовом состоянии, было установлено, что коксиеллы штамма «Вологда» обладают наиболее выраженными антителоиндуцирующими свойствами. Предложение использовать коксиеллёзный штамм «Вологда» для получения сыворотки с высоким содержанием соответствующих антител, защищено авторским свидетельством на изобретение [26].

Для оценки протективных свойств коксиеллёзных изолятов их сравнивали со штаммом коксиелл «Nine-Mile», который широко применяется для приготовления инактивированных вакцин за рубежом [27, 28]. С целью объективной оценки полученных результатов в качестве вирулентной культуры, используемой для заражения вакцинированных лабораторных животных, применяли коксиеллы штамма «Henzerling» (1-я фаза), гетерологичного по отношению к испытуемым штаммам. Оценку иммунитета у вакцинированных животных проводили на основании наблюдения за температурной и местной реакцией в течение 15 суток после заражения, а также результатов определения коксиелл в селезёнках морских свинок. Установлено, что иммунизация морских свинок корпускулярным антигеном, приготовленным из коксиелл штамма «Луга-1», создаёт более эффективную защиту животных по сравнению с антигенами, полученными из других испытанных штаммов, в том числе, «Nine-Mile». Решением Комитета РФ по патентам и товарным знакам штамм «Луга-1» признан в качестве вакцинного [29].

С целью стандартизации вакцины нами были разработаны два препарата: иммуноферментная тест-система для определения тканевых культуральных примесей в риккетсиальных препаратах и иммуноферментная тест-система для выявления коксиелл. Способ получения первой из них защищён авторским свидетельством на изобретение [30]. Испытание с помощью этой тест-системы нескольких серий коммерческих антигенов (из риккетсий Провачека, Сибирикус и C.burnetii) позволило установить, что содержание в них тканевых примесей варьируется в пределах 0,018 – 0,44 мг/мл. Количество примесных компонентов в коммерческой вакцине против Ку-лихорадки было существенно выше, что, вероятно, связано с трудностями очистки не инактивированных C.burnetii. Применение иммуноферментного анализа (ИФА) позволило добиться полного (5 – 1,89 х 106 коксиелл/мл [32]. При сравнении методов обнаружения корпускулярного антигена коксиелл (1-я фаза) было показано, что чувствительность ИФА превышает чувствительность метода флуоресцирующих антител (МФА), РНГА и реакции связывания комплемента (РСК) в 15, 40 и 1600 раз, соответственно. На производство препаратов для выявления C.burnetii в РНГА и ИФА составлены и утверждены технические документации; препараты рекомендованы в практику здравоохранения. Сочетанное применение разработанных иммуноферментных тест-систем позволяет контролировать содержание специфических и примесных компонентов в процессе производства коксиеллёзной вакцины с целью повышения её качества.

Конструирование инактивированной вакцины обусловило необходимость изучения повреждающего действия высокоочищенных препаратов, полученных из С. burnetii (штамм «Луга-1») на организм млекопитающих.

Результаты морфологических исследований органов мышей и морских свинок, инокулированных АГ, АГ-ХМ, АГ-ТХУ свидетельствуют, что все испытанные препараты малореактогенны. После их введения наблюдали небольшую местную и генерализованную реакции, наиболее выраженные у мышей, иммунизированных АГ. Этот препарат вызывает наибольшие иммунно-морфологические изменения, характерные для развития клеточного иммунитета: стимуляцию Т-лимфоцитов, бласттрансформацию, развитие лимфоидно-макрофагальных гранулём. Показано, что причиной развития некрозов в печени при введении АГ является тромбоз ветвей воротной вены, а в основе развития спленомегалии у животных, иммунизированных АГ, лежит гиперплазия ретикулярных клеток и макрофагов красной пульпы и Т-зависимых зон белой пульпы, а в основе развития гепатомегалии – выраженная очаговая лимфоидно-макрофагальная инфильтрация вокруг ветвей воротной вены и центральных вен [33, 34].

Как известно, решающая роль в формировании специфической резистентности против С.burnetii отводится клеточному иммунному ответу.

Стремление количественно in vitro оценить сенсибилизацию лимфоидных клеток при Ку-лихорадке побудило нас адаптировать применительно к этой инфекции реакцию торможения прилипания лейкоцитов (РТПЛ). Эта реакция, сравнительно широко используемая в экспериментальной и клинической онкологии, пока нашла лишь ограниченное применение в инфектологии. Результаты, полученные при исследовании спленоцитов мышей (иммунизированных гомологичными и гетерологичными антигенами) и лейкоцитов людей (здоровых доноров, больных раком лёгких, повторным сыпным тифом и коксиеллёзом), свидетельствуют о высокой специфичности и чувствительности этого иммунологического теста [35, 36], что явилось основанием его использования для сравнения способности коксиеллёзных препаратов специфически сенсибилизировать лимфоциты лабораторных животных. Установлено, что, начиная с пятых суток после иммунизации АГ мышей С3НА, выявляется сенсибилизация лимфоцитов. У мышей, получавших АГ-ТХУ и АГ-ХМ, положительную РТПЛ регистрировали на 7-е сутки. Максимальные уровни сенсибилизации лимфоцитов у мышей, иммунизированных коксиеллёзными препаратами, наблюдали на 11-15 сутки после их введения; они достигали 48±6%, 42±7% и 35±9% у животных, получавших АГ, АГ-ХМ и АГ-ТХУ, соответственно. РТПЛ оставалась положительной, по крайней мере, в течение 4 недель после введения мышам коксиеллёзных препаратов, в то время как у контрольных животных, иммунизированных R.prowazekii, РТПЛ была отрицательной в течение всего срока наблюдения [37]. Результаты РТПЛ были подтверждены данными реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), они в значительной степени совпадали с показателями реакции подавления миграции макрофагов.

Показана прямая зависимость между иммуногенными (по данным РТПЛ и РГЗТ) и протективными свойствами коксиеллёзных препаратов. Установлено, что защитить лабораторных животных от последующего заражения вирулентной культурой коксиелл возможно при введении лишь достаточно больших доз коксиеллёзных препаратов, потенциально способных вызвать неблагоприятные поствакцинальные реакции. При этом обладающий наибольшей протективностью препарат АГ обусловливает наибольшее повреждающее действие на макроорганизм.

Проведение специальных исследований на лабораторных животных позволило определить оптимальные соотношения АГ и АГ-ТХУ, обеспечивающие выраженный протективный эффект в отношении коксиеллёзной инфекции. При этом количество АГ и АГ-ТХУ, введённое морским свинкам было значительно меньше, чем необходимо для достижения такой же степени защиты животных при использовании этих же антигенов в качестве моновакцины. Для получения препарата приготовленный в Институте им. Пастера коксиеллезный корпускулярный антиген подвергали в Институте им. Гамалеи дополнительной очистке (способ защищен авторским свидетельством на изобретение) [38] и извлекли из него с помощью ультразвука растворимую фракцию, близкую по иммуногенным и протективным свойствам к АГ-ТХУ. Двухкомпонентный препарат, состоящий из АГ и растворимой фракции АГ, полученный на основе коксиелл штамма «Луга-1», был назван «комбинированной инактивированной вакциной из C.burnetii 1-й фазы против лихорадки Ку» (КВК). Способ получения этой вакцины защищён патентом на изобретение [39].

Иммуногенность КВК оценивали по способности индуцировать антителообразование и специфически сенсибилизировать лимфоциты у лабораторных животных (Н.К. Токаревич, Н.А. Карцева). Антителообразующую активность определяли у трёх лабораторных серий вакцины на морских свинках массой 340±40 г. Вакцину вводили подкожно в паховую область по 0,5 мл однократно. Животным контрольной группы аналогичным образом вводили плацебо. У иммунизированных животных не было отмечено снижения массы тела. Повышение температуры было зарегистрировано лишь у отдельных животных. Длительность лихорадочного периода не превышала 2-3 суток, при этом максимальные показатели температуры не превышали 40˚С.

При исследовании сывороток контрольных животных в РСК и РНИФ с антигеном C.burnetii 2-й фазы через 29 дней после введения им плацебо антитела не были выявлены. Напротив, при исследовании в эти же сроки 41 сыворотки крови опытных животных антитела к C.burnetii 2-й фазы были выявлены в 39 и 40 пробах с помощью РСК и РНИФ, соответственно. Различия в частоте обнаружения антител и высоте их титров у животных, иммунизированных разными сериями препарата, были не существенными.

Способность КВК вызывать специфическую сенсибилизацию лимфоцитов количественно оценивали с помощью РГЗТ и РТПЛ. Положительная РГЗТ была выявлена у опытных животных (мышей СЗНА массой 17±1 г), начиная с 15 суток после подкожной инокуляции вакцины на протяжении всего срока наблюдения (35 суток). Сенсибилизация лимфоцитов мышей, определяемая с помощью РТПЛ, была зарегистрирована через 7 суток после подкожного введения КВК и также выявлялась в течение всего срока наблюдения (35 суток). Максимальные уровни сенсибилизации были определены на 15-е сутки.

С целью оценки протективности КВК морские свинки, на которых изучена антителообразующая активность трех серий препарата, через 30 дней после подкожной вакцинации были внутрибрюшинно заражены C.burnetii штамма «Henzerling» (10 000 ИД в объёме 1 мл). С помощью стандартных и разработанных нами и защищённых авторским свидетельством на изобретение [40] и патентом на изобретение [41] двух взаимодополняющих методов оценки протективной активности коксиеллёзных вакцин, основанных как на количественном определении C.burnetii в спленоцитах, так и на антимикробном потенциале нейтрофильных гранулоцитов лабораторных животных, было установлено, что все исследуемые серии КВК обладают выраженными протективными свойствами, незначительно различающимися между собой. Так, поражённость спленоцитов C.burnetii у вакцинированных животных в 256-640 раз меньше, чем соответствующий показатель у контрольных морских свинок, а напряжённость иммунитета у опытных животных сохраняется на высоком уровне в течение 6 месяцев (срок наблюдения). Протективность КВК подтверждена специалистами НИИ военной медицины МО РФ (А.Ж. Василенко и О.П. Мисников) в опытах по аэрозольному заражению вакцинированных лабораторных животных. Например, показано, что все морские свинки, заражённые вирулентным штаммом коксиелл «Nine-Mile», через 5 месяцев после вакцинации остались живы, в то же время, гибель среди контрольных (не вакцинированных) животных составила 80%.

Введение КВК мышам вызывает выраженное повышение активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов, играющих важную роль в развитии резистентности при коксиеллёзе. Так, клетки перитонеального экссудата иммунизированных КВК мышей проявляют статистически достоверное увеличение цитотоксической активности в отношении клеток мишеней (Р-815) через 3 – 28 суток после вакцинации. Напротив, при иммунизации мышей коксиеллёзной вакциной производства Института вирусологии Словацкой Академии наук (Братислава), представляющей собой АГ-ТХУ, увеличение неспецифической цитотоксической активности отмечено не было. Кроме того, было показано, что введение двухкомпонентной вакцины обусловливает достоверное повышение кислородзависимой метаболической активности перитонеальных клеток мышей, в то время как АГ-ТХУ практически не влияет на эту активность [42]. Сказанное дополнительно аргументирует целесообразность включения АГ в состав рецептуры вакцины. Наконец, угнетение митогениндуцированной пролиферативной активности спленоцитов после иммунизации АГ-ТХУ вакциной при отсутствии такого эффекта у КВК свидетельствует о большей безвредности разработанного нами препарата.

В НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи были проведены исследования, посвящённые сравнению биохимических характеристик различных серий КВК, определению «острой» и «хронической» токсичности этого препарата, оценки его влияния на гематологические показатели, на центральную нервную систему и детоксицирующую функцию печени. В результате этих исследований было установлено, что различные серии вакцины существенно не различаются по биохимическим характеристикам [43]. Подкожное (в паховую область) введение КВК морским свинкам сопровождалось лишь умеренной местной воспалительной реакцией. Гистологическое исследование головного мозга, сердца, лёгких, печени, селезёнки, лимфатических узлов, надпочечников этих животных не выявило каких-либо патологических изменений. Близкие результаты были получены при исследовании органов и тканей мышей, получавших КВК внутривенно. Однако в этой серии опытов выявлена гиперемия сосудов печени и селезёнки. Прирост массы у вакцинированных мышей через 7 дней после получения КВК практически не отличался от контрольных животных (получавших физиологический раствор) и был выше, чем у другой группы контрольных животных, получавших препарат сравнения - брюшнотифозную химическую вакцину. Полученные данные свидетельствовали о практическом отсутствии «острой» токсичности КВК [44].

Определение «хронической» токсичности КВК также проводили на двух видах животных: морских свинках и белых мышах. С этой целью ежедневно в течение 10 дней морским свинкам подкожно, а мышам внутрибрюшинно, вводили КВК. В качестве контроля в этом опыте были исследованы животные, инокулированные физиологическим раствором и брюшнотифозной вакциной. У мышей, вакцинированных КВК, наблюдали уменьшение массы тела на 18,4%. При вскрытии животных спустя 24 часа и 7 дней после последнего введения КВК макроскопически не было обнаружено каких-либо патологических изменений, за исключением некоторого уменьшения размеров тимуса и увеличения размеров надпочечников, которые являются типичной стрессовой реакцией на введение антигена. У контрольных животных, инокулированных брюшнотифозной вакциной, патологические изменения были более выражены [45].

Кроме того, в опытах на морских свинках и мышах установлено, что гематологические показатели (количество лейкоцитов и эритроцитов, структура лейкоцитарной формулы) у животных, инокулированных КВК, практически не отличалась от аналогичных показателей инокулированных физиологическим раствором контрольных животных на протяжении всего срока наблюдения [46].

Наконец, в опытах на мышах с гексиналовой пробой было показано отсутствие у КВК негативного действия на детоксицирующую функцию печени, а результаты применения двух экспериментальных моделей – судорожных проб с тиосемикарбазидом и коразолом свидетельствовали об отсутствии негативного влияния разработанной вакцины на центральную нервную систему [47].

Данные о высокой иммуногенности, протективности и безвредности КВК, а также полученные в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (М.С. Воробьева, М. А. Горбунов, Н. А. Озерецковский) удовлетворительные результаты контроля трех серий вакцины на соответствия требованиям проекта научной документации на данный препарат, которые были разработанны в Институте им. Гамалеи и Институте им. Пастера, явились основанием для испытания вакцины на ограниченном контингенте. В этих испытаниях (проведенных под руководством А. Ж. Василенко) на добровольной основе приняли участие 40 практически здоровых лиц обоего пола в возрасте от 18 до 45 лет, из которых методом случайного выборочного распределения были сформированы две группы численностью по 20 человек – опытная и контрольная. Испытуемые первой группы были привиты вакциной подкожно-шприцевым методом, лица второй (контрольной) группы тем же методом получали изотонический раствор хлорида натрия в качестве плацебо. К участию в испытании были допущены только лица с отрицательными результатами предварительного серологического обследования на наличие антител к возбудителю Ку-лихорадки. Сыворотки исследовали с помощью РСК и разработанной нами иммуноферментной тест-системы с использованием для сенсибилизации планшетов HCl – гидролизного коксиеллезного антигена 1-й фазы [48] (в институте им. Пастера) и в РНИФ (в институте Военной медицины) в зашифрованном опыте.

Установлено, что у всех волонтёров контрольной группы антитела к коксиеллам не были выявлены ни одним из используемых серологических тестов на протяжении всего периода наблюдения. Напротив, у волонтёров опытной группы антитела были обнаружены в 80%, 55% и 40% с помощью ИФА, РНИФ и РСК, соответственно, при этом 67% проб, положительных в РСК, содержали антитела к коксиеллам 1-й и 2-й фаз [49].

Сыворотки, содержащие антитела по данным РСК, положительно реагировали с коксиеллёзным антигеном и в РНИФ, и в ИФА, а сыворотки, содержащие антитела по данным РНИФ, также положительно реагировали в ИФА.

Также было показано, что КВК обладает слабой местной и умеренной общей реактогенностью и не приводит к ухудшению функционального состояния организма или снижению работоспособности вакцинированных.

Исследование на базе НИИ микробиологии МО РФ (Р.А. Хамитов, А.Б. Предтеченский) трех новых серий КВК, необходимое для проведения Государственных испытаний, подтвердило полученные ранее результаты в НИИЭМ имени Пастера о высокой иммуногенности и протективности препарата. Так было показано, что КВК вызывает образование антител к коксиеллам у 100% иммунизированных животных и обеспечивает устойчивость 80% животных, получивших препарат к заражению вирулентным штаммом C.burnetii (10000 ИД).

Государственные полевые испытания КВК были проведены на базе НИИЦ (МБЗ) ГНИИИВМ МО РФ (В.М.Добрынин, А.В.Степанов). В них участвовало 200 волонтеров, из которых 100 получали вакцину и 100 – плацебо. Вакцину или плацебо вводили подкожно в объеме 0,5 мл. Результаты Государственных испытаний КВК и испытания этого препарата на ограниченной группе людей практически не различались. Так было подтверждено, что вакцина слабореактогенна и безопасна. По данным иммуноферментного анализа (применялась тест-система «COXIELLA BURNETII ELISA IgG»,производства фирмы «Vircell», Испания), у 84% и 81% вакцинированных были обнаружены в сыворотке крови IgG-антитела к C.burnetii 2-й фазы через один месяц и один год, соответственно.

Таким образом, под руководством и при непосредственном участии академика РАМН И. В. Тарасевич была разработана безопасная и высокоэффективная вакцина против Ку-лихорадки. Разноплановые исследования, обеспечившие создание этого инновационного препарата (защищенного 9 авторскими свидетельствами и патентами на изобретение), способствовали решению актуальных задач коксиеллёзной инфекции.

Литература

1. Kasar J. Coxiella burnetii infection. Ann NY Acad Sci 2005; 1063: 105-114.
2. Токаревич Н.К. Проблемы коксиеллёза на рубеже третьего тысячелетия. Актовая речь, С.-Петербург 2001.
3. Тарасевич И.В., Фетисова Н.Ф., Макарова В.А. и другие. Риккетсиозы. Природная очаговость болезней: исследования Института Гамалеи РАМН 2003; 64-98.
4. Tissot-Dupont H., Raoult D., Brougui P. et al. Epidemiologic features and clinical presentation of acute Q fever in hospitalized patients – 323 French cases. Am J Med 1992; 93: 427-434.
5. Raoult D., Tissot-Dupont H., Foucalt C. Q-fever 1985-1998: clinical and epidemiologic features of 1,383 infections. Medicine 2002; 79: 109 -123.
6. Lang G.H. Coxiellosis (Q-fever) in animals. In Q-Fever: The Disease T.J. Marrie Ed, CRC Press. Boca Raton, FL. 1990: 23-48.
7. Schmeer N., Muller P., Langel J. et al. Q fever vaccines for animals. Zentbl. Bakteriol. Microbiol. Hyg. Ser. A 1987; 267:79-88.
8. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. Public Health Assessment of Potential Biological Terrorism Agents. Emerg Infect Dis 2002; 8: 225-230.
9. Kagawa FT, Wehner JH, Mohindra V. Q fever as a biological weapon. Semin Respir Infect 2003; 18: 183-195.
10. Madariaga M.G., Rezal K., Trenholme G.M. et al. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis 2003; 3: 709-721.
11. Гениг В.А. Аттенуированный вариант «М» риккетсий Бернета, как возможная живая вакцина против Ку-лихорадки. Вестник АМН СССР 1960; 2: 46-57.
12. Михайлов В.В., Воробьев А.А., Махлай А.А. и др. Экспериментальное изучение иммуногенных и протективных свойств штамма М-44 Coxiella burnetii и живой энтеральной вакцины против лихорадки Ку. Журн. микробиол. 1996; 1: 38-42.
13. Johnson J.W., Eddy G.A., Pedersen J. Biological properties of M-44 strain of Coxiella burnetii. J. infect. Dis. 1976; 133: 334-338.
14. Johnson J.W., McLeod W.G., Stookey J.L. et al. Lesions in guinea pigs infected with Coxiella burnetii strain M-44. J. Infect. Dis. 1977; 135: 995-998.
15. Tokarevich N.K., Mossienko E.V., Suvorov A.N., Totolian A.A. Detection of Coxiella burnetii in different biological samples by polymerase chain reaction (PCR). American society for rickettsiology - Bartonella as an emerging pathogen group. Big Sky, Montana; 2001: 86.
16. Mossienko E.V., Tokarevich N.K., Suvorov A.N., Totolian A.A. Detection of Coxiella burnetii by PCR in Mice after Administration of Live M-44 Vaccine. Folia Microbiol. 2003: 48; 103-104.
17. Freylikhman O., Tokarevich N.K., Suvorov A.,et al. Coxiella burnetii persistence in three generations of mice after application of live attenuated human vaccine M-44 against Q fever. Annals of the NY Acad of sciences. 2003; 990: 496-499.
18. Williams J.C., Cantrell J.L. Biological and immunological properties of Coxiella burnetii vaccines in C 57BL/10ScN endotoxin-nonresponder mice. Inf. and Immun. 1982; 35, 3: 1091-1102.
19. Kasar J., Schramek S., Zajacova S. Индукция спленогамии у мышей убитыми клетками Coxiella burnetii. Acta virol. 1983; 27: 65-70.
20. Damrow T.A., Williams I.C., Waag D.M. Suppression of in vitro lymphocyte proliferation in C 57BL/10ScN mice vaccinated with phase I Coxiella burnetii. Inf. and Immun. 1985; 47: 149-156.
21. Kasar J., Schramek S. Сенсибилизация мышей к токсину риккетсий введением Coxiella burnetii. Acta virol. 1984; 28: 309-316.
22. Schramek S. Rickettsial endotoxic lipopolysaccharides. Rickettsia and Rickettsial diseases (J. Kasar, R. Ormsee, I. Tarasevich, eds.), Bratislava; 1978: 79-87.
23. Lukacova M., Schramek S. Kinetics of the extraction of phospholipids from Coxiella burnetii. Acta virol. 1988; 32: 85-88.
24. Токаревич Н.К. Биологические аспекты взаимоотношения C.burnetii и организма млекопитающего как основа совершенствования диагностики и специфической профилактики Ку-лихорадки. Автореф. дисс. на соиск. уч. ст.докт. мед. наук. СПб; 1997.
25. Демкин В.В., Токаревич Н.К., Редкина Е.Б. и др. Характеристика полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК штаммов C. burnetii, выделенных на территории России. Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 1993; 6: 13-16.
26. Токаревич Н.К., Дайтер А.Б., Рыбакова Н.А. Штамм Coxiella burnetii, используемый для получения гипериммунных сывороток. Авт свид. на изобретение № 1724683 от 8.12.1991 г.
27. Behymer D.E., Biberstein E.L., Riemann H.P. et al. Q-fever (Coxiella burnetii) investigation in dairy cattle: Challenge of immunity after vaccination. Am. J. Veter. Res. 1976; 6 (37): 631-634.
28. Lisak V. Опыт вакцинации сельскохозяйственных животных как мера профилактики лихорадки Ку у людей. Риккетсиозы: Труды института им. Пастера, Л. 1989; 66: 143-152.
29. Токаревич Н.К., Дайтер А.Б., Амосенкова Н.И. и др. Штамм коксиелл, используемый для получения инактивированной вакцины против Ку-лихорадки. Патент на изобретение № 2026342 от 9.01.1995 г.
30. Токаревич Н.К., Горбачев Е.Н. Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах. Авт свид. на изобретение № 1801494 от 9.10.1992 г.
31. Токаревич Н.К., Дайтер А.Б., Носков Ф.С., Шичкина В.П. Способ получения Ку-риккетсиального эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума. Авт. свид. на изобретение №1195501 от 1.08.1985г.
32. Горбачев Е.Н., Токаревич Н.К., Вербов В.Н. и др. Иммуноферментный метод индикации антигенов коксиелл Бернета. Журн. микробиол. 1991; 2: 56-60.
33. Полоцкий Ю.Е., Дайтер А.Б., Ефремов В.Е. и др. Реакция хозяина на введение различных компонентов Coxiella burnetii. Журн. микробиол. 1991; 9: 70-75.
34. Токаревич Н.К., Просверницин С.А., Карцева Н.А. и др. Морфологические изменения в организме морских свинок в ответ на введение различных антигенов Coxiella burnetii. Журн. микробиол. 1994; 5: 53-55.
35. Токаревич Н.К. Реакция торможения прилипания лейкоцитов для определения сенсибилизированности организма к риккетсиям (принцип и способ). Вопросы риккетсиологии: Матер. Всесоюз. конф. «эпидемиология диагностика и профилактика риккетсиозов». М. 1985:65-66.
36. Крыленков В.А., Малыгин А.М., Токаревич Н.К. и др. Количественная оценка сенсибилизации лимфоидных клеток к нормальным тканевым и бактериальным антигенам. Вестник хирургии 1987; 12: 54-56.
37. Токаревич Н.К. Применение реакции торможения прилипания лейкоцитов (РТПЛ) для оценки сенсибилизированности животных, иммунизированных различными антигенами C.burnetii. Актуальные проблемы инфекционной патологии. Ч.2., Санкт-Петербург, 1993: 63.
39. Тарасевич И.В., Яблонская В.А., Фаталиева С.Ф. и др. Способ получения вакцины против лихорадки Ку. Патент на изобретение № 2094057 от 27.10.1997 г.
40. Токаревич Н.К. Способ определения протективной активности Ку-риккетсиальных вакцин. Авт свид. на изобретение № 1253011 от 22.04.1986 г.
41. Кузина В.А., Токаревич Н.К., Мазинг Ю.А. Способ оценки эффективности иммунизации при Ку-риккетсиозе. Патент на изобретение № 2039982 от 20.07.1995 г.
42. Сидоренко С.В., Мацела А., Токаревич Н.К. и др. Динамика метаболической и функциональной активности иммунокомпетентных клеток мышей после иммунизации различными вакцинами против Ку-лихорадки. Антибиотики и химиотерапия 1993; 38 (12): 13-17.
43. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение I. Биохимическая характеристика вакцины. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 114-118.
44. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение III. Определение «острой» токсичности вакцины. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 123-127.
45. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение IV. Определение «хронической» токсичности вакцины. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 127-130.
46. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение V. Определение влияния комбинированной инактивированной вакцины на гематологические показатели. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 131-133.
47. Яблонская В.А., Тарасевич И.В., Фаталиева С.Ф. и др. Результаты изучения комбинированной вакцины из C.burnetii I фазы против лихорадки Ку. Сообщение VI. Определение влияния вакцины на центральную нервную систему и детоксицирующую функцию печени. Вопросы риккетсиологии (сборник научных трудов). М. 1994; 134-138.
48. Горбачев Е.Н., Токаревич Н.К. Изучение иммунного ответа у больных и переболевших Ку-лихорадкой при использовании иммуноферментного анализа. Журн. микробиол. 1995; 3: 99-102.
49. Krutitskaya L., Tokarevich N., Zhebrun A. et al. Autoimmune component in individuals during immune response to inactivated combined vaccine against Q-fever. Acta virol. 1996; 40: 173-177.