способ лечения онкологических заболеваний. Вакцина ньюкасла при онкологии

Вирус - да, Онко - нет! / Статьи / Онколитический вирус болезни Ньюкасла и аутологичные опухолевые клетки в комплексной терапии рака

05 октября 2015

 Онколитический вирус болезни Ньюкасла и аутологичные опухолевые клетки в комплексной терапии рака

В.В. Кешелава ФГУ РНЦРР Росздрава, Москва

(статья сокращена, при необходимости см. оригинал). 

В клинической онкологии накоплен большой опыт использования противоопухолевых вакцин, их эффективность доказана во многих клиниках мира. При этом разработаны и общепризнаны методы получения противоопухолевых вакцин и определено их место в профилактике и лечении рака.

В качестве одного из наиболее технологичных подходов рассматривается использование вируса, селективно заражающего опухолевые клетки. Таковым является вирус болезни Ньюкасла – псевдочумы птиц, точнее, его вакцинные штаммы – генетически стабильные, апатогенные для млекопитающих, применяемые в живых вирусных препаратах, повсеместно используемых для профилактики заболевания у кур. Преимущественное размножение данного вируса в опухолевых клетках млекопитающих было продемонстрировано более 40 лет назад. С этого времени большим количеством экспериментов на опухолях животных доказаны безвредность ВБН для млекопитающих и его достаточно высокая терапевтическая эффективность, особенно в случае сочетания онколитического и иммунизирующего действия зараженных вирусом опухолевых клеток.

Существует множество различных штаммов ВБН, все они классифицированы как литические (лизирующие клетки – МТН-68, 73-Т, Roakin, PV701) и нелитические (Ульстер). Штаммы ВБН – литические и нелитические – изучались как противораковые агенты для человеческих клеток. Исследователи при этом предполагают три клеточных механизма взаимодействия: первый – литические штаммы вируса напрямую уничтожают опухоли; второй – с помощью нелитических штаммов белки вируса проникают в мембрану опухолевых клеток, вызывая иммунную реакцию. И наконец, сам вирус может стимулировать организм носителя на вырабатку цитокинов: интерферонов и фактора некроза опухоли (TNF), что ведет в свою очередь к активации естественных клеток-убийц, макрофагов и сенсибилизированных Т-клеток.

Экспериментальные исследования на животных показали, что ВБН и зараженные ВБН раковые клетки могут стимулировать большое разнообразие иммунных ответов. Это может способствовать успешной терапии рака. Доказано: ВБН безопасен для организма человека, лечение считается безвредным. Эффективность метода в той или иной мере подтверждена клиническими наблюдениями (в США, Европе и Китае) на пациентах с различными злокачественными новообразованиями (II – III фазы испытаний). Представлены результаты исследований использования онколизатов (штамм ВБН 73-Т для лечения метастатической меланомы, а так же рака почки, молочной железы и яичников), цельноклеточных вакцин (штамм ВБН Ульстер для лечения, колоректального рака, рака яичников почки, шейки матки) и заражения пациентов литическим штаммом ВБН МТН-68 для лечения, в частности, рака толстой кишки, желудка, поджелудочной железы, легких.

Во всех случаях отмечен положительный эффект применения как чисто вирусной терапии, так и аутологичной вакцинации вирус-модифицированными опухолевыми клетками. Некоторые противоопухолевые вакцины в настоящее время проходят завершающую, III фазу клинических испытаний, и, по мнению многих исследователей, уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом в комплексном лечении рака.

Нами проанализированы опубликованные результаты о возможностях вакцинотерапии, обобщен опыт работы общепризнанных специалистов и с 2003 года начаты экспериментальные и клинические исследования по данной проблеме в рамках существующих медицинских норм клинических испытаний.

Была поставлена задача оптимизации и совершенствования имеющихся технологий получения аутологичных и модифицированных ВБН-вакцин, а также онколитического ВБН для использования у пациентов с различными злокачественными заболеваниями.

Применяемый нами апатогеный штамм Ла-Сота вируса болезни Ньюкасла (живая вакцина для птиц) выращивается в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Для внесения в человеческие опухолевые клетки и инъекций пациентам вирус очищали ультрацентрифугированием и проверяли на стерильность и безвредность. Оценка токсичности препарата (вакцины) проводилась в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ. Препарат при необходимости может быть лиофилизован, сохраняя при этом свои свойства в течение года.

Известно, что принцип действия противоопухолевых вакцин основан на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в природе иммунитета здорового человека. Недостаточность противоопухолевого иммунитета обусловлена растущей опухолью и/или прогрессированием с возникновением множества метастазов и иммунодепрессивным эффектом противоопухолевой химиотерапии и облучения.

Усиление эффективности противоопухолевых вакцин путем повышения иммуногенности опухолевых антигенов достигалось нами путем модификации вакцины непатогенным вирусом (ВБН) и использования человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Основное биологическое действие Г-КСФ – гемопоэтическое, главным образом нейтрофилопоэтическое. Его введение в организм приводит к увеличению содержания в крови функционально активных нейтрофилов. Кроме этого, препарат повышает биохимическую (синтез протеаз), фагоцитарную, хемотаксическую активность, усиливает в организме синтез других цитокинов (интерферонов, трансформирующего фактора роста β и др.). Тем самым активизируются различные неспецифические и специфические механизмы защиты организма.

…

Проведенные медико-биологические исследования показали высокую эффективность предлагаемой модели патогенетической терапии и позволили с учетом принятых допустимых медицинских норм провести клинические испытания на определенной группе больных с различными злокачественными новообразованиями.

Цель данного исследования:

объективно оценить непосредственный эффект комплексного лечения и его продолжительность (время до прогрессирования заболевания, выживаемость, качество жизни больных с различной злокачественной патологией) при использовании как аутологичных, облученных вакцин, модифицированных ВБН (группа А), так и онколитического вируса ВБН в чистом виде (группа В).

Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии:

1. Гистологически верифицированный диагноз опухолевого очага.

2. Возраст старше 18 лет.

3. Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%).

4. Отсутствие эффекта противоопухолевого лечения на фоне ранее проводимой терапии или наличие признаков прогрессирования после их проведения.

5. Возможность визуальной или инструментальной оценки динамики изменений.

6. Информированное согласие больного на участие в исследовании.

Критерии исключения:

1.     Поражение центральной нервной системы.

2.      Активный аутоиммунный процесс.

3.     Возраст старше 70 лет.

4.     Наличие с одной из перечисленных инфекций: HIV, HBV, HCV.

5.     Инфекционные или тяжелые заболевания сердечно- сосудистой, нервной, дыхательной или эндокринной систем; беременность или лактация.

6.     Нарушение функции печени и/или почек (билирубин > 1,5 х N, креатинин > 1,5 х N), показатели крови: лейкоциты < 2,5 х 109/л Hb < 90 г/л, лимфоциты < 1,0 х 109/л, тромбоциты < 75 х 109/л).

В 2004 – 2006 годах в межклиническое проспективное нерандомизированное исследование эффективности и токсичности используемых вакцин было включено 46 больных с диагнозами:  «меланома кожи» (9 чел.), «рак молочной железы» (21),  «рак толстой кишки» (7), «рак шейки матки» (5), «рак яичников» (1), «увеальная меланома» (2) и «меланома влагалища» (1 чел.). Средний возраст пациентов составил 54,2 года.

Больным из обеих групп вакцину в сочетании с Г-КСФ вводили под/внутрикожно раз в неделю в течение 4-х недель начиная с 4-й по 8-ю недели после операции. В последующем курс продолжали аналогичными инъекциями раз в 2 недели в течение года, далее инъекции делали с возрастающим до 3-х месяцев интервалом на протяжении 1,5 года.

При проведении комбинированного лечения с включением курсов адъювантной химиотерапии и при показаниях лучевой терапии в течение 6 месяцев лечения 29 больных получили аутологичную, облученную вакцину, модифицированную ВБН (от 8 до 16 внутрикожных введений), а 17 больных – онколитический вирус болезни Ньюкасла (до 16 внутрикожных введений) также при 6-месячном курсе лечения.

Необходимо учитывать тот факт, что большинство больных имели диссеминированные формы опухолей, резистентные к лучевой и химиотерапии при наличии растущих множественных метастазов, поражающих не один орган.

Следует отметить, что всем больным (46 человек) проведены полный курс комплексной терапии рака и в последующем – поддерживающая вакцинотерапия в течение 9 месяцев и более (амбулаторно). В настоящее время все пациенты находятся в процессе лечебной или профилактической вакцинотерапии и динамического наблюдения с мониторингом основных жизненных параметров.

Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированной вирусом болезни Ньюкасла вакцины (группа А) и использования онколитического вируса болезни Ньюкасла в чистом виде (группа В) представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированной вирусом болезни Ньюкасла вакцины

Таблица 2. Результаты клинических исследований эффективности использования онколитического вируса болезни Ньюкасла

*Критерии лечебного эффекта согласно шкале RECIST:ПО - Полный ответ: исчезновение всех опухолевых очагов на срок не менее 4-х недель.

ЧО - Частичный ответ: уменьшение измеряемых очагов на 30% и более.СТ - стабилизация: нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование.ПР - прогрессирование: увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага.

Клинические и лабораторные исследования в обеих группах показали, что методы вакцинотерапии нетоксичны, хорошо переносились больными и сопровождались иммунологическим ответом у 42 больных, что подтверждено показателями периферической крови.

Большинство пациентов проходили курсы лечения амбулаторно. В течение всего процесса лечения больные вели обычный образ жизни. Каких-либо осложнений в процессе комплексной терапии не было отмечено. По завершении первого курса исчезала боль, уменьшались метастазы, больные отказывались от наркотических и обезболивающих средств, становились активнее, у них повышался аппетит, и они прибавляли в весе. Отсутствие токсичности делало возможным применение данного метода лечения в течение года и более – до получения стойкого эффекта.

Результаты клинических исследований эффективности использования вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, в комплексной терапии рака в группах А и В (см. табл. 1, 2) показали следующее: лихорадка I и II степени наблюдалась практически у всех больных, она сопровождалась кратковременным ухудшением самочувствия, не требовала какого-либо лечения и в течение суток самостоятельно купировалась. Локальные кожные реакции в месте как первичного, так и повторных введений вакцины (гиперемия и локальный отек) стихали в течение нескольких дней и не требовали дополнительного лечения. Подобные симптомы традиционно наблюдаются при вакцинации. Возможные побочные эффекты при повторных вакцинациях в течение 4 – 5 суток после иммунизации вследствие выработки специфических антител (лихорадка, озноб, ощущение жара, кожная сыпь, увеличение лимфатических узлов) не были зарегистрированы ни разу.

Полный ответ на вакцинацию – исчезновение всех опухолевых очагов получен у 7 больных (15,2%). Из числа ответивших (см. табл. 1, группа А) у 5 пациентов (17,2%) был рак молочной железы (2 чел.) и толстой кишки (2 чел.), у 1 больной – меланома влагалища и у 2 (11,7%) – распространенный рак шейки матки (см. табл. 2). Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из ранее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями, включающими компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печень, легкие, кости и лимфатические узлы отмечалась после второго курса комплексного лечения и завершалась полным их исчезновением на 5 – 6-м курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта в настоящее время составляет 9 месяцев (от 4-х до 16 месяцев).

Частичный ответ – уменьшение измеряемых очагов на 30% и более – наблюдался у 11 больных (23,9%). Как видно из таблицы 1 (группа А), 10 (34,5%) пациентов имели диагнозы: «меланома кожи» (2 чел.), «рак молочной железы» (6 чел.) и «рак толстой кишки» (2 чел.). В группе В (см. табл. 2) частичный регресс получен у 1 больной раком молочной железы (5,7%). Средняя продолжительность эффекта в обеих группах составляет 7,7 месяца.

Стабилизация опухолевого процесса (нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование) наблюдалась у 27 больных (58,7%). В группе А – 12 (41,3%) больных имели диагнозы: «меланома кожи» (5 чел.), «рак молочной железы» (4 чел.), «рак яичников» (1 чел.), «рак толстой кишки» (1 чел.) и увеальная меланома (2 чел.). Средняя продолжительность эффекта у данной группы больных – 7,7 месяца.

В группе В (см. табл. 2) стабилизация опухолевого процесса отмечена у 14 (82,3%) больных с диагнозами: «меланома кожи» (2 чел.), «рак молочной железы» (7 чел.), «рак толстой кишки» (2 чел.) и «рак шейки матки» (3 чел.). Средняя продолжительность эффекта – 6 месяцев.

Прогрессирование (увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага) наблюдалось в группе А у 2 больных (6,8%) с диагнозами «рак молочной железы» и «меланома кожи».В таблице 3 суммированы критерии лечебного эффекта комплексной терапии больных со злокачественными опухолями в группах А и В.

Таблица 3. Критерии лечебного эффекта использования аутологичной, облученной и модифицированной ВБН вакцины (группа А) и онколитического ВБН (группа В) в комплексной терапии рака

n – количество больных

Анализируя предварительные результаты комплексной терапии рака по данным, приведенным в таблице 3, можно сделать следующие выводы:

– вирус болезни Ньюкасла (апатогеный штамм Ла-Сота) по уровню эффективности и безопасности применения соответствует признанным стандартам специфической иммунотерапии опухолей;– вакцинотерапия применима в качестве иммунологического адъюванта в комплексной терапии для лечения больных диссеминированными солидными опухолями;– вирусная терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, нивелируя иммунодепрессивный эффект противоопухолевой химиотерапии и облучения, позволяет проводить комплексную терапию длительно и эффективно, без каких-либо осложнений в течение всего курса лечения;– вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных ВБН, способны инициировать более выраженный специфический противоопухолевый (терапевтический) эффект в сравнении с онколитическим ВБН в чистом виде в комплексной терапии рака, что делает метод лечения – при его возможности использования – предпочтительным.

Анализ предварительных результатов на небольшом клиническом материале и малые сроки наблюдения за больными не позволяет найти ответы на множество актуальных вопросов, в частности: в какой степени видимый клинический успех можно отнести к вакцинации опухолевыми клетками, зараженными ВБН, или к чисто вирусной терапии у больных, получивших комплексное лечение?

Применение вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, в комплексном лечении рака может быть реально осуществлено на базе медицинских центров. Области и схемы применения ВБН в онкологических клиниках отрабатываются в процессе клинических испытаний с учетом мирового опыта.

Результаты этих испытаний показали, что все виды клеточных вакцин обладают определенным иммунологическим и клиническим эффектом, повышающим качество жизни онкологических больных и улучшающим перспективы лечения.

Перспективным представляется также проведение иммунотерапии вакцинами у больных после радикального лечения или циторедуктивных операций с минимальным объемом опухолевой массы.

Вероятно, пройдет еще немало лет до начала широкого применения вакцинотерапии на практике. Однако результаты клинических и экспериментальных работ ученых в разных странах мира позволяют рассчитывать на доминирующую роль иммунотерапевтических препаратов в лечении онкологических заболеваний.

Есть все основания считать, что уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака.

Вместе с тем следует отметить, что хотя перспективность использования противоопухолевых вакцин в онкологии можно считать установленной, их внедрение в клиническую практику ограничивается высокой стоимостью, а также довольно сложной технологией изготовления, требующей высококвалифицированного персонала и соответствующего оснащения. Можно надеяться, что создание специализированных лабораторий клеточной медицины, разработка новых методов и совершенствование существующих технологий получения противоопухолевых вакцин позволят уже в ближайшее время использовать их в качестве доступного метода лечения широкого круга онкологических больных.

Литература

1.                            Гриневич Ю.А. Фильчаков Ф.В. Адаптивная иммунотерапия и ее влияние на эффективность лечения онкологического профиля // Онкология. 2003. Т. 5. № 2. С. 90–95.

2.                            2. Хансон К.П., Моисеенко В.М. Биотерапия злокачественных новообразований // Проблемы клинической медицины. № 3. 2005. С. 10–15.

3.                           3. Steiner, H.H., Bonsanto M.M., Beckhove P. et al. Antitumor vaccination of patients with glioblastoma multiforme: A pilot study to assess feasibility, safety and clinical Benefit. J Clin Oncol 2004; 22: 4272–4281.

4.                           4. Washburn B., Weigand M. A., Grosse-Wilde A. et al. TNF-related apoptosis-inducing ligand mediates tumoricidal activity of Human monocytes stimulated by newcastle disease virus. J Immunol 2003. 170: 1814–1821.

5.                           5. Pecora A.L., Rizvi N., Cohen G.I. et al. Phase i trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin Oncol. 2002; 20: 2251–2266.

6.                           6. Nakaya T., Cros J., Park M.-S., Nakaya Y et al. Recombinant newcastle disease dirus as a vaccine vector. J. Virol. 2001; 75: 11868–11873.7. Csatary L.K., Csatary E., Moss R.W. Re: Scientific interest in newcastle disease virus is reviving. J Natl Cancer Inst 2000; 92: 493–493.8. Nelson N.J. RESPONSE: Re: Scientific Interest in newcastle disease virus is reviving. J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 493a–494 .

Статья опубликована в журнале "Эпидемиология и Вакцинопрофилактика" № 3 (34) за 2007 годстр. 23-28 http://medi.ru/doc/600001.htm

virus-da-onko.net

Онколитический вирус болезни Ньюкасла и аутологичные опухолевые клетки в комплексной терапии рака

В.В. КешелаваФГУ РНЦРР Росздрава, Москва

За последние годы в онкологии сделано многое. Прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенными достижениями в молекулярной биологии, иммунологии, развитии методов иммунотерапии, из которых наиболее перспективным представляется создание противоопухолевых вакцин, в частности на основе цельных опухолевых клеток (аутологичных и аллогенных), аутологичных белков теплового шока, вируса болезни Ньюкасла (ВБН) [1, 2, 7, 8].

В клинической онкологии накоплен большой опыт использования противоопухолевых вакцин, их эффективность доказана во многих клиниках мира. При этом разработаны и общепризнаны методы получения противоопухолевых вакцин и определено их место в профилактике и лечении рака [2, 3, 5, 7, 8].

Клетки опухолей пациента, полученные при операции или биопсии, широко используются в мировой онкологической практике для создания индивидуальных иммунотерапевтических препаратов. Основная задача такой терапии – повышение иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью химической обработки – гаптенизации, генетической модификации – трансфекции генов, которые кодируют стимулирующие иммунитет молекулы, и вирусной модификации. Последний подход рассматривается в качестве наиболее технологичного при использовании вируса, селективно заражающего опухолевые клетки. Таковым является вирус болезни Ньюкасла – псевдочумы птиц, точнее, его вакцинные штаммы – генетически стабильные, апатогенные для млекопитающих, применяемые в живых вирусных препаратах, повсеместно используемых для профилактики заболевания у кур. Преимущественное размножение данного вируса в опухолевых клетках млекопитающих было продемонстрировано более 40 лет назад. С этого времени большим количеством экспериментов на опухолях животных доказаны безвредность ВБН для млекопитающих и его достаточно высокая терапевтическая эффективность, особенно в случае сочетания онколитического и иммунизирующего действия зараженных вирусом опухолевых клеток.

Существует множество различных штаммов ВБН, все они классифицированы как литические (лизирующие клетки – МТН-68, 73-Т, Roakin, PV701) и нелитические (Ульстер). Штаммы ВБН – литические и нелитические – изучались как противораковые агенты для человеческих клеток [4 – 8]. Исследователи при этом предполагают три клеточных механизма взаимодействия: первый – литические штаммы вируса напрямую уничтожают опухоли; второй – с помощью нелитических штаммов белки вируса проникают в мембрану опухолевых клеток, вызывая иммунную реакцию.

Вместе с тем есть много вопросов, касающихся клеточного механизма взаимодействия вируса с организмом. Не совсем ясно, какой из штаммов более эффективен, а также – что эффективнее: собственные опухолевые клетки пациента или опухолевые клеточные линии.

Экспериментальные исследования на животных показали, что ВБН и зараженные ВБН раковые клетки могут стимулировать большое разнообразие иммунных ответов. Это может способствовать успешной терапии рака. Доказано: ВБН безопасен для организма человека, лечение считается безвредным. Эффективность метода в той или иной мере подтверждена клиническими наблюдениями (в США, Европе и Китае) на пациентах с различными злокачественными новообразованиями (II – III фазы испытаний). Представлены результаты исследований использования онколизатов (штамм ВБН 73-Т для лечения метастатической меланомы, а так же рака почки, молочной железы и яичников), цельноклеточных вакцин (штамм ВБН Ульстер для лечения, колоректального рака, рака яичников почки, шейки матки) и заражения пациентов литическим штаммом ВБН МТН-68 для лечения, в частности, рака толстой кишки, желудка, поджелудочной железы, легких [ 6 – 8]. Во всех случаях отмечен положительный эффект применения как чисто вирусной терапии, так и аутологичной вакцинации вирус-модифицированными опухолевыми клетками. Некоторые противоопухолевые вакцины в настоящее время проходят завершающую, III фазу клинических испытаний, и, по мнению многих исследователей, уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом в комплексном лечении рака [4– 8].

Нами проанализированы опубликованные результаты о возможностях вакцинотерапии, обобщен опыт работы общепризнанных специалистов и с 2003 года начаты экспериментальные и клинические исследования по данной проблеме в рамках существующих медицинских норм клинических испытаний.

Была поставлена задача оптимизации и совершенствования имеющихся технологий получения аутологичных и модифицированных ВБН-вакцин, а также онколитического ВБН для использования у пациентов с различными злокачественными заболеваниями.

Применяемый нами апатогеный штамм Ла-Сота вируса болезни Ньюкасла (живая вакцина для птиц) выращивается в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах.

Для приготовления аутологичной вакцины используют опухолевые клетки, выделенные непосредственно в ходе удаления опухоли. Технология приготовления вакцины общеизвестна и предполагает дезагрегацию образцов опухоли, культивирование клеток, облучение клеток с целью блокады их пролиферативной активности и различные приемы модификации для повышения ее эффективности. Этап создания культуры опухолевых клеток – сложный и неоднозначный процесс. По мнению абсолютного большинства исследователей, существуют значительные трудности и особенности в создании условий, благоприятных для индивидуальных первичных культур опухолевых клеток. Выживание клеток и их пролиферация возможны только при воссоздании всех внешних условий, которые клетки имели in vivo. Разработанные и применяемые нами оригинальные технологии выделения и культивирования клеток позволяют получить пролиферирующие первичные культуры более чем в 70% случаев для таких опухолей, как меланома кожи, рак почки, толстой кишки, яичников и молочной железы, а клеточные линии – по крайней мере в 50% случаев.

Не менее специфичной в процессе приготовления клеточных вакцин является необходимость инактивировать их способность к размножению с одновременным сохранением метаболической активности и повышения иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью вирусной модификации. На данном этапе клетки инактивировали гамма-излучением (дозы облучения подбирали индивидуально), замораживали в жидком азоте и использовали для вакцинации в дозах 10 – 50 млн после обработки 10 – 100 ID50 вируса (ВБН) на клетку.

Более специфическую аутовакцину получали из размножающихся in vitro клеток – перевиваемых опухолевых линий. Такие линии клеток могут быть получены из операционного или биопсийного материала и способны размножаться бесконечно долго, обеспечивая необходимое для вакцинации количество гомогенных опухолевых клеток. Эти линии клеток также замораживали, инактивировали гамма-излучением и обрабатывали вирусом перед введением пациентам.

Известно, что принцип действия противоопухолевых вакцин основан на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в природе иммунитета здорового человека.

Усиление эффективности противоопухолевых вакцин путем повышения иммуногенности опухолевых антигенов достигалось нами путем модификации вакцины непатогенным вирусом (ВБН) и использования человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Основное биологическое действие Г-КСФ – гемопоэтическое, главным образом нейтрофилопоэтическое. Его введение в организм приводит к увеличению содержания в крови функционально активных нейтрофилов. Кроме этого, препарат повышает биохимическую (синтез протеаз), фагоцитарную, хемотаксическую активность, усиливает в организме синтез других цитокинов (интерферонов, трансформирующего фактора роста β и др.). Тем самым активизируются различные неспецифические и специфические механизмы защиты организма.

Предварительная клиническая и иммунологическая оценка эффективности вакцинотерапии в сочетании с Г-КСФ, а также наличие клеточных линий, полученных на этапах создания вакцины, позволили пересмотреть принципы и подходы химиотерапии в данном комплексе лечения. Правильный подбор препаратов, избирательно действующих на опухолевые клетки, выбор оптимальной дозы, режима и способа применения дали возможность проводить курсы химиотерапии длительно, без каких-либо осложнений в течение всего курса вакцинотерапии.

Предполагая данную комплексную методику лечения рака, мы учитывали и слабые сторон аутовакцинации – результат зависит от индивидуальных особенностей противоопухолевого иммунитета, а опухоль характеризуется не только множественностью антигенов, но и повышенной мутационной активностью с дальнейшим усилением признаков злокачественности.

Проведенные медико-биологические исследования показали высокую эффективность предлагаемой модели патогенетической терапии и позволили с учетом принятых допустимых медицинских норм провести клинические испытания на определенной группе больных с различными злокачественными новообразованиями.

Цель данного исследования:

объективно оценить непосредственный эффект комплексного лечения и его продолжительность (время до прогрессирования заболевания, выживаемость, качество жизни больных с различной злокачественной патологией) при использовании как аутологичных, облученных вакцин, модифицированных ВБН (группа А), так и онколитического вируса ВБН в чистом виде (группа В).Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии:

1. Гистологически верифицированный диагноз опухолевого очага.2. Возраст старше 18 лет.3. Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%).4. Отсутствие эффекта противоопухолевого лечения на фоне ранее проводимой терапии или наличие признаков прогрессирования после их проведения.5. Возможность визуальной или инструментальной оценки динамики изменений.6. Информированное согласие больного на участие в исследовании.

Критерии исключения:

1. Поражение центральной нервной системы.2. Активный аутоиммунный процесс.3. Возраст старше 70 лет.4. Наличие с одной из перечисленных инфекций: HIV, HBV, HCV.5. Инфекционные или тяжелые заболевания сердечно- сосудистой, нервной, дыхательной или эндокринной систем; беременность или лактация.6. Нарушение функции печени и/или почек (билирубин > 1,5 х N, креатинин > 1,5 х N), показатели крови: лейкоциты

В 2004 – 2006 годах в межклиническое проспективное нерандомизированное исследование эффективности и токсичности используемых вакцин было включено 46 больных с диагнозами:– «меланома кожи» (9 чел.), «рак молочной железы» (21), – «рак толстой кишки» (7), «рак шейки матки» (5), «рак яичников» (1), «увеальная меланома» (2) и «меланома влагалища» (1 чел.). Средний возраст пациентов составил 54,2 года.

Больным из обеих групп вакцину в сочетании с Г-КСФ вводили под/внутрикожно раз в неделю в течение 4-х недель начиная с 4-й по 8-ю недели после операции. В последующем курс продолжали аналогичными инъекциями раз в 2 недели в течение года, далее инъекции делали с возрастающим до 3-х месяцев интервалом на протяжении 1,5 года.

При проведении комбинированного лечения с включением курсов адъювантной химиотерапии и при показаниях лучевой терапии в течение 6 месяцев лечения 29 больных получили аутологичную, облученную вакцину, модифицированную ВБН (от 8 до 16 внутрикожных введений), а 17 больных – онколитический вирус болезни Ньюкасла (до 16 внутрикожных введений) также при 6-месячном курсе лечения.Необходимо учитывать тот факт, что большинство больных имели диссеминированные формы опухолей, резистентные к лучевой и химиотерапии при наличии растущих множественных метастазов, поражающих не один орган.

Следует отметить, что всем больным (46 человек) проведены полный курс комплексной терапии рака и в последующем – поддерживающая вакцинотерапия в течение 9 месяцев и более (амбулаторно).

Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированной вирусом болезни Ньюкасла вакцины (группа А) и использования онколитического вируса болезни Ньюкасла в чистом виде (группа В) представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированной вирусом болезни Ньюкасла вакцины

Таблица 2. Результаты клинических исследований эффективности использования онколитического вируса болезни Ньюкасла

*Критерии лечебного эффекта согласно шкале RECIST:ПО - Полный ответ: исчезновение всех опухолевых очагов на срок не менее 4-х недель.ЧО - Частичный ответ: уменьшение измеряемых очагов на 30% и более. СТ - стабилизация: нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование. ПР - прогрессирование: увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага.

Клинические и лабораторные исследования в обеих группах показали, что методы вакцинотерапии нетоксичны, хорошо переносились больными и сопровождались иммунологическим ответом у 42 больных, что подтверждено показателями периферической крови.

Большинство пациентов проходили курсы лечения амбулаторно. В течение всего процесса лечения больные вели обычный образ жизни. Каких-либо осложнений в процессе комплексной терапии не было отмечено. По завершении первого курса исчезала боль, уменьшались метастазы, больные отказывались от наркотических и обезболивающих средств, становились активнее, у них повышался аппетит, и они прибавляли в весе. Отсутствие токсичности делало возможным применение данного метода лечения в течение года и более – до получения стойкого эффекта.

Результаты клинических исследований эффективности использования вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, в комплексной терапии рака в группах А и В (см. табл. 1, 2) показали следующее: лихорадка I и II степени наблюдалась практически у всех больных, она сопровождалась кратковременным ухудшением самочувствия, не требовала какого-либо лечения и в течение суток самостоятельно купировалась.

Полный ответ на вакцинацию – исчезновение всех опухолевых очагов получен у 7 больных (15,2%). Из числа ответивших (см. табл. 1, группа А) у 5 пациентов (17,2%) был рак молочной железы (2 чел.) и толстой кишки (2 чел.), у 1 больной – меланома влагалища и у 2 (11,7%) – распространенный рак шейки матки (см. табл. 2). Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из ранее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями, включающими компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печень, легкие, кости и лимфатические узлы отмечалась после второго курса комплексного лечения и завершалась полным их исчезновением на 5 – 6-м курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта в настоящее время составляет 9 месяцев (от 4-х до 16 месяцев).

Частичный ответ – уменьшение измеряемых очагов на 30% и более – наблюдался у 11 больных (23,9%). Как видно из таблицы 1 (группа А), 10 (34,5%) пациентов имели диагнозы: «меланома кожи» (2 чел.), «рак молочной железы» (6 чел.) и «рак толстой кишки» (2 чел.). В группе В (см. табл. 2) частичный регресс получен у 1 больной раком молочной железы (5,7%). Средняя продолжительность эффекта в обеих группах составляет 7,7 месяца.Стабилизация опухолевого процесса (нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование) наблюдалась у 27 больных (58,7%). В группе А – 12 (41,3%) больных имели диагнозы: «меланома кожи» (5 чел.), «рак молочной железы» (4 чел.), «рак яичников» (1 чел.), «рак толстой кишки» (1 чел.) и увеальная меланома (2 чел.). Средняя продолжительность эффекта у данной группы больных – 7,7 месяца.

В группе В (см. табл. 2) стабилизация опухолевого процесса отмечена у 14 (82,3%) больных с диагнозами: «меланома кожи» (2 чел.), «рак молочной железы» (7 чел.), «рак толстой кишки» (2 чел.) и «рак шейки матки» (3 чел.).

Прогрессирование (увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага) наблюдалось в группе А у 2 больных (6,8%) с диагнозами «рак молочной железы» и «меланома кожи».В таблице 3 суммированы критерии лечебного эффекта комплексной терапии больных со злокачественными опухолями в группах А и В.

Таблица 3. Критерии лечебного эффекта использования аутологичной, облученной и модифицированной ВБН вакцины (группа А) и онколитического ВБН (группа В) в комплексной терапии рака

больные / % Полный ответ 5 / 17.,2 % 2 / 11.,7 % Частичный ответ 10 / 34,.5 % 1 / 5,.7 % Стабилизация 12 / 41,.3 % 14 / 82.,3 % Прогрессирование 2 / 6,.8 % 0 / 0 %

n – количество больных

Анализируя предварительные результаты комплексной терапии рака по данным, приведенным в таблице 3, можно сделать следующие выводы:

– вирус болезни Ньюкасла (апатогеный штамм Ла-Сота) по уровню эффективности и безопасности применения соответствует признанным стандартам специфической иммунотерапии опухолей;– вакцинотерапия применима в качестве иммунологического адъюванта в комплексной терапии для лечения больных диссеминированными солидными опухолями;– вирусная терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, нивелируя иммунодепрессивный эффект противоопухолевой химиотерапии и облучения, позволяет проводить комплексную терапию длительно и эффективно, без каких-либо осложнений в течение всего курса лечения;– вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных ВБН; способны инициировать более выраженный специфический противоопухолевый (терапевтический) эффект в сравнении с онколитическим ВБН в чистом виде в комплексной терапии рака, что делает метод лечения – при его возможности использования – предпочтительным.

Анализ предварительных результатов на небольшом клиническом материале и малые сроки наблюдения за больными не позволяет найти ответы на множество актуальных вопросов, в частности: в какой степени видимый клинический успех можно отнести к вакцинации опухолевыми клетками, зараженными ВБН, или к чисто вирусной терапии у больных, получивших комплексное лечение?

Применение вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом, в комплексном лечении рака может быть реально осуществлено на базе медицинских центров.

Результаты этих испытаний показали, что все виды клеточных вакцин обладают определенным иммунологическим и клиническим эффектом, повышающим качество жизни онкологических больных и улучшающим перспективы лечения. Перспективным представляется также проведение иммунотерапии вакцинами у больных после радикального лечения или циторедуктивных операций с минимальным объемом опухолевой массы.Вероятно, пройдет еще немало лет до начала широкого применения вакцинотерапии на практике. Однако результаты клинических и экспериментальных работ ученых в разных странах мира позволяют рассчитывать на доминирующую роль иммунотерапевтических препаратов в лечении онкологических заболеваний.

Есть все основания считать, что уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака.Вместе с тем следует отметить, что хотя перспективность использования противоопухолевых вакцин в онкологии можно считать установленной, их внедрение в клиническую практику ограничивается высокой стоимостью, а также довольно сложной технологией изготовления, требующей высококвалифицированного персонала и соответствующего оснащения. Можно надеяться, что создание специализированных лабораторий клеточной медицины, разработка новых методов и совершенствование существующих технологий получения противоопухолевых вакцин позволят уже в ближайшее время использовать их в качестве доступного метода лечения широкого круга онкологических больных.

Литература

1. Гриневич Ю.А. Фильчаков Ф.В. Адаптивная иммунотерапия и ее влияние на эффективность лечения онкологического профиля // Онкология. 2003. Т. 5. № 2. С. 90–95.2. Хансон К.П., Моисеенко В.М. Биотерапия злокачественных новообразований // Проблемы клинической медицины. № 3. 2005. С. 10–15. 3. Steiner, H.H., Bonsanto M.M., Beckhove P. et al. Antitumor vaccination of patients with glioblastoma multiforme: A pilot study to assess feasibility, safety and clinical Benefit. J Clin Oncol 2004; 22: 4272–4281. 4. Washburn B., Weigand M. A., Grosse-Wilde A. et al. TNF-related apoptosis-inducing ligand mediates tumoricidal activity of Human monocytes stimulated by newcastle disease virus. J Immunol 2003. 170: 1814–1821. 5. Pecora A.L., Rizvi N., Cohen G.I. et al. Phase i trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin Oncol. 2002; 20: 2251–2266. 6. Nakaya T., Cros J., Park M.-S., Nakaya Y et al. Recombinant newcastle disease dirus as a vaccine vector. J. Virol. 2001; 75: 11868–11873. 7. Csatary L.K., Csatary E., Moss R.W. Re: Scientific interest in newcastle disease virus is reviving. J Natl Cancer Inst 2000; 92: 493–493. 8. Nelson N.J. RESPONSE: Re: Scientific Interest in newcastle disease virus is reviving. J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 493a–494 .

Статья опубликована в журнале "Эпидемиология и Вакцинопрофилактика" № 3 (34) за 2007 годПубликуется с разрешения редакции журнала.

www.medcentre.com.ua

способ лечения онкологических заболеваний - патент РФ 2379055

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении опухолей. Способ включает введение аутологичной вакцины, представляющей собой выделенные из опухолевой ткани пациента белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами. При этом до начала лечения аутологичной вакциной вводят онколитический атеннюированный вирус болезни Ньюкасла в качестве адъюванта. Использование изобретения позволяет повысить эффективность лечения опухолей за счет формирования специфического иммунного ответа против опухоли под действием вакцины и дополнительной стимуляции неспецифического иммунитета в сочетании с цитолитической активностью адъюванта. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

Рисунки к патенту РФ 2379055

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области иммунологии, медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для лечения злокачественных новообразований сочетанием иммунотерапевтического и адъювантного методов, в частности сочетанным использованием аутологичных вакцин на основе белков теплового шока и авирулентных штаммов вируса болезни Ньюкасла.

Уровень техники

Одним из наиболее перспективных направлений является использование аутологичных вакцин, среди которых наибольшей эффективностью, по данным многочисленных авторов, являются вакцины на основе белков теплового шока (heat shock proteins - HSP).

Известен способ применения вакцин для формирования специфического противоопухолевого иммунитета на основе HSP (US Patent 5837251, US Patent 5935576, US Patent 5750119, US Patent 5948646, US Patent 5961979, US Patent 5985270, US Patent 6475490, US Patent 6468540, US Patent 6461615, US Patent 6455503, US Patent 6447781, US Patent 6410028, US Patent 6403095, US Patent 6399070, US Patent 6322790, US Patent 6162436, US Patent 5830464). Недостатком предложенных методов иммунотерапевтического воздействия на опухоли является необходимость в повышении иммуногенности опухолевых клеток, против которых предложенные HSP-вакцины развивают специфический иммунитет. Зачастую формирования пула цитотоксических лимфоцитов (CD8+ CTL) может быть недостаточно, поэтому необходим поиск путей, при которых опухоли-мишени могут быть доступны для атаки и последующего апоптоза, т.е. поиск способов, направленных на повышение иммуногенности опухолей и более специфичное воздействие со стороны иммунной системы.

Применение адъювантов является популярным методом, применяемым для усиления иммунологической составляющей противоопухолевых вакцин. Одним из наиболее перспективных в этом направлении является использование онколитических вирусов, - а именно вируса болезни Ньюкасла (ВБН). Известен способ использования адъюванта, - инактивированного антигена ВБН, в орнитологии, для защиты от чумы птиц (Патент США № 6,340,464).

Известен способ лечения онкологических заболеваний, заключающийся в применении ВБН в составе композиции, обладающей противоопухолевым эффектом, осуществляющимся за счет лизиса опухолевых клеток (Патент США № 7,223,389, прототип). Недостатком данного способа является то, что данная терапия предусматривает использование только цитолитического потенциала ВБН и не предусматривает создание прецедента для формирования специфического иммунитета, крайне необходимого для противоопухолевого лечения.

Известен способ применения ВБН в качестве адъюванта у пациентов с колоноректальной карциномой, однако в качестве самой вакцины использовались аутологичные опухолевые клетки (Schlag et al., 2003; Liang et al., 2003; Mosolits et al., 2005). Недостатком этого способа вакцинирования является необходимость в наращивании аутологичного опухолевого материала, в противном случае можно ожидать проявления недостаточного для противоопухолевой защиты уровня специфического иммунного ответа. Немаловажным является также тот факт, что этап создания культуры опухолевых клеток представляет собой сложный и неоднозначный процесс. По мнению абсолютного большинства исследователей, существуют значительные трудности и особенности в создании условий, благоприятных для индивидуальных первичных культур опухолевых клеток. Выживание клеток и их пролиферация возможны только лишь при воссоздании всех внешних условий, которые клетки имели in vivo.

Таким образом, применение сочетанного использования ВБН с аутологичными вакцинами на основе белков теплового шока не было известно и предложено заявителями впервые.

Сущность изобретения

Сущностью настоящего изобретения является разработка комплексного метода лечения новообразований различного рода, который обеспечивает, с одной стороны, формирование специфического иммунного ответа против опухоли, а с другой - формирует дополнительную стимуляцию неспецифического иммунитета, а также вносит дополнительный вклад в цитолитическую активность проводимой терапии.

Поставленная задача решается описываемым способом лечения злокачественных новообразований, включающим введение вакцины, представляющей собой комплекс "белки теплового шока-опухолевый пептид", выделенные из опухолевой ткани пациента, в комбинации с введением авирулентных штаммов вируса болезни Ньюкасла в эффективных количествах как в течение курса вакцинации, а также после вакцинации на рекомендованный врачом период.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Одним из необходимых терапевтических методов лечения опухолей является поддержание иммунной системы пациента на уровне, необходимом для защиты от роста и пролиферации опухолевых клеток. Известно, что иммунная система обладает возможностями проявлять как неспецифическую иммунную защиту, так и развивать специфический иммунный ответ против конкретного вида опухоли. В связи с этим одним из важнейших направлений терапии онкологических заболеваний является поиск возможностей для формирования как специфического противоопухолевого иммунитета, так и поддержания адекватного уровня неспецифического иммунитета в организме больного.

Современная терапия опухолей основана на применении аутологичных вакцин, способных стимулировать специфический противоопухолевый иммунный ответ. Согласно многочисленным данным, наибольшей противоопухолевой, иммуномодулирующей эффективностью обладают аутологичные вакцины на основе белков теплового шока (HSP) (Gordon et al., 2004; Casey et al., 2003;. Mazzaferro et al., 2003; Janetzki et al., 2000; Manjili et al., 2002). Использование HSP-вакцин обладает огромным преимуществом перед другими противоопухолевыми вакцинами. HSP являются белками, отвечающими за структуру других белков, в том числе и тех, которые отвечают за выживание клеток. В опухолях HSP никогда не мутируют, так как отвечают за сохранение структуры других белков, - многочисленных антиапоптотических факторов, необходимых опухоли для выживания. Они стабилизируют их структуру, формируя с ними комплексы. Среди таких белков многие обладают антигенными свойствами. Выделение этих комплексов из опухолевой ткани и введение назад пациенту формирует специфический иммунитет против того вида опухоли, из которых комплексы были выделены (Binder, 2008; Strbo & Podack, 2008). В этом и состоит смысл аутологичной вакцинации. По данным клинических испытаний, эффективность от аутологичных вакцин превышает остальные виды вакцинации и составляет около 75% удачных эпизодов (http://www.brucerobinson.com.au). Объяснение такой высокой эффективности довольно простое: опухолевые антигены, образующие комплексы с HSP, представляют собой широкий спектр антигенного состава. Поэтому и сила иммунного ответа, индуцируемая такими комплексами, довольно высока.

Таким образом, применение аутологичных вакцин обладает огромным преимуществом по сравнению с другими противоопухолевыми вакцинами. Однако этот подход имеет определенные ограничения, поскольку аутологичная вакцинация а priori предполагает наличие у пациента определенного уровня активности иммунной системы. Зачастую иммунитет у онкологических пациентов довольно слабый, что является ограничением для применения к таким пациентам противоопухолевой иммунотерапии.

Указанные недостатки, которые наблюдаются при использовании аутологичных вакцин как монопрепаратов, можно решить, используя дополнительные факторы, обладающие стимуляцией неспецифического иммунного ответа, повышающие уровень HSP в опухолевых клетках, а также обеспечивающие дополнительную, цитолитическую активность в отношении опухолей. Это достигается использованием т.н. адъювантов, среди которых наибольший интерес вызывают онколитические вирусы, успешно сочетающие в себе эти три функции.

Применение вирусов, обладающих онколитическим потенциалом в отношении опухолевых клеток, известно давно (Shoham et al., 1990; Ring, 2002). Данные, описывающие онколитический потенциал вирусов, получены как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Довольно безопасным для организма человека и в то же время наиболее активным с точки зрения онколитического потенциала в отношении опухолей является вирус болезни Ньюкасла (ВБН). Данный вирус принадлежит к семейству Rubulavirus (Paramyxoviridae). ВБН является довольно сильным патогеном, серьезно поражающим респираторный тракт и нервную систему. Однако существуют штаммы вируса, «адаптированные» к тканевым культурам, которые обладают низкой вирулентностью и одновременно с этим сильным онколитическим потенциалом, что подтверждено в ряде работ (Von Hoegen et al., 1988; Lorence et al., 1988).

Наиболее важная характеристика онколитических вирусов - это тот факт, что вирус более активно размножается в опухолевых клетках, чем в нормальных. Интегрирование вируса в опухолевую клетку стимулирует формирование двухспиральной РНК, - потенциального стимулятора PKR, - протеинкиназы, которая ингибирует синтез белка и коммитирует клетку к апоптозу. Если вирус интегрируется в нормальную клетку - PKR стимулирует в ней экспрессию интерферонов, что защищает нормальные клетки от вирусной репликации. Опухолевые клетки зачастую имеют дефектный механизм PKR-активности, что создает благоприятные условия для размножения РНК-содержащих вирусов (Russell SJ, Peng, 2007).

Кроме вышеописанных особенностей, вирусы, обладающие онколитическим потенциалом, имеют на своей поверхности специфический набор белков, которые могут повышать аффинность взаимодействия с опухолевыми рецепторами, что также облегчает проникновение вируса в опухолевую клетку. Все указанные особенности присущи ВБН, что делает его привлекательным как в плане стимулятора иммунитета, так и дополнительного цитолитического фактора. Кроме того, ВБН обладает способностью выступать в качестве иммуноадъюванта, поскольку стимулирует активность Т-лимфоцитов, индукцию цитокинов, RANTES, IL-10, а также TNF-a. Последний является фактором, стимулирующим Т-хелперную активность, что, с одной стороны, способствует повышению неспецифического иммунитета, а с другой - формирует прецедент для специфической иммунной защиты.

Существенным недостатком аутологичной вакцинации, связанной с использованием собственных опухолевых тканей пациента, является ограничение, связанное с количеством опухолевой ткани, которая используется как «сырье» для изготовления вакцины. Поэтому этот недостаток необходимо свести к минимуму. Показано, что вирус болезни Ньюкасла, попадая в опухоль, стимулирует экспрессию стрессовых белков, в частности HSP70 (Collins & Hightower, 1982). Это обстоятельство способствует решению проблемы, связанной с ограничением опухолевого материала для приготовления аутологичной вакцины: дооперационная стимуляция организма пациента вирусом болезни Ньюкасла способствует повышению экспрессии HSP в опухоли, что повышает их уровень, а значит, позволяет получить большее количество комплексов «HSP-опухолевый пептид» из того же количества опухолевой ткани.

Таким образом, выбор ВБН в качестве адъюванта при иммунотерапевтическом лечении опухолей, в том числе и на фоне аутологичной вакцинации, представляется вполне оправданным.

Краткое описание фигур чертежей

Фиг 1 - результаты клинических исследований эффективности использования аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.

Фиг 2 - результаты клинических исследований эффективности использования онколитического вируса болезни Ньюкасла.

Фиг.3 - сравнительная характеристика эффективности лечения противоопухолевой терапии на основе ВБН и его сочетания с аутологичной вакциной.

Фиг 4 - иммунологическая характеристика терапевтической эффективности сочетанного использования аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.

Примеры осуществления изобретения

Ниже приведены примеры активации специфического противоопухолевого иммунитета, не ограничивающие объема изобретения.

Пример 1. Оценка использования аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.

Применяемый препарат вируса болезни Ньюкасла изготавливался из живого вируса апатогенного штамма La-Sota (серия номер 41, контроль номер 41, сертификат соответствия: № РОСС RU. ФВ. В16890 7521468), выращиваемого в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Для инъекций пациентам вирус очищали ультрацентрифугированием и проверяли на стерильность и безвредность. Оценка токсичности препарата (вакцины) проводилась в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ.

Аутологичную вакцину на основе белков теплового шока получали, используя обогащенную фракцию белков теплового шока, полученную из опухолевой ткани пациента до операции.

Цель данного исследования: оценить объективный непосредственный эффект и его продолжительность, время до прогрессирования, выживаемость, качество жизни больных с различными злокачественными заболеваниями при использовании аутологичных вакцин у пациентов, престимулируемых ВБН.

При проведении комбинированного лечения с включением курсов адъювантной химиотерапии и при показаниях лучевой терапии в течение 6 месяцев лечения 36 больных получили аутологичную вакцину на фоне предварительной стимуляции ВБН (от 8 до 16 внутрикожных введений).

Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии.

Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной вакцины в комплексе с престимуляцией вирусом болезни Ньюкасла вакцины приведены на Фиг 1. Исчезновение всех опухолевых очагов получено у 7 больных (19,4%), из них пациентов с раком молочной железы - 2, толстой кишки - 2, меланома влагалища - 1, рак яичников - 2. Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из раннее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями, включающими компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печени, легких, костях и в лимфатических узлах намечалась после второго курса комплексного лечения и завершалась полным их исчезновением на 5-6 курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта составляет 11 месяцев (от 4 до 26 мес).

Частичный ответ (уменьшение измеряемых очагов на 30 % и более) получен у 13 больных (36 %). Это пациенты с меланомой кожи (2), рак молочной железы (6), увеальная меланома (2), яичников (1) и рак толстой кишки (2). Стабилизация процесса наблюдалась у 13 пациентов (36%) (меланома кожи - 5, увеальная меланома - 2, рак молочной железы - 4, рак толстой кишки - 1, рак яичников - 1). Прогрессирование процесса (увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага) наблюдалось у 3 больных (8,3%). Это пациенты с раком молочной железы (1) и меланомой кожи (2). Средняя продолжительность эффекта составила 11,7 месяцев.

Пример 2. Оценка противоопухолевого эффекта от применения ВБН.

Применяемый препарат вируса болезни Ньюкасла изготавливался, как описано в предыдущем примере. Полный ответ получен у 19 (28,3%) больных: рак молочной железы (7) и толстой кишки (2), рак яичников (2) и шейки матки (2) и 6 больных с увеальной меланомой. Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из раннее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями, включающими компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печени, легких, костях и в лимфатических узлах намечалась после второго курса комплексного лечения и завершалась полным их исчезновением на 5-6 курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта составляет 11 месяцев (от 4 до 26 мес).

Частичный ответ от терапии наблюдался у 18 (26,8%). Из них пациентов раком молочной железы было 9, меланомы кожи - 6, шейки матки -1 и яичников - 2. Средняя продолжительность эффекта составила 11,7 месяцев.

Стабилизация процесса наблюдалась у 16 пациентов (23.8%). Это пациенты с меланомой кожи - 3, увеальная меланома - 1, рак молочной железы - 6, рак толстой кишки - 2, рак яичников - 1, рак шейки матки - 1.

Прогрессирование процесса наблюдалось у 14 больных: меланома кожи - 3 пациента, увеальная меланома - 1, рак молочной железы - 6, толстой кишки - 1, шейки матки - 1, яичников - 1.

Необходимо учитывать тот факт, что большинство больных имели диссеминированные формы опухолей, резистентные к лучевой и химиотерапии при наличии растущих множественных метастазов, поражающих не один орган.

Пример 3. Сравнительная характеристика эффективности лечения противоопухолевой терапии на основе ВБН и его сочетания с аутологичной вакциной.

Эффект, направленный на улучшение показателей противоопухолевой терапии, проведенный с использованием сочетанного иммунотерапевтического подхода на основе HSP-вакцины и ВБН, в сравнении с применением одного ВБН, представлен на диаграммах (Фиг.3А, Фиг 3Б). Показано, что применение аутологичной вакцины в сочетании с ВБН способно инициировать специфический противоопухолевый эффект (стабилизация, частичный регресс, полный регресс) в сравнении с онколитическим ВБН в чистом виде, что делает сочетанный метод лечения наиболее предпочтительным.

Пример 4. Оценка специфического иммунного ответа, индуцированного под действием сочетанного использования HSP-вакцины и ВБН.

Показателем эффективности иммунотерапевтического воздействия на организм является образование особого пула иммунокомпетентных клеток, относящихся к цитотоксическим Т-лимфоцитам (фенотип CD3+CD8+). Данный фенотип клеток появляется в сыворотке пациента только при воздействии специфического антигена. Повышение уровня CD8+ Т-лимфоцитов после введения вакцины на основе HSP пациенту, предварительно престимулированному ВБН, свидетельствует о формировании специфического противоопухолевого иммунитета.

Сочетанное использование HSP-вакцины и ВБН проведено на 8 пациентах (средний возраст 50 лет) с диагнозом рак молочной железы. Во всех случаях, кроме одного, получена стимуляция специфического иммунного ответа, показателем которого является повышение уровня CD3+CD8+ Т-лимфоцитов (Фиг4). Только у одной пациентки (П5) уровень CD3+CD8+ Т-лимфоцитов практически не изменился.

На фоне увеличения уровня цитотоксических лимфоцитов у пациентов отмечалось улучшение общего самочувствия, а также основных клинических показателей. Полученные данные позволяют заключить, что проведенное иммунотерапевтическое лечение является необходимой составляющей противоопухолевой терапии, а сочетание иммуностимулирующего, онколитического, HSP-стимулирующего действия введенного сочетания вакцины и адъюванта позволяет формировать стойкий противоопухолевый иммунитет.

Литература

Binder RJ. Heat-shock protein-based vaccines for cancer and infectious disease. Expert Rev Vaccines. 2008 Apr; 7(3):383-393.

Casey DG, Lysaght J, James T, Bateman A, Melcher AA, Todryk SM. Heat shock protein derived from a non-autologous tumour can be used as an anti-tumour vaccine. Immunology. 2003 Sep; 110(1):105-ll.

Collins PL, Hightower LE. Newcastle disease virus stimulates the cellular accumulation of stress (heat shock) mRNAs and proteins. J Virol. 1982 Nov; 44(2):703-7.

Gordon NF, Clark BL. The challenges of bringing autologous HSP-based vaccines to commercial reality. Methods. 2004 Jan; 32(1):63-9.

http://www.brucerobinson.com.au/detailed%20protocol-HSP.htm

Janetzki S, Palla D, Rosenhauer V, Lochs H, Lewis JJ, Srivastava PK. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96 preparations: a pilot study. Int J Cancer. 2000 Oct 15; 88(2):232-8.

Liang W, Wang H, Sun TM, Yao WQ, Chen LL, Jin Y, Li CL, Meng FJ. Application of autologous tumor cell vaccine and NDV vaccine in treatment of tumors of digestive tract. World J Gastroenterol. 2003 Mar; 9(3):495-8.

Lorence RM, Rood PA, Kelley KW. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent: induction of tumor necrosis factor-alpha and augmentation of its cytotoxicity. J Natl Cancer Inst. 1988 Oct 19; 80(16):1305-12.

Manjili MH, Wang XY, Park J, Facciponte JG, Repasky EA, Subjeck JR. Immunotherapy of cancer using heat shock proteins. Front Biosci. 2002 Jan 1; 7:d43-52

Mazzaferro V, Coppa J, Carrabba MG, Rivoltini L, Schiavo M, Regalia E, Mariani L, Camerini T, Marchiano A, Andreola S, Camerini R, Corsi M, Lewis JJ, Srivastava PK, Parmiani G. Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2003 Aug 15; 9(9):3235-45.

Mosolits S, Nilsson B, Mellstedt H. Towards therapeutic vaccines for colorectal carcinoma: a review of clinical trials. Expert Rev Vaccines. 2005 Jun; 4(3):329-50.

Ring CJ. Cytolytic viruses as potential anticancer agents. J Gen Virol. 2002 Mar; 83(Pt 3):491-502.

Russell SJ, Peng KW. Viruses as anticancer drugs. Trends Pharmacol Sci. 2007 Jul; 28(7):326-33.

Schlag P, Manasterski M, Gerneth T, Hohenberger P, Dueck M, Herfarth C, Liebrich W, Schirrmacher V. Active specific immunotherapy with Newcastle-disease-virus-modified autologous tumor cells following resection of liver metastases in colorectal cancer. First evaluation of clinical response of a phase II-trial. Cancer Immunol Immunother. 1992; 35(5):325-30.

Shoham J, Hirsch R, Zakay-Rones Z, Osband ME, Brennert HJ. Augmentation of tumor cell immunogenicity by viruses-an approach to specific immunotherapy of cancer. Nat Immun Cell Growth Regul. 1990; 9(3):165-72.

Strbo N, Podack ER. Secreted Heat Shock Protein gp96-Ig: An Innovative Vaccine Approach. Am J Reprod Immunol. 2008 May; 59(5):407-16.

Von Hoegen P, Weber E, Schirrmacher V. Modification of tumor cells by a low dose of Newcastle disease virus. Augmentation of the tumor-specific T cell response in the absence of an antiviral response. Eur J Immunol. 1988 Aug; 18(8):1159-66.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения злокачественных новообразований, включающий введение аутологичной вакцины, представляющей собой выделенные из опухолевой ткани пациента белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами, отличающийся тем, что до начала лечения аутологичной вакциной вводят онколитический атеннюированный вирус болезни Ньюкасла в качестве адъюванта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что злокачественное новообразование выбирают, например, из группы: рак прямой кишки, меланома, рак молочной железы, рак яичников.

www.freepatent.ru

Способ профилактики болезни ньюкасла

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и вирусологии. Способ включает аэрозольную обработку цыплят вакциной. При этом цыплят обрабатывают вакциной, полученной путем множественного заражения куриных эмбрионов материалом, содержащим вирус болезни Ньюкасла, отбора эмбрионов, выживших до 19-дневного возраста, их убоя путем охлаждения, подготовки вирусной суспензии из их хориоаллантоисной жидкости и печени и выделения из нее дефектных интерферирующих вирионов. Способ является надежным и безопасным методом вакцинации птиц. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, точнее к ветеринарной иммунологии и вирусологии, в частности к способам иммунизации домашней птицы, преимущественно кур, против болезни Ньюкасла.

Болезнь Ньюкасла (псевдочума птиц) это наиболее распространенная высококонтагиозная вирусная инфекция домашней птицы, наносящая птицеводству огромный экономический ущерб. Для предотвращения этой болезни используются различные профилактические воздействия.

В частности, для указанной цели используют различные лекарственные средства (RU 2118163, 1994; SU 1805967, 1993), прединкубационную обработку эмбрионов кур лазерным облучением (кроме того, при таком способе иммунизации остаются без защиты цыплята первых дней жизни; 3212903, 1999) и т.п.

Однако применение лекарственных средств не обеспечивает достаточно полную защиту, поэтому основным методом профилактики заболевания является вакцинация птиц. В настоящее время для специфической профилактики псевдочумы птиц применяют вакцины двух типов: живые (FR 2388564, 1978; FR 2357256, 1978; WO 90/06131, 1990; SU 326584, 1979) и инактивированные (GB 1170508, 1977; RU 2035917, 1992). Имеющиеся разработки в отношении живых вакцин представляют собой большое число композиций, в состав которой входит вируссодержащий материал и вспомогательные добавки, обеспечивающие его эффективность при различных методах применения (RU 2153356, 1999; RU 2259844, 2004; RU 2236255, 2003; RU 1124585, 1982). Однако известные схемы иммунизации не в достаточной степени стимулируют необходимый уровень антител для создания напряженного иммунитета. Установлено, что одним из осложняющих факторов при этом является наличие у вакцинируемых цыплят материнских антител, ингибирующих размножение вакцинного вируса в организме и тем самым препятствующих формированию напряженного иммунитета. Если же иммунизацию проводить в возрасте 1-3 недели, когда уровень материнских антител значительно снижен, то при аэрозольной форме введения у цыплят, не имеющих материнских антител, может проявляться острая реакция на вакцинацию в виде респираторных симптомов (кашель, насморк, катар и т.д.). Кроме того, иммунизация цыплят старшего возраста активизирует латентные инфекции, подавляет рост цыплят, что при массовом разведении птицы может привести к существенным потерям.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ профилактики болезни Ньюкасла путем аэрозольного введения суточным цыплятам живой вакцины из лентогенного (например, шт. Ла-Сота) или мезогенного штаммов в сочетании с иммуномодулятором на основе минерального и растительных масел (ЕР 0292293, 1988). Недостатком известного способа является возможность прорыва иммунитета у вакцинированной птицы, а также необходимость принятия защитных мер при работе с вируссодержащим материалом.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание более надежного и безопасного метода вакцинации птиц.

Было найдено, что указанная задача может быть решена созданием способа вакцинации на основе введения препарата, в котором в качестве вируссодержащего начала используют дефектные интерферирующие вирионы болезни Ньюкасла.

Дефектные интерферирующие вирионы (дичвирионы) были обнаружены в 1950 г. американским вирусологом von Magnus, который обратил внимание на то, что при заражении куриных эмбрионов очень большой дозой вируса гриппа в их организме накапливаются вирусные частицы, которые сохраняли гемагглютинирующую активность, но теряли инфекционность. Если препарат из таких частиц вводили мышам, то у выживших животных возникала длительная резистентность к острой форме экспериментального гриппа. Биофизиками методом центрифугирования в градиенте плотности из вирусных популяций были получены препараты «дефектных интерферирующих частиц» (ДИЧ), [defective interfering particles, DIP] и «стандартных», «полноценных» вирионов. Геном у первых оказался меньше, чем у вторых (Huang, A.S. and Baltimore, D. Defective viral particles and viral disease process. Nature 1970. 226:325-327).

К настоящему времени ДИЧ найдены почти у всех групп вирусов животных и растений, а также у бактериофагов, что указывает на универсальный характер этого явления. Они обнаружены практически у всех РНК-содержащих вирусов животных. Высокие концентрации ДИЧ находят в живых аттенуированных вакцинах, и, следовательно, могут иметь значение для эффективности их, однако вопросы практического применения ДИЧ до настоящего времени не рассматривались.

Нами было высказано предположение, что дефектные интерферирующие вирионы, поскольку, несмотря на их геномную ущербность, генетически полноценны и способны успешно репродуцироваться в пермиссивных клетках, обуславливая адаптивный иммунитет организма. При этом в организме птицы будет наблюдаться гомологичная интерференция, механизм которой возможно состоит в том, что дичвирионы непосредственно занимают в цитоплазме определенную экологическую нишу, общую с гомологичными «стандартными» вирионами, конкурируют с последними за РНК-полимеразу в основном на стадии репликации вирусной нуклеиновой кислоты и имеют при этом селективные преимущества («место занято»).

Кроме того, дичвирионы РНКвирусов, благодаря защищенности от рибонуклеаз, активно стимулируя клетки на продукцию цитокинов, являются мощными индукторами интерферонов, что обеспечивает дополнительную защиту птиц от инфекции. Нами было установлено, что уже через 2 часа инкубации инфицированных вирусом болезни Ньюкасла лимфоцитов в среде появляются интерфероны, концентрация которых достигает максимума через 5 часов и удерживается обычно в течение 24 - 48 часов.

Таким образом, техническая задача решается путем аэрозольного введения цыплятам вакцины, содержащей дефектные интерферирующие вирионы болезни Ньюкасла, полученной путем множественного заражения куриных эмбрионов материалом, содержащим вирус болезни Ньюкасла, отбора эмбрионов, выживших до 19-дневного возраста, их убоя путем охлаждения, подготовки вирусной суспензии из их хориоаллантоисной жидкости и печени и выделения из них дефектных интерферирующих вирионов.

Препарат оптимально вводить цыплятам аэрозольно не менее чем за сутки до даты возможного заражения.

Пример 1. Приготовление препаратов дичвирионов и их испытания

Было получено два препарата дичвирионов: один - из вирус-вакцины «B1», второй - из изолята «Vin 07».

Биопрепарат дичвирионов из вируса Bi

Селекцию дичвирионов проводили по признаку устойчивости к «множественному заражению» на хориоаллантоисную оболочку 7-дневных КЭ (стадия предплода) в 3-х пассажах по десяти яиц в каждом. Вирус-вакцину сухую разводили 1:10 и инокулировали на ХАО 7-дневного КЭ в объеме 0,1 мл («множественное заражение»). Яйца инкубировали при 37°С. Для дальнейших опытов отбирали эмбрионы, выживавшие до 19-дневного возраста, и убивали путем охлаждения. От них получали хориоаллантоисную жидкость и печень, из которых готовили вируссодержащую суспензию. Подобная биофильтрация вируса оказалась достаточной, чтобы получить препарат дичвирионов, который обладал гемагглютинирующими свойствами до титра 1:512, гемолизировал эритроциты, сохранял антигенное родство с исходным вирусом (РЗГА) и был апатогенным для всех КЭ в стадиях предплода и плода.

Биопрепарат дичвирионов из изолята Vin 07

Препарат дичвирионов из изолята Vin 07 был получен нами путем 5 пассажей на КЭ 7-дневных КЭ методом инфицирования на ХАО, что обеспечило стабильность свойств препарата. Эти свойства оказались сходными со свойствами препарата дичвирионов из штамма В1, что позволяет нам дать им единое описание.

Безвредность препаратов дичвирионов

Патогенностъ препаратов дичвирионов для однодневных КЭ (стадия зародыша) была изучена путем инокуляции вируссодержащего материала в латебру в дозе 0,05 мл. В результате исследований было найдено, что инфицированные зародыши замирают в течение 48 ч и выглядят как непрозрачный слой зародышевых клеток в виде запятой, окруженный прозрачной зоной ферментации. Общий диаметр зародыша 8-10 мм. Кровяных островков не было.

Патогенность препаратов дичвирионов для 4-дневных зародышей была испытана путем инокуляции неразведенного вируссодержащего материала в желток в дозе 0,05 мл. В результате было найдено, что нарушений в развитии эмбрионов на этой стадии в течение 24 ч не было, а затем их рост замедлился, хотя они продолжали жить еще 3-5 дней и замирали. Таким образом, следует считать, что дичвирионы вызывают дистрофические изменения у зародышей, приводящие к летальному исходу.

Безвредность препаратов дичвирионов для КЭ в стадии предплода и плода.

Безвредность препарата для 7-дневных КЭ (стадия предплода) была испытана интравазальным методом, т.е. путем нанесения вируссодержащего материала на ХАО в месте образования искусственной пуги, и для 11-дневных КЭ (стадия плода) методом инфицирования в ХАП. В результате было найдено, что эмбрионы оставались здоровыми вплоть до вывода цыплят. Таким образом, показано, что препараты дичвироны вируса НБ безвредны для КЭ в стадии предплода и плода.

Кроме того, исходные вирусы и дичпрепараты из них были проверены на гемолитические и гемагглютинирующие свойства, содержание нейраминидазы, инфекционность и болезнетворность. Результаты исследований суммированы в таблице 1.

Приведенные материалы позволяют заключить, что препараты дичвирионов из вируса НБ лентогенного типа могут быть патогенами для КЭ в стадии зародыша, но являются апатогенными для КЭ в стадии предплода и плода.

Исследование реакции гомологичной интерференции дичвирионов (РГИ) показали, что положительная РГИ со стороны дичвирионов в отношении тест-вируса выражалась в том, что видимых патологических изменений у подопытных КЭ в стадии плода не находили. Цыплята выводились вполне жизнеспособными, а при их вынужденном убое и вскрытии паренхиматозные органы выглядели «нормальными».

Было найдено, что уже через 24 ч после иммунизации 7-дневного КЭ в 25% случаев предплоды становились невосприимчивыми к тест-вирусу, а через 48 ч этот показатель увеличивался до 50%, но даже 72 ч период иммунизации был недостаточен для развития полной иммуноадаптации. Об этом можно было судить по патологоанатомической картине изменений печени, поверхность которой была покрыта как бы мельчайшими очажками гиперемии, которые чередовались с серыми очажками точечного некроза. При патологогистологическом уточнении характера патологического процесса были обнаружены очажки капилляроза (как мы считаем, пула иммуннокомпетентных клеток-мишеней, содержащих дичвирионы) и зеленовато-серые пропитанные желчью очажки клеток в состоянии деструкции.

Рассчитанная нами по результатам опытов кинетика интерферирующей защиты 90% привитых дичпрепаратом эмбрионов (КЗ50), при иммунизации в 7-дневном возрасте и тестировании в 12-дневном, составляет 120 ч.

Пример 2. Для определения конечного разведения дичпрепарата, которое еще создает адаптивный иммунитет, проводили титрование препаратов дичвирионов. Титрование проводили с помощью РГИ на чувствительных тест-системах, например на куриных эмбрионах (биопроба). Поскольку количество дичвирионов в препарате неизвестно и оно в процессе инкубации инфицированных КЭ должно увеличиваться, а взаимодействие дичвириона с тест-вирусом опосредовано через клетку, то развитие такой трехчленной живой тест-системы весьма динамично и результат во многом зависит от стандартизации всех входящих в нее компонентов. Поэтому дичпрепараты титровали следующим образом.

1. Все пробы до титрования хранят в холодильнике (+4°С), но не более одной недели, иначе титр дичвирионов снижался. При необходимости длительного хранения проб их замораживали при -70°С.

2. Готовили ряд последовательных десятикратных (10-1, 10-2, 10-3 и т.д.) разведений испытуемого препарата дичвирионов. Количество разведений должно быть тем больше, чем выше предполагаемый титр. Для каждого разведения под опыт брали не меньше 4-х КЭ, иначе статистически рассчитываемая величина титра могла иметь слишком большую погрешность.

3. РГИ ставили в два этапа: вначале КЭ в возрасте 7-дней иммунизировали препаратом в 10-кратных разведениях в количестве 0,1 мл на ХАО, а затем в 12-дневном возрасте, заражали тест-вирусом в ХАП в дозе 100 ЭЛД50/0,1 мл.

4. Промежуток времени между инфицированием КЭ дичпрепаратом и заражением тест-вирусом постоянно - 120 ч (хотя для разных вирусов он разный).

5. Результат РГИ учитывали через 72 ч после заражения плодов КЭ тест-вирусом. За положительную реакцию принимали отсутствие гибели эмбрионов, а за отрицательную - замирание их.

6. За титр дичвирионов принимали наибольшее разведение дичпрепарата, вызывавшее общую защиту КЭ, рассчитанную по 50% эффекту (например, по методу Рида и Менча) и выраженную в виде десятичного логарифма.

7. В случае замирания КЭ, зараженных тест-вирусом в 12-дневном возрасте (отрицательная РГИ), считали, что интерферирующая активность дичпрепарата недостаточная.

Таким образом, в случае положительной РЭ эмбрионы развиваются нормально и выводятся цыплята. Если дичвирионы не успевают «занять место» в пермиссивных клетках, то возникает только локальный адаптивный иммунитет, что позволяет тест-вирусу репродуцироваться в незащищенных клетках, вызывая микроинфаркты в миокарде и микронекрозы в печени. При этом плод болеет, но остается живым, за счет заместительного восстановления специфической ткани. В случае отрицательного результата РГИ развивается литический вироз от патвирионов тест-вируса. Патологоанатомическая картина вироза характерна и позволяет оценивать и титровать препараты дичвирионов по их активности.

Пример 3. Вакцинный препарат использовали для профилактики НБ в условиях опытной базы НИИ птицеводства, распыляя ее в помещении, объемом 30 куб м с помощью генератора ВАГ-2 в течение 20 мин со скоростью 10 мл/мин. Напряженность поствакцинального иммунитета определяли через 28 суток после вакцинации. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Полученные результаты показали, что заявляемая вакцина перспективна для профилактики болезни Ньюкасла у птиц.

1. Способ профилактики болезни Ньюкасла, включающий аэрозольную обработку цыплят вакциной, отличающийся тем, что цыплят обрабатывают вакциной, полученной путем множественного заражения куриных эмбрионов материалом, содержащим вирус болезни Ньюкасла, отбора эмбрионов, выживших до 19-дневного возраста, их убоя путем охлаждения, подготовки вирусной суспензии из их хориоаллантоисной жидкости и печени и выделения из нее дефектных интерферирующих вирионов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аэрозольную обработку цыплят вакциной осуществляют не менее чем за сутки до даты возможного заражения.

www.findpatent.ru

Ньюкаслская болезнь - Заразные болезни - Инфекционные

Сведения о возбудителе. Вирус впервые выделил Кранвельд (1927) и описал Доил (1940).

Морфология и химический состав. Размер вирионов от 120 до300 нм. Оболочка вирионов имеет выступы нити длиной 8 нм и содержит АГ-компоненты. Внутренний компо­нент - нуклеокапсид (G-АГ) представляет собой длинную заостренную пуговку диаметром 13 нм. Структурные единицы - протеины этой трубки (капсомеры) расположены по спирали вокруг центральной оси, внутри них находится РНК. Определен полный геномвируса (12492 основания), выяснена степень структурной однородности у разных штаммов методом "фингерпринта"(отпечатков пальцев). Оказалось, что РНК велогенных штаммов в США (Са-1083 Фонтана и Ларго) обнаружила высокий уровень структурной однородности. Наоборот, при сравнении "фингерпринта" олигонуклеотидов РНК шт. Фонтана и Техас GB выявлена наименьшая степень однородности .

Как патогенные, так и апатогенные штаммы вируса НБ содержат 6 полипептидов: Z, HN, F, M, NP и полипептид с мол. м. 47000 Д. В составе вируса обнаружены 3 основных и 5 минорных белковых компонентов. В какой степени они соответствуют 6 вышеуказанным полипептидам неизвестно. К основным относятся гемагглютинин, белок внутренней оболоч­ки и белок РНП. Нейраминидаза - один из минорных компонентов. Кроме этого, в вирионах вируса НБ обнаружена эндорибонуклеаза, а в вирусе, полученном из хронически инфициро­ванных клетокZ, РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). Возможно, имеется связь между наличием обратной транскриптазы и способностью вируса вызывать хронически протекающую инфекцию. Очищенный нуклеокапсид не обладает РНК-полимеразной активностью, так как не содержит необходимых белков, либо в процессе приготов­ления препарата нуклеокапсидов инактивируется сам энзим.

Вирионные и целлюлярные полипептиды, обладающие одинаковой электрофоретической подвижностью, идентичны. Неспецифичный вирусный гликопротеин Fo, обнаружен­ный только в зараженных клетках, родствен малому вирионному гликопротеиду F. Поли­пептид NP (мол.м.53 000) из зараженных клеток родственен нуклеокапсидному белку NP. В сумме мол. м. 6-и вирусных полипептидов равна 491000 Д, что соответствует максимальной кодирующей способности геномавируса НБ. Белок Fo играет основную роль в вирулентно­сти вируса. Он синтезируется в виде неактивного предшественника - белка Fo и расще­пляется трипсиноподобным ферментом в трансмембранных комплексах Гольджи на 2 субъ­единицы F1 и F2. Это необходимо для проявления инфекционности и составляет сущность протеолитической активации вируса.

Устойчивость. Инфекционность, гемагглютинирующая активность и иммуногенность вируса разрушаются при 56°С в период 5 мин - 6 ч. При 37°С эти изменения наступают че­рез несколько часов и даже дней, при 20 и 8°С для утраты вирусом своей биологической ак­тивности нужны месяцы и даже годы. Вирус устойчив к низкой температуре, в заморожен­ном состоянии активность его сохраняется более 2-х лет. Нет корреляции между уровнем вирулентности и ГА-активности штаммов вируса при прогревании. Вирус устойчив к рН в диапазоне от 2 до 10, быстро разрушается при воздействии ультразвука. Р-ры формалина (1-2%-ные), гидроксида натрия (1-2%-ные), мыльного крезола (1%-ный) и фенола(3-4%-ные) его быстро убивают. Стабильность вируса в значительной мере зависит от среды, в которой он находится Под воздействием дневного света инфекционность его снижается за 4 ч на 3-5 lg ГА свойcтва сохраняются при более длительной инактивации, чем инфекционные. Установлено, что висцеротропные велогенные штаммы обладают термочувствительным, а лентогенные - тер­мостабильным ГА, т.е. вирулентность штаммов прямо не связана с термостабильностью ГА.

Антигенная структура. Вирус содержит гемагглютинин инейраминидазу, М-, F-белки и S (РНП) - антигены, различающиеся по локализации в вирионе, иммуногенности и АГ-активности. Каждый вирион содержит определенное число идентичных молекул HN, каждая молекула HN содержит 2 домена' НА и NA.Каждый домен содержит идентичные или от­личные друг от друга АГ-детерминанты(эпитопы). В молекуле F-протеина выявлено 4 различных АГ-сайта. AT к сайтам 1,2 и 3 предотвращают вирус индуцированный ге­молиз эритроцитов птиц. AT к сайту 4 ингибируют или гемолиз, или разрушение клеток АГ-активность F-протеина высококонсервативна, поэтому рекомбинантные штаммы, экспрессирующие белок F,желательны в качестве кандидатов для живых вакцин. Кроме того, при вакцинацииптицы белком F можно легко дифференцировать иммунный ответ, индуци­рованный вакцинацией, от иммунного ответа, связанного с инфекцией. В противополож­ность F-белку, ГА и нейраминидаза обладают выраженной АГ-изменчивостью. Различия в вирулентности штаммов вируса НБ связаны с изменением в структуре HN-гена,кодирующего ГА-нейраминидазу. Большинство аминокислотных замен располагается в четырех участках N-конца HN-белка. Имеются, свидетельства о связи вирулентности вируса НБ с расщеплением гликопротеина слияния (белка Fo) клеточными протеазами, или изменением других свойств белков F и HN.

Антигенная активность. Гликопротеидный ГА-нейраминидазный комплекс вируса (шт. La-Sota) обладает выраженной АГ- и протективной активностью на курах. Большинст­во исследованных клонов монАТ против ГА-нейраминидазы вируса НБ в равной степени вызывают оба варианта слияния.

Антигенная вариабельность и родство. Подавляющее большинство полевых и вак­цинных штаммов вируса НБ в АГ- и иммунобиологическом отношениях сходно. Некоторые природно-ослабленные штаммы (F, Bl, La Sola, КД, Beaudette,Бор/74/ВГНКИ и др.) широ­ко используют в качестве живых вакцин. Установлено различие природных штаммов не только в вирулентности, но и значительное различие в тропизме к нервной, легочной и энтеральной тканям. Показано, что при серийном пассировании (37°С, 120 ч) не разведенного вируса НБ в КЭ продуцируется избыточное количе­ство ГА; образование "неинфекционных" частиц является, следствием множест­венной инфекции клеток; неинфекционный ГА формируется в результате интерференции при созревании активного вируса с вирусом неполным, инфекционность вируса более чувст­вительна к термальной инактивации, чем его ГА-активность.

Локализация вируса. Вирус локализуется в паренхиматозных органах, костном и го­ловном мозге, мышцах, трахеальной слизи, толстом и тонком кишечниках, содержится в различных выделениях. В период выраженной клинической картины болезни в изобилии выделяется во внешнюю среду с фекалиями, трахеальной слизью и выдыхаемым воздухом Вирус, как правило, можно выделить только в начале болезни. Переболевшие птицы могут долго быть вирусоносителями. В организме неиммунных птиц вирус НБ обнаруживался через 24-48 ч и далее в течение 10 дн во всех органах и тканях. У иммунных или частично иммунных птиц наиболее продолжительное время (19 дн) вирус выделяли из железистого желудка, лимфоидных образований слепой кишки, фабрициевой сумки и мозга. Поскольку ни один из ука­занных органов не отличался в отношении тропизма вируса, то в полевой диагностике ре­комендуется исследовать все четыре органа. При наличии циркулирующих ATвирус иногда удается выделить из мозга переболев­ших птиц Показано, что вирулентные штаммы могут бессимптомно персистировать в орга­низме иммунных птиц в течение 70 дн. Нет зависимости между титрами аити ГА и степе­нью выделения вируса во внешнюю среду. С увеличением продолжительности вирусоносительства (выше 70 дн) вирулентность исходных штаммов вируса снижается независимо от первоначального титра анти-ГА, однако латентная форма инфекции может свободно пере­ходить в клинически выраженную. Было показано, что после заражения иммунизированной птицы велогенным вирусом возможно носительство и выделение последнего в течение 14-17 дн, т.е. поствакцинальный иммунитет не исключает циркуляции дикого вело- или мезогенного вируса. Возможность длительной персистенции вирулентного вируса в организме вак­цинированной птицы может обусловливать возникновение вирусоносительства.

Изучено in vitro связывание шт. V4 вируса НБ с клетками различных отделов пищева­рительного тракта цыплят. Оказалось, что энтероциты 12-перстной, тощей, повздошной, слепой и прямой кишок связывали 97, 85, 99, 92 и 90% вируса соответственно, в то же вре­мя к энтероцитам пищевода, зоба и железистого желудка вирус не прикреплялся, поэтому и инфекционность супернатанта не изменялась.

Антигенная активность. Все формы НБ вызываются идентичными в АГ-отношении штаммами и протекают с образованием ВНА, анти-ГА и КСА В сыворотке птиц AT появ­ляются через 6-10 дн после заражения, пока еще у больной птицы проявляются клинические признаки болезни. Наивысший титр их отмечают через 3-4 нед. Снижение титра AT обычно происходит медленно и становится заметным через 3-4 мес, а спустя 8-12 мес AT уже не выявляются. Установлена корреляция между анти-ГА и ПА. Низкий процент птиц (до 12) с ПА указывает на наличие в стаде выраженного иммунитета против НБ, а высокий процент (более 50) свидетельствует о персистентной инфекции.

Получены раздельно AT на гликопротеин ГА-нейраминидазы (ГП-ГН) и на гликопротеин слияния (ГП-С). Первые из них подавляют ГА- и нейраминидазную активность вируса НБ и тормозят его гемолитическое действие, ATна ГП-С не влияют на его первые две ак­тивности, но подавляют его гемолитическую активность и тормозят эффект вирусиндуцирсванного слияния клеток. Шт. 575, выделенный от диких лебедей и королевских крачек в Ка­наде,обладал уникальной способностью вызывать образование не только анти-ГА, но иAT, блокирующих элюцию вируса с эритроцитов.

Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится на курах,цыплятах и индю­шатах вирулентными штаммами при любом методе заражения. Вся зараженная велогенными штаммами птица, не имеющая пассивных материнских AT,погибает. Мезогенные штаммы (подобные вакцинному вирусу Н) вызывают летальный исход у цыплят до 45-60-сут возраста. Среди взрослой птицы отход достигает 25-30%. Наблюдают параличи и парезы. У кур-несушек яйценоскость прекращается на 25-30-й день.

Лентогенные штаммы (Bl, F, La Sola, Бор/74/ВГНКИ) вызывают у цыплят слабую или инаппарантную форму болезни. Даже при интрацеребрально заражении цыплята не гиб­нут, КЭ также не гибнут ранее 100 ч после введения минимальной летальной дозы.

Кроме кур и цыплят к экспериментальному заражению восприимчивы перепела, воро­бьи, тетерева, голуби. При парентеральном заражениине которые штаммы оказались пато­генными для морских свинок, кошек, собак и других млекопитающих. Интраназально и интрацеребрально удается заразить и золотистых хомячков. Вопрос о трансвариальной пере­даче вируса НБ однозначно не решен. Однако факты последних лет свидетельствуют о воз­можности такой передачи. Так, например, в содержимом желудка очень молодых не вакци­нированных цыплят были обнаружены лентогенные штаммы вируса. Последний обнаружи­вался даже в КЭ, несмотря на присутствие материнских AT. Поствакцинальные титры AT низки и вариабельны у цыплят, предварительно инфицированных вирусом НБ.

Культивирование. Помимо восприимчивой птицы вирус культивируется в КЭ при лю­бом способе заражения, на изолированных ХАО, в культуре фибробластов КЭ, некоторых первичных и перевиваемых клетках. Через 48ч вирус (шт. R2B) накапливался в значительных количествах в ХАО и в низ­ких титрах определялся в аллантоисно-амниотической жидкости. Если эмбрионы инкуби­руют до 60 ч, то вирус выходил из ткани мембран и накапливался в экстра эмбриональной жидкости. В клетках ВНК-21 М-белок вируса НБ обнаруживался в цитоплазме с 5-го ч после инфицирования.

Цитопатология заражённой культуры клеток. Вирус развивается в культурах кле­ток 18 первичных и 11 перевиваемых линий, вызывая цитологические изменения. Репро­дукция его в культуре тканей сопровождается уплотнением цитоплазмы клеток, появлением в них вакуолей и вирусных частиц.Через 40 ч в цитоплазме некоторых клеток обнаружива­ли множество малых аморфных эозинофильных включений, окруженных прозрачной зоной. В одной клетке могло быть до 12 (и более) таких включений. Через 2 дня в зараженных культурах увеличивалось количество клеток с пикнотическим ядром, а через 7 да поража­лись все клетки.

ГА свойства. Вирус агглютинирует эритроциты амфибий,рептилий, птиц, человека, мышей и морских свинок. Эритроциты КРС, овец, коз,свиней и лошадей агглютинируются не всеми штаммами вируса. Разнообразие в агглютинабельности эритроцитов КРС зависит от ионной силы, концентрации солей и рН р-ра. Инагглютинабельность эритроцитов опре­деленных видов объясняется,вероятно, быстрой элюцией с них вируса. Приблизительно 105 инфекционных единиц (ИД 5о) вируса равны 1 ГА.Некоторые штаммы вируса теряют ГА-активность при 56°С за 5 мин, сохраняя инфекционные свойства, другие, наоборот, сохраняют ГА-способность после прогревания при 56°С в течение 180-240 мин, а инфекционная активность их утрачивается через 90 мин Для отдельных штаммов НБ характерна опреде­ленная температура, при которой они утрачивают ГА-активность. Это свойство можно ис­пользовать для дифференциации штаммов. ГА лентогенного шт. В1 в инфицированных клетках ХАО накапливаются к 12 ч культивирования в более низких титрах (1:16 - 1:32), чем ГА велогенного (Т/53) штамма (1:64 - 1:128). Вирус НБ, выращенный в КЭ, состоит из инфекционных и неинфекционных ГА частиц. У этих 2 типов частиц изучены структурные белки, ГА- и нейраминидазная активности, полипептидный состав жирных кислот в липидах мембраны. Фиксация эритроцитов цыплят гаотеральдегидом не снижает их агглютинабельности по отношению к вирусу НБ. Фикси­рованные таким образом эритроциты можно использовать в РГА и РТГА после хранения при температуре 4°С в течение 2 мес. Велогенные штаммы отличаются от лентогенных по ГА-свойствам. Дифференциация указанных возбудителей - обра­ботка их в течение 1 ч азотистой кислотой при рН 4 и температуре 37°С.

Нейраминидазная активность. Выявлена обратная корреляция между нейроминидазной активностью и вирулентностью штаммов вируса. Считают,что параметры энзиматической активности могут являться маркерами вирулентности вируса in vivo.

Гемолитические свойства. Все штаммы вируса обладают гемолитической активно­стью по отношению к эритроцитам морских свинок, лошадей и кур, которая не связана с вирулентными свойствами и находится в прямой зависимости от ГА-титра вируса. Однако имеется и противоположное мнение. По гемолитической активности штаммы вируса НБ можно разделить на слабоактивные (Sи М) и высокоактивные (Т, Н и В). На гемолитические свойства вируса влияют концентрация солей, рН и температура среды, вид эритроци­тов. При 4°С она резко снижается. Гемолитические свойства вируса можно инактивировать специфической анти сывороткой и формалином.

Токсические свойства. Токсичность вируса зависит от метода введения вируса: интрацеребрально, интраназально, внутривенно. У кроликов,зараженных в мозг, в первые 2 дн развиваются параличи, и к исходу 3 сут животные гибнут. При внутривенном заражении кроликов вирус вызывает пирогенную реакцию, могут появиться лимфоцитопения и лихо­радка. У мышей при интраназальном введении развивается летальная пневмония, а после повторных интраназальных введений -гепатизация легких. После замораживания-оттаивания вируссодержащейэкстраэмбриональной жидкости или обработ­ки ее in vitro гомологичной иммуносывороткой токсические свойства вируса исчезают.

Интерфероногенные свойства. Многие штаммы, особенно шт. Н, -хорошие индукто­ры интерферона. Выделены ts-мутанты этого вируса и изучена их способность индуцировать интерферон в первичных клетках КЭ. Показано, что 5%вирусного генома, связанного с инфекционностью, необходимо для индукции интерферона. Существенную роль в индукции интерферона играет ранняя транскрипция(2-3 ч после заражения) генома вируса. Способ­ность индуцировать интерферон у интактных вирионов НБ, инактивированных р-пропио-лактоном от вирионов и некоторых структурных компонентов сравнивали в тест-системе Р/3 ML - интерферон продуцирующих клеток.

Вирулентные свойства. По вирулентным свойствам все выделенные и охарактеризо­ванные штаммы вируса НБ разделяются на велогенные (Т,Сато, Миадера и др.), мезогенные (Н, Комаров, Муктесвар, Роакин и др.) и лентогенные (В 1, F,La Sola,Бор/74/ВГНКИ). Велогенные штаммы отличаются от лентогенных по уровню репродукции и спектру инвазивности. Они накапливаются в органах больных цыплят(легкие, селезенка, печень, мозг) в концентрации 5,5 lg ЭЛД 5о/г, лентогенные же штаммы (Bl, La Sota)в мозге не выявляют­ся, а уровень накопления в легких и селезенке не превышает 2,5 lg ЭЛД 50/г.. ЦПА велогенных штаммов обычно соответствует инфекционностидля КЭ, тогда как лентогенные штам­мы ЦПА не обладают.

С помощью метода фингерпринта можно идентифицировать высокопатогенные штаммы вируса, имеющие очень близкое АГ родство, а также определять корреляцию между нали­чием специфических олигонуклеотидов и патогенностью. Разработан культурально-тканевый метод дифференциация мезовелогенного и других штаммов вируса НБ, основан­ного на изучении характеристики ЦПД штаммов вируса, их инфекционных титров в культу­ре клетокLSGFS-SF3. Лентогенные штаммы в этой культуре клеток продуцируются в низ­ком титре и ЦПД их слабо выражено. Получены также мои AT, пригодные для штаммовой дифференциации. Для дифференциации лентогенных штаммов вируса НБ применяют РГА- элюции. Эти штаммы можно разделить на две группы: быстро (-24R) и медленно(+24R+) элюирующие. Кроме того, используют тест термо стабильности ГА и среднюю смертность зараженных КЭ.

Эпизоотологическая характеристика.Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больная птица. Зараже­ние происходит при контакте больной птицы со здоровой, а также через инфицированную воду и пищевые отходы. Особенно быстро инфекция распространяется аэрогенно. Больная птица через 2 дня после заражения и за день до появления клинических признаков болезни выделяет вирус с выдыхаемым воздухом, во время кашля. Распространение инфекции на большие расстояния (по воздуху до 15 км) связано с пе­ревозкой птицы, тушек вынужденно убитой птицы, инфицированной тары, яиц из неблаго­получного хозяйства, а также не обезвреженной одежды, обуви. В яйцах, собранных от боль­ной птицы, зародыш при инкубации погибает от вируса.

Имеются данные о передаче вируса через некоторых паразитов,в частности E.tenella, E. noeca-trix. Такую же роль могут играть кокцидии. Было доказано, что после заражения ви­русом цыплят, которые до этого были инвазированы половозрелыми или развивающимися формами Ascaridae galli, вирус внедрялся в паразитов и его можно было выделить. Особую важность имеет наличие вируса в яйцах A.galli, в которых он может длительное время со­храняться и передаваться восприимчивым птицам. В Австралии проведена оценка патогенности 45 изолятов вируса НБ, циркулирующих в настоящее время. Все патогенные изоляты передавались путем контакта.

Спектр патогенности в естественных условиях. В естественных условиях вирус вы­деляли от домашних разных видов (индейки, цесарки, утки),синантропных (голуби, воро­бьи, галки) и диких птиц. В 1979 г. от попугаев (KatakoeSulpurea) выделен велогенный штамм (GND-1) вируса НБ. В 1-5% случаев вирус выделяли из клоаки водоплавающих птиц. В 1982 г от японского ястреба-перепелятника (Accipiter Virgatus golans) выделен ва­риант вируса НБ, отличающийся температурочувствительностью в РГА; он вызывал ГА только при 4°С, а не при 25 или 37°С В 1980 г в Бельгии выделен вирус от голубей, все штаммы его оказались лентогенными Высказано предположение о том, что голуби - естест­венные носители лентогенных штаммов.

В литературе приведены случаи заражения людей вирусом НБ,которые, главным обра­зом, могут быть при нарушении гигиены на предприятиях и индивидуальной гигиены пер­сонала. У больных лиц развивался конъюнктивит.Имеются сведения об эпизоотологических особенностях и клинической картине НБ сре­ди голубей в некоторых районах Судана в 1982 г. Клинически эта болезнь характеризова­лась внезапным угнетением, потерей аппетита, нервными явлениями, неспособностью ле­тать. В ряде хозяйств летальность среди голубей достигала 100%. Выделенный вирус не от­личался от прототипных штаммов вируса НБ. В течение 1984 г.в Австрии резко возросла инфицированность голубей вирусом НБ. В 1990-1991 гг. при серологическом определении AT против вируса НБ у водоплавающих (уток игусей) с помощью РТГА и ИФА показано, что AT в РТГА выявлены у 3,1% мускусных и10% пекинских уток, по ИФА - у 20,3 и 24,8% соответственно. В 1970-1972 гг. в Голландии погибло большое количество норок от менингоэнцефалита. Причиной смертности был вирус НБ Выделенный на КЭ, он обладал низкой патогенностью для норок при интрацеребральном введении. Оказывается, животные заражались при по­едании потрохов инфицированной птицы, среди которой в это время наблюдалась НБ. Описан случай острого респираторного заболевания у 3-мес дрофы вихляя в Таифе(Саудовская Аравия). Из легких, селезенки и трахеи пораженной птицы был впервые выде­лен вирус НБ и вирус оспы птиц.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения. При естественном течении ин­кубационный период длится от 5 до 15 дней (в среднем 5-6 дней). Симптомы болезни довольно разнообразны. Описаны четыре формы клинического проявления болезни. При первой велогенной форме наблюдают угнетение, слабость, расстройство функции органов дыхания, диарею с появлением водянистых зеленоватых фекалий с примесью крови, тремор, опистстонус. Возможны параличи лап и крыльев, а также гибель птицы без каких-либо признаков. Смертность достигает 90%. Основной патологоанатомический признак - геморрагическое поражение пищеварительного тракта. Полагают, что эта форма болезни вызывается высокопатогенными (велогенными) азиатскими штаммами вируса. Велогенная висцеротропная НБ с летальностью до 100% в 1966 - 1973гг. получила эпизоотическое распространение, особенно в Европе и США.Вторая форма болезни характеризуется поражением, главным образом, органов дыха­ния (кашель, удушье) и нервной системы. Погибает от 10 до 50% заболевшей птицы. Среди цыплят гибель достигает 90%. Пневмоэнцефалит с летальностью до 100% был широко рас­пространен в Западном полушарии в 1940-1950гг., в настоящее время регистрируется очень редко. Старая птица погибает редко. Некоторые мезогенные штаммы, вызывающие эту форму болезни, до сих пор используются в качестве вакцинных (шт. Н, Комаров и др).Третью наиболее легкую форму болезни вызывают лентогенные штаммы вируса. На­блюдают незначительные изменения респираторного игерминативного трактов (оофориты и сальпингиты). Яйценоскость прекращается на 7-22-й день, снижается аппетит, легкий ка­шель можно услышать ночью. Четвертая - асимптоматическая форма протекает без признаков и заболе­вание часто определяется серологически или выделением вируса.При вскрытии трупов птицы, павшей при остром течении болезни, обнаруживают вос­паление слизистых оболочек носа и ротовой полости, полосчатые кровоизлияния на слизи­стой оболочке пищевода, зоб переполнен слежавшимися или жидкими кормовыми массами, слизистая оболочка желудка покрыта слизью. На границе железистого и мышечного отделов желудка видны кровоизлияния в виде пояска. В тонком кишечнике наиболее характерны очаги некроза и эрозии вокруг пейеровых бляшек, в толстом - везикулярные папулы, эрозии и изъязвления на всем протяжении слизистой оболочки. Селезенка в состоянии атрофии. На слизистой ротовой полости, пищевода и пилоруса - изъязвления, эпителий либеркюновых желез дегенерирован и слущен, вокруг расширенных и некротизированных крипт в слизи­стой оболочке тонкого кишечника скопление слизистого секрета и выпотевание нейтрофилов. Атрофия и некроз обнаружены в селезенке, печени, солитарных лимфоузлах и тимусе. Изменения в печени непостоянны. Селезенка поражается довольно часто. Она увеличена, бледная, пятнистая. Яичники гиперемированы, лицевые клетки увеличены, иногда разорва­ны, и желточная масса находится в брюшной полости. В сердечной мышце заметны крово­излияния, в полости сердечной сорочки экссудат. Слизистые оболочки гортани и трахеи катарально воспалены. Характерно поражение кишечника: острый катар, резкая гиперемия, кровоизлияния, наличие фибринозно-некротических участков. Последние часто встречаются в двенадцатиперстной и тонкой кишках. Иногда поражается весь кишечник. Точечные и пятнистые кровоизлияния обнаруживают у 50-70 и даже 90% больных кур в двенадцатипер­стной, прямой и слепой кишках. Изменения в печени носят непостоянный характер. У от­дельных цыплят она увеличена, полнокровна, темно-вишневого цвета, иногда с единичными точечными геморрагиями под капсулой. Желчный пузырь наполнен желчью темного цвета, а на слизистой оболочке иногда отмечают точечные кровоизлияния и некротические очаги. Почки полнокровны и отечны. Селезенка нормальной величины или уменьшена в размере. Слизистые носовой полости, гортани и трахеи гиперемированы, с мелкими точечными кро­воизлияниями, нередко с дифтерийными наложениями. Легкие у большинства кур бывают воздушными, светло-розового цвета, иногда с явлениями застойной гиперемии и отека. В перикарде и грудобрюшной полости небольшое количество жидкости светло-соломенного цвета. Сердечная мышца темного цвета, дряблая, полнокровная, иногда с мелкими точеч­ными кровоизлияниями в области эпикардиального жира. В мозге яв­ления отека и гиперемии, в отдельных случаях точечные кровоизлияния в твердой и мягкой мозговых оболочках и веществе мозга.Гистологические изменения. Постоянно обнаруживают поражения в железистом же­лудке и по всей длине кишечной трубки. Слизистая оболочка резко утолщена за счет отека и клеточной инфильтрации и находится в состоянии выраженного десквамативного катара. Покровный эпителий и эпителий крипт подвергаются дистрофии, некрозу и слущиванию в просвет. Крипты в форме вытянутых мешковидных бесстуктурных образований, окрашен­ных в серо-синеватый цвет. Соединительнотканные волокна подслизистого слоя сильно раз­двинуты в результате воспалительного отека и инфильтрации лимфоцитами и другими кле­точными элементами. Закономерно для НБ - некротические поражения толстого кишечни­ка. Отмечают также сильное развитие клеточно-пролиферативных реакций в ЦНС и внут­ренних органах, по ходу капилляров и мелких сосудов, а в веществе мозга со стороны кле­ток микроглии -образование глиозных узелков. Кроме того, встречаются тигролиз, вакуо­лизация цитоплазмы и ядра, хроматолиз и гибель нейронов. В селезенке, печени, почках и ЖКТ пролиферативные явления вокруг сосудов, в междольковой, межканальцевой и подэпителиальной соединительной ткани. В селезенке резкая гиперплазия фолликулов, утолще­ние и фибриноидный некроз стенок сосудов с развитием околоконцевых артерий очагов крупноклеточной пролиферации с некрозами в центре их и отложением фибрина. В почках - признаки некробиоза эпителия канальцев и картина тяжелого нефроза. В легких - явления застойной гиперемии и отека и редконекротическая пневмония. Описанная картина вскрытия и гистологические изменения характерны для классиче­ского проявления НБ при заражении велогенными штаммами. Из многочисленных наблю­дений установлено, что течение инфекции с поражением нервной системы или респираторного тракта без острого септического процесса чаще вы­зывается вирусами с природно ослабленной вирулентностью.Патогенез. Вирус, проникая в организм, размножается в клетках эндотелия, в результа­те чего клетки кровеносных сосудов разрыхляются, нарушается их порозность и в них раз­виваются воспалительно-некротические процессы. Через 24-36ч. вирус локализуется в па­ренхиматозных органах, костном и головном мозге, кишечнике и мышцах, вызывая наряду с расстройством гемодинамики тяжелые некрозо-дистрофические изменения.Диагноз. При характерном течении болезни постановка диагноза не представляет сложности. При вспышке болезни на фоне пассивного или поствакцинального иммунитета, а тем более в стационарно неблагополучном хозяйстве поставить диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих случаях тщательно изучают эпизоотическую ситуацию, клиническую и патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные исследования - выделение ви­руса на КЭ, его индикация и идентификация в РГА - РТГА, определение вирулентности ви­руса на КЭ и цыплятах, а также выявление AT в сыворотке переболевших или вакциниро­ванных птиц в РТГА.Выделение вируса. Вирус, в зависимости от его тропизма можно выделить из головного и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки, легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голо­ву, легкие, трахею и селезенку от только что павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается выделить только в период вспышки болезни. Через 15 дн. выделить его обычными методами, как правило, не удается. Поэтому патологический материал необходимо брать в начале вспышки (в первые 3-5дн.) и направлять в лабораторию в термосе со льдом. Внут­ренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный р-р глицерина на дистиллирован­ной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на холоде или при температуре не выше 4°С. Мазки-отпечатки исследуют методом ФА, срезы - с помощью ЭМ или ИЭМ, а суспензию - в РГА. Это позволит выявить специфический АГ (вирус) и ГА-агент в течение 3-5ч, определить направленность дальнейших исследований.Заражение КЭ. Эмбрионы 9-11-дн возраста заражают по 0,2 мл., не менее 10 КЭ на ка­ждый материал, в аллантоисную полость общепринятым методом и инкубируют 72ч. при 37,5°С (погибших в первые 24ч. эмбрионов не учитывают).Если через 72ч. нет погибших КЭ, то 5 из партии зараженных убивают, оставляя их при 4°С на ночь. Остальные 5 КЭ ин­кубируют до 120ч. и затем убивают. Аллантоисную жидкость от погибших и живых КЭ проверяют на ГА в РГА с куриными эритроцитами (1-5%-ная взвесь). Обычно велогенные штаммы вируса вызывают гибель КЭ уже через 32-60ч. после заражения, мезогенные - че­рез 60-90, а лентогенные - через 100ч. и более. Иногда при первом пассаже не удается выде­лить вирус, поэтому необходимо провести не менее 3-х "слепых" пассажей. Учитывая, что в вакцинируемых стадах можно выделить и вакцинный вирус (шт. Н, La Sota , Бор 74/ВГНКИ и др.), вторым этапом исследования должно быть определение патогенности выделенного изолята. Первым ориентиром могут служить данные РГА. Обычно полевые изоляты обла­дают низкой ГА-активностью, проявляя ее в разведениях 1 16 - 1.128, тогда как вакцинные штаммы, наоборот, проявляют высокий ГА-титр - 1-256 - 1-2048.Ненадежным оказался метод выделения вируса от зараженных иммунных кур: чем вы­ше иммунитет у несушек, тем меньше вероятности выделения вируса из их эмбрионов. При исследовании большого количества полевых образцов на выделение вируса НБ можно ис­пользовать фрагменты ХАО, связанные с яичной скорлупой. Для этого фрагменты ХАО размером 0,6-1,0 см2 культивируют в среде Игла. Эффективность выделения вируса 97%. При внесении вируса в среду культивирования, или непосредственно на ХАО, КЭ получены совпадающие результаты.Заражение культуры клеток. Выделение вируса в культуре клеток осуществляется редко, так как культуральный вирус по ГА-активности значительно уступает эмбрионально­му. Однако в тех случаях, когда в лаборатории можно получить культуру фибробластов КЭ и специалисты владеют этим методом, его можно применять для выделения и идентифика­ции вируса. Приготовление вирусной суспензии, выращивание и заражение культуры клеток куриных фибробластов производят общепринятым методом. Можно использовать переви­ваемые линии ВНК-21и Нер-2.В зараженной культуре фибробластов КЭ вирус НБ через 48-60ч. вызывает ЦПИ, спе­цифичность которых подтверждается реакцией гемадсорбции с эритроцитами кур. С вирус-содержащей культуральной жидкостью может быть поставлена РГА в отношении эритроци­тов крови кур. Обычно при первичном выделении ГА-титр культурального вируса не пре­вышает 1:32- М28. Отсутствие или низкие титры ГА вируса в первом пассаже на культуре ткани, не дают основания исключить НБ.Заражение птиц. Если КЭ под руками нет, вирус можно выделить на неиммунной к НБ птице. Для этого испытуемый материал Г10 (0,5 мл.) внутримышечно инокулируют цыпля­там в возрасте 2-4 мес. За инфицированной птицей наблюдают 10-12 дн. При появлении ха­рактерных для болезни симптомов птиц в агональном состоянии убивают и берут пробы го­ловного мозга и селезенки, которые используют для заражения КЭ и иммунологической пробы (для одновременного заражения птиц иммунной и неиммунной групп).Титрование вируса. Обычно проводят на КЭ, культурах клеток по общепринятой ме­тодике и на 6-10 нед. цыплятах. Доза инокуляции вируса для цыплят 0,5 мл (внутримышечно или внутривенно). Срок наблюдения 15 дн.Индикация вируса. Экспресс-методы выявления антигена вируса НБ. Через 24 ч. винфицированных культурах клеток (шт. Н) наблюдают появление многоядерных симпластов и цитоплазматических эозинофильных включений неправильной глыбчатой формы. Через 48 ч после заражения цитоплазма бывает нафарширована тельцами-включениями. В ядрах изменений не отмечалось. Разработан высокочувствительный авидин-биотиновый ИФА. В данном тесте применяют мон АТ к вирусу НБ, очищенные и меченые биотином. Тест характеризуется простотой выполнения и короткими сроками (3-4 ч.) получения результатов. Непрямой точечный вариант ИФА является быстрым, легким, специфическим методом обнаружения вируса в смывах с различных органов.Для идентификации РНК вируса НБ пользуются экспресс-методом ПЦР, амплифицирующей участок длиной 238 п.н. в гене белка слияния F с использованием в качестве праймеров нуклеотидов, фланкирующих последовательность.В организме птицы, зараженной вирусом НБ, в процессе продолжительного контакта с вирусом эритроциты теряют способность ГА (становятся инаглютинабельными). Чтобы кос­венно доказать присутствие вируса в организме, от исследуемой птицы берут 0,04 мл крови в формалинизированую (0,1%-ную) вируссодержащую аллантоисную жидкость, вирус дол­жен обладать высокой агглютинирующей активностью. Если на стекле наступает гемагглютинация, это свидетельствует об отсутствии в исследуемой капле крови вируса НБ. Учет ре­акции ведут через несколько секунд. Метод применим для выявления патогенного вируса в вакцинированном стаде, так как вакцинные штаммы лентогенной группы инагглютинабельности эритроцитов не вызывают.РГА. Используют с целью ориентировочного определения присутствия вируса в иссле­дуемом материале и для его титрования. ГА вируса входят в состав вирусной частицы (вириона) и могут содержаться в инфицированных аллантоисной и амниотической жидко­стях, оболочках и органах КЭ, легких, печени, почках и селезенке погибшей птицы, в жид­кой и клеточной фракциях тканевых культур. Можно брать эритроциты крови кур, морской свинки, лошади, человека и др. Разные виды вирусов и даже шт. одного и того же вируса могут отличаться друг от друга способностью агглютинировать эритроциты указанных жи­вотных. Спектр ГА служит характеристикой биологической активности вируса и штаммов. Например, большинство шт. вируса НБ не вызывает ГА эритроцитов лошади, чем отличает­ся от вируса классической чумы птиц, который способен ГА их в высоких разведениях. Предложена экспресс-диагностика атипичных форм НБ кровекапельной реакцией гемагглютинации (ККРА). Простота постановки её, совмещение исследований на НБ и пуллороз-тиф, позволяют включить ее в технологический процесс ветобработки птицы.Серологическая идентификация. РТГА. Основной, высокоспецифичный и простой в выполнении метод идентификации вируса НБ. Для постановки необходимо иметь эталонные специфические сыворотки к виру­су и выделенный на КЭ вирус (аллантоисная жидкость) РТГА ставят общепринятым мето­дом в макро- и микровариантах. Идентификацию вируса считают завершенной, если эта­лонная специфическая сыворотка тормозит ГА-активность вируса в пределах целого или 1/2-1/8 титра с гомологичным эталонным АГ. Для быстрой идентификации выделенного вируса рекомендуют следующий метод: на предметное стекло наносят капли аллантоисной жидкости и 1%-ную суспензию куриных эритроцитов. Затем ставят пробу на нейтрализацию ГА-активности. Для этого на предмет­ное стекло наносят каплю той же аллантоисной жидкости, каплю эталонной специфической сыворотки и хорошенько перемешивают. Если агглютинации эритроцитов нет, значит вы­деленный вирус является вирусом НБ.Приготовление гипериммунных сывороток. 5-8-мес кур с титрамианти-ГА поствакци­нального иммунитета против НБ 1:4-1:64 гипериммунизируют вирус-вакцинами из шт. В1, La Sola, Н. Первое введение делают с адъювантом (автоклавированная смесь ланолина с вазелином в соотношении 1:1,5). На 1 мл. смеси добавляют 5 мл вакцинного вируса. Смесь растирают в ступке и помещают в водяную баню на 30 мин. при температуре 56°С.1-й раз вакцину вводят с адъювантом в объеме 1 мл. внутримышечно, 2-й раз - через 3 дня без адъюванта, 3-й раз еще через 3 дня без адъюванта. Через 10 дн. проверяют актив­ность гипериммунных сывороток. Титр их обычно составляет 1:6144-1 12288.РН на КЭ. Используют для идентификации вируса редко, так как она трудоемка и дли­тельна. Реакцию используют в спорных ситуациях. РН ставят общепринятым методом обычно в варианте разведения вируса и постоянной дозы сыворотки. Реакцию считают по­ложительной при индексе нейтрализации >21g.РСК. В диагностической практике при НБ используют редко. Предложена РСК как бы­стрый и дешевый метод дифференциации штаммов вируса НБ по вирулентности.РИФ. Метод основан на применении рода минсульфохлорида для конъюгации иммун­ной сыворотки к вирусу с целью идентификации вирусного АГ в пораженных клетках пав­ших и убитых птиц. Применение этого красителя наиболее приемлемо и удобно благодаря яркому оранжево-красному свечению АГ. ФИТЦ-конъюгаты (флюоресцеинизотиоцианат) менее пригодны. Для обнаружения специфического АГ применяют гомологичные РСХ-конъюгаты общепринятым методом. В большинстве случаев АГ выявляется в ядрах клеток белой крови (лимфоцитах, моноцитах, псевдоэозинофилах и эозинофилах) или пораженных клеток указанных органов в виде яркой флюоресценции оранжево-красного цвета. В кон­трольных препаратах, обработанных теми же гомологичными конъюгатами, подобного све­чения не наблюдается, лишь в некоторых случаях выявляется точечное желто-оранжевое свечение в цитоплазме юных эозинофилов. Установлено, что вирусный АГ в зараженных культурах клеток (ФЭК иВНК-21) выяв­ляется, начиная с 4 ч. (для велогенных штаммов) и с 6 ч (для лентогенных штаммов), до 10-12ч. свечение АГ отмечали только в цитоплазме, а через 20 ч. - в цитоплазме и ядрах клеток.РИГА. Во ВНИВИП разработана методика получения высушенных стандартных высо­кочувствительных и специфических эритроцитарных тест-препаратов с AT к вирусу НБ для экспресс-диагностики. Указанный эритроцитарный диагностикум позволяет выявить вирус в экскретах органов и тканей .ИФА. Методом ИФА вирусный АГ выявляют в ранние сроки после заражения до появ­ления ЦП Д. Через 12ч. после заражения видны единичные АГ-содержащие клетки.Идентификация при помощи монАТ. Исследованы различные штаммы вируса и изоляты НБ на гомологичное родство к монАТ. В результате тестирования 40 изолятов и штаммов с использованием набора из 9 монАТ  выявлено 8 групп. Вирусы каждой группы обладали не только общими АГ-свойствами, но и одинаковыми эпизоотическими чертами МонАТ к ГА и гликопротеину F, рекомендовано использовать для определения патогенности и биологической характеристики штаммов, циркулирующих в стадах вакцинированных и невакцинированных птиц. Они могут быть использованы для идентификации полевых изо­лятов, АГ-родственных шт. La Sota и В1, быстрой дифференциации этих вакцинных штам­мов от вирулентных полевых изолятов.Метод картирования олигонуклеотидов. Этим методом исследован биохимический состав нескольких штаммов вируса НБ, выделенных в штатах Калифорния, Техас и Флори­да, это позволило легко дифференцировать штаммы друг от друга. Часть штаммов оказа­лись идентичными. Считают, что метод олигонуклеотидного картирования может быть эф­фективно использован с целью оценки эпизоотической ситуации.Определение вирулентности выделенного вируса. Помимо серологической иденти­фикации часто возникает необходимость определения вирулентности выделенного изолята. Это важно, когда возникает подозрение, что выделенный возбудитель является штаммом, применяемым для массовой вакцинации. Степень вирулентности можно определить следующими методами.Метод Хенсона - определение индекса внутримозговой вирулентности. Исследуемым материалом в разведении 1:10 заражают интрацеребрально в дозе по 0,05 мл 10 1-дн цып­лят, полученных от невакцинированных против НБ кур. Время наблюдения 8 дн. Все по­гибшие цыплята считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 2. Все цыплята, проявившие клинические признаки, тоже считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 1. Индекс интрацеребральной патогенности вычисляют путем деления суммы балов на 80 (число наблюдений за 10 цыплятами в течение 8 дн). Для лентогенных штаммов индекс до 0,2, для велогенных штаммов - больше 1,5. Недостатком данной методики является - постоянный период наблюдения - 8 дн.Метод определения среднего времени гибели 10-дн. эмбрионов, вызванный минималь­ный летальной дозой (СВГ/МЛД). Для этого готовят серию 10-кратных разведений иссле­дуемого вируса от 10 -1 до 10-10, пять из них (10-1, 10 -7, 10 8, 10 9, 10 -10 используют для зара­жения 10-дн КЭ в аллантоисную полость в объёме по 0,1 мл. Каждым из этих разведении инокулируют по 10 КЭ: по 5 заражают в 8ч. утра и в 16ч. (в общем заражают 50 эмбрио­нов) и инкубируют их при 37°С. Наблюдают за ними 2 раза в день через 8 ч в течение 120 ч. Час гибели каждого погибшего эмбриона регистрируют. Минимальной летальной дозой считают самое большое разведение вируса, вызывающее гибель всех инокулированных эм­брионов. Среднее время гибели находят путем деления суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванной минимальной летальной дозой, на число эмбрионов: среднее время гибели до 60 ч - велогенные штаммы; среднее время гибели от 61 до 90 ч - мезогенные штаммы; среднее время гибели от 90 и больше 100 ч – лентогенные штаммы. Однако методы эти дорогостоящие и требуют много времени – необходимо затратить по меньшей мере 7дн. для того, чтобы дифференцировать дикие штаммы от вакцинных.РСК. Быстрый и дешевый способ дифференциации штаммов. Диагноз ставят в течение 3дн. после получения проб. Самое слабое связывание комплемента вызывают велогенные дикие штаммы, самое сильное – лентогенные (например La Sota), в границах между сильны­ми и слабыми - мезогенные. Кроме того, вирулентные штаммы менее антигенны, чем вак­цинные, в отношении индукции синтеза КСА у морских свинок. Самую отчетливую диффе­ренциацию дает сыворотка морских свинок, иммунизированных штаммом Хитчнера.Биопроба.   Начиная с 1972 г. в США, а затем и в других странах были выделены штаммы с очень высокой вирулентностью. Их называют штаммами WND (висцеро-тропные штаммы НБ). Для идентификации проводится биопроба на восприимчивых цыпля­тах в возрасте не менее 6 нед. Цыплят заражают в клоаку. Несколько особей заражают в глаз, внося туда каплю вируса. За птицами наблюдают10 дн. Если в течение этого периода ни один цыпленок не погибает, считают, что штамм не относится к WND. Если же птицы заболеют и погибнут в течение 10 дн., производят вскрытие. В США принята следующая оценка интенсивности изменений (в баллах): точные кровоизлияния или некротические из­менения в трахее - 25; точечные кровоизлияния или некротические изменения в трахее  и сопутствующая им отечность трахеи и в области входа в грудную  клетку - 100; точечные кровоизлияния или некротические изменения в зобе - 100; некроз и изъязвление желез сле­пой кишки и пейеровых бляшек - 100; точечные кровоизлияния или некротические измене­ния слизистой оболочки клоаки - 10; воспаление брюшины в области яичника - 10; точечные кровоизлияния в других местах - 10. Диагностика VVND считается обоснованной, если об­щее число баллов достигает 150 или более.Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Критерием, позволяющим судить о персистенции вирулентного вируса в стаде, являют­ся титры AT в сыворотке крови птиц. Исследования проводят только с парными сыворотками, полученными от одних и тех же птиц (или на одной и той же группе птиц). Первую про­бу берут перед вакцинацией (или вначале болезни), вторую - на 15-20-й день, последующие - в любое время (обычно 1 раз в месяц).РТГА. Реакцию ставят с 4 ГАЕ в макро- и микровариантах по общепринятой методике. Результаты считают положительными, если разница в титрах 1-й и 2-й сывороток составля­ет не менее 3-х разведении. Повышение числа положительно реагирующих в РТГА между двумя исследованиями свидетельствует о распространении инфекции в стаде. Постинфекци­онные AT обычно бывают в титре 10lg и более и устанавливаются в течение продолжи­тельного времени, что указывает на проходящую или прошедшую инфекцию. Обнаружение в стаде птицы анти-ГА в разведении сыворотки крови 1:1024 - 1:2048 через 12-25 да после применения живых вирусвакцин не является сигналом о неблагополучии его в отношении НБ, наоборот, это свидетельствует о высокой реакции птицы на вакцину. Но если через 4-5 мес. после вакцинации в стаде будут обнаружены титры AT 1:2048 или неровные титры, т.е., когда у части проб крови (10-15%) их нет или они не превышают 1 2 - 1.4, а в другой части (14-20%) составляют 1:1024 - 1:2048 и выше, то стадо надо считать имевшим контакт с ви­рулентным вирусом.       Для определения активности эпизоотического процесса птиц через 2 нед обследуют по­вторно. Обнаружение высоких титров AT (1:4096 и выше) свидетельствует об обострении эпизоотической ситуации. Для серологического контроля из каждого птичника берут по 25 проб крови. Кратность исследований определяется эпизоотической ситуацией. AT обнаруживаются не только в сыворотке крови. Большое количество их содержится, например, в желтке яиц иммунизированных птиц. Этим путем происходит передача пассив­ной резистентности потомству. Обнаружение AT в желтке яиц, полученных от вакциниро­ванных кур, по мнению ряда авторов, более достоверно для определения состояния рези­стентности поголовья птиц. Готовят экстракт из желтка: в пробирку наливают 1,5мл. яичного желтка и 6мл. физиологического р-ра и тщательно перемешивают; добавляют 2мл. дихлорэтилена и 1 мл эфира. Содержимое тщательно смешивают встряхиванием. Оставля­ют смесь при 37°С до следующего дня, после чего центрифугируют в течение 10 мин при 1,000 мин -1. Фракция дихлорэтилена находится внизу на дне пробирки, над ней расположе­на полоса жира. Слегка мутную надосадочную жидкость (она соответствует разведению 1.5 желтка яиц) отсасывают пипеткой и используют в РТГА. Более простой метод заключается в следующем: желток отделяют от белка и 1 мл. его разводят 2 мл. фосфатного буфера с рН 7,2. Полученную смесь гомогенизируют, затем центрифугируют 15 мин. при 1,000 мин. -1. Для РТГА берут надосадочную жидкость между самым верхним слоем и осевшими частицами желтка. Титры AT в желтке соответствуют содержанию их в сыворотке крови кур. Считают, что для определения иммунного статуса стада кур к НБ значительно проще исследовать AT в яичных желтках, чем в сыворотке крови. Такой подход экономичен, исключает стрессы и опасность распространения болезни при взятии крови. Исследуя желток, можно определить время первичной иммунизации цыплят, выведен­ных из анализируемой партии яиц. Титр пассивных AT в постнатальный период за 4,5 дня снижается на 1 log 2. Так,при исходном титре AT 7 log к 18 дню он уменьшается до 3 log 2, и до 5 log 2 к 9 дню. Надежный иммунный ответ будет получен у 80-100% птиц при вакцина­ции цыплят в указанном возрасте per os, интраназально или аэрозольно. Результаты иссле­дования желтка и парных сывороток кур позволяют судить об уровне сероконверсии и по нему определять напряженность поствакцинального иммунитета. Четырехкратное и более увеличение анти-ГА свидетельствует о циркуляции эпизоотического вируса. Аналогичное заключение делают по возрастанию индекса нейтрализации в 50-100 раз по сравнению с первоначальными данными.Ставить диагноз по сероконверсии при внедрении полевого вируса в стадо иммунной птицы трудно без выделения вируса и определения его вирулентности на цыплятах. Можно только предполагать, что птица имела контакт с полевым штаммом.РРГ. Эта реакция (РРГ) получила широкое применение и высокую оценку при многих парамиксовирусных инфекциях. В опытах с вирусом НБ показаны линейная зависимость диаметра зоны гемолиза от концентрации AT и полная корреляция результатов РРГ и РТГА. Так, при титрах в РТГА 1:16-1:32 диаметр зоны гемолиза составлял 6-7 мм,а при 1:64 и 1.1024 - 7,5±0,3 и 9,5±0,5 мм. соответственно. При повторных исследованиях одних и тех же сывороток расхождение показателей не превышало 0,5 мм.ELISA. Многочисленные данные зарубежных исследователей свидетельствуют о высо­кой чувствительности, специфичности этого метода и корреляции между титрами AT в РТГА и ELISA. Разработан набор для скрининга сыворотки птиц на присутствие AT к НБ Титры в ELISA выше, чем в РТГА и показывают высокую степень корреляции. При исследовании сывороток крови от вакцинированных птиц титр AT в ELISA был в 2-4 выше, чем в РТГА. AT к вирусу в ELISAи РТГА выявляются в 98, и 91,7% соответст­венно, коэффициент корреляции равен 0;85. Однако ELISA отличается большей чувст­вительностью. На основании реактивности с монАТ штаммы вируса НБ разбиты на 5 групп. Для постановки реакций ELISA и РЗГА при обнаружении AT к вирусу НБ целесооб­разно использовать хлороформный экстракт.Дифференциальная диагностика. НБ следует дифференцировать от ИБП, гриппа, ПМВ-2, ИЛТ и микоплазмоза птиц. Для лабораторной диагностики гриппа птиц, ИБ и НБ используют диагностикумы биофабричного производства. Дифференциация вирусов гриппа, насчитывающих 14 подтипов, и парамиксовирусов, включающих 9 серотипов, возможна только в лаборатории. Особое внимание следует сосредоточить на эпизоотологическом мо­ниторинге при этих болезнях, исследовании парных сывороток и периодическом лаборатор­ном анализе патматериала.Иммунитет. Естественно переболевшая или вакцинированная птица приобретает иммунитет, про­должительность и напряженность которого зависит от возраста птицы, биологических свойств вируса и метода введения его в организм.Для специфической профилактики применяют инактивированные и живые вакцины. Количество первых последнее время значительно сокращалось. Однако односторонняя ори­ентация на живые вакцины разной степени аттенуации и в ряде случаев нежелательные по­следствия их применения вынудили исследователей и практических специалистов вновь вернуться к инактивированным препаратам, правда, более современным.Применение живых вакцин. Ассортимент живых вакцин, применяемых в настоящее время весьма широк: Н, В, F, FR, Комаров, Roakin, Ла Сота, Банковский, Муктесвар, Миннесот, Бургас, Нью-Джерси, Нью-Йорк, Накарелла, К,ГАМ, V4 и др. Среди вакцин­ных лентогенных штаммов вируса НБ известны - В, NDP,LZ58 и Clone 30, Ulster 2C.В 1989 г.в Австралии выделен шт. N4, характеризующийся полной авирулентностью для птицы и активным распространением его среди птиц (высокой контагиозностью). Вирус вызывает иммунитет при введении интраокулярно, внутримышечно и аэрозольно. Он персистирует в организме привитой птицы до 2 лет. У подсаженной не привитой птицы к вакцинированной в течение 80дн. обнаруживались AT. Несмотря на низкие титры (ниже 3 Iog2 ), привитая птица обладала устойчивостью к заражению вирулентным вирусом, что свидетельствует о развитии местного секреторного или клеточно-опосредованного иммунитета безвысоких титров гуморальных AT.Пероральная вакцинация шт. У4 (Австрия) стимулирует лимфоидные ткани кишечного тракта, что индуцирует секреторные иммуноглобулины и обеспечивает защиту даже при низком уровне циркуляторных гуморальных AT. Шт.V4, заданный с питьевой водой или кормом, после вакцинации выделяется в окружающую среду. По мнению авторов, пероральная вакцинация этим штаммом может разрешить ряд проблем профилактики НБ в не­больших фермерских хозяйствах. Пылевидная вакцина из шт. La-Sota разработана во ВНИИВВиМ. В основе технологии изготовления использован метод сушки смеси вируссодержащего материала с наполните­лем. Вакцина обеспечивает высокий иммунологический эффект и практически не обладает реактогенностью в широком диапазоне доз, имеет выраженную иммуногенность для цыплят 14-16 нед возраста в благополучном и стационарно неблагополучном стаде птиц.В ВГНКИ ветпрепаратов проведены исследования по совершенствованию методов кон­троля иммуногенности вакцин против НБ. Установленный минимальный защитный титр ан-ти-ГА 3 Iog2 и более, давал вполне объективную информацию о иммуногенности вакцины. Для исключения погрешностей в методику была включена референс-вакцина НБ, позво­ляющая правильно интерпретировать получаемые результаты и более дифференцировано подходить к оценке этого показателя у серийно производимого препарата. Референс-серии готовят во ВГНКИ, контролируют на соответствие заложенным в ТУ параметрам и постав­ляют на биопредприятия. Новая методика предусматривает 10-кратный запас иммуногенно­сти и обязательное соответствие параметрам референс-серий не менее чем на 80%. Экспе­риментально определены иммунизирующие дозы (НМД), обеспечивающие абсолютную за­щиту птицы от 1000 ЛД50 вирулентного вируса (ИМД90), равные для шт. La Sota/ 6,7 lg ЭИД50, для шт. Бор/74 ВГНКИ - 6 lg ЭИД50 при интраназальном применениии 7,7 и 7,0 lg ЭИД50 соответственно при энтеральном применении. Они оказались значительно выше, чем в случаях применения серий вакцин с минимально допустимой по ТУ активностью (8,0 lg ЭИД5о /см3). В связи с этим минимально допустимая инфекционная активность препара­тов увеличена до 9 lg ЭИД50 /см3.В СНГ широко применяют сухие вирусвакцины из шт. Н, Bl, La Sota, Бор/74/ВГНКИ. В профилактике НБ важна разработка оптимальной схемы иммунизации птицы. Наиболее подходящий возраст для первой вакцинации - 10-14-й день, а для ревакцинации - 5-6 нед. Лучшие результаты получены при аэрозольной вакцинации в 10-дн., 5- и8 –нед. возрасте. У индюшат осложнения после применения живой вакцины против НБ в2-3 нед. возрасте свя­зывают с подавлением вакцинным вирусом фагоцитарнойа ктивности альвеолярных макро­фагов. Во избежание этого предложена более рациональная схема иммунизации индюшат. В первый день жизни им вводят подкожно инактивированную вакцину в дозе 0,1 мл, а через 2 нед. аэрозольно вакцинируют живой вакциной из шт. В1. Такая вакцинация обеспечивает длительный иммунитет. Высокий уровень поствакцинального иммунитета у матерей не пре­пятствовал иммунизации суточных индюшат инактивированной вакциной. В неблаго­получных товарных хозяйствах рекомендуют прививать индеек аэрозольно с интервалом 5 нед. в течение всего производственного периода. Преимущество гранулированных форм вакцин из шт. У 4 u Roakin в их более высокой термостабильности; их можно транспортировать без рефрижератора и смешивать с любым обычным кормом.Активность клеточного иммунитета у цыплят, вакцинированных шт. V4 вируса НБ, оп­ределяли с помощью теста ингибиции миграции лейкоцитов (ИМЛ).Исследовали роль защитных реакций слизистых оболочек в создании поствакцинально­го иммунитета. Цыплят вакцинировали 2-кратно с 2-недельным интервалом интраназально, интраокулярно и введением вакцины в зоб. Каждый цыпленок получал дозу 7,8 lg ЭИД50 шт. V4. Через неделю в сыворотке и слезной жидкости цыплят, вакцинированных всеми способами, обнаруживали повышение уровня AT. Оральная вакцинация inr.V4 индуцирует у цыплят не только гуморальные иммунные реакции, но и реакции иммунокомпетентных элементов слизистых оболочек. Показана высокая интерферирующая активность ПМВ-2, что необходимо учитывать при изготовлении эмбриональной вакцины против НБ .Получена живая вакцина из мутанта шт. Hitchner В1 путем клонирования методом бля­шек серийными пассажами при температуре 28-30°С. Н.А. Лагуткин и соавт. реко­мендуют выпускать вакцины из шт. Bl, La Sota и Бор/74 ВГНКИ с активностью не ниже 9 lg ЭИД50/мл. и с титром в РГА не ниже 1:128. Доза при интраназальном (окулярном) введе­нии должна быть 2-4 млн. ЭИД50/мл, а при пероральном применении 10-20 млн. ЭИД50/мл с выпаиванием 2 дня подряд. Э.Ф. Токарик и соавт. рекомендовали свой способ профилактики НБ, суть которого со­стоит в том, что цыплят в суточном возрасте иммунизируют вакциной из шт. La-Sota вдозе 20-40 ЭИД5о/на голову. После вакцинации цыплятам с кормом вводили пробиотик Авилакт-1К в суточной дозе 0,5 - 1,5% от массы корма 2-мя циклами по 7-15 дн. с перерывом 15-12 дн. Использование пробиотика Авилакт-lK повышал антигенность вируса La Sota, усиливал иммунный ответ и устраняет нежелательное действие материнских AT при иммунизации су­точных цыплят. Экспериментальное обоснование эффективной дозы вакцины и перевод её дозировки с объёмных единиц в количественные (ЭИД50) проведено во ВНИТИБП. Для цыплят 15-20-сут возраста эффективная защитная доза (защита 80-100%) при интраназальной вакцинации составляет 103-106 ЭИД50 при титрах анти-ГА 1:8-1:512. Для цыплят 5-сут. возраста, имевших материнские AT, эффективная доза составляет 10б,3  ЭИД50.В опытах с использованием для заражения цыплят как 100 ЛД50, так и 2-106 ЛД50 вирулентного штамма вируса НБ показано, что применение вакцины в дозах 1-106-5-106 ЭИД5о обеспечивало защиту как 5, так и 20-сут. цыплят. Динамика накопления анти-ГА и устойчивости птицы следующая: на 4-й день титр анти-ГА составлял 1:8-1:16, степень за­щиты - 70%; на 6-й день - титр - 1:32, защита -90%; на 8-й день титр - 1:32-1:64, защита 100%; на 14-й день титр - 1:64-1:512,защита - 100%. Максимальное накопление анти-ГА наблюдалось через 30 дн., к 120-му дню титр их снижался до 1:8-1:4. Однако степень защи­ты через 3 мес. составляла 92-100%, через 5 мес. - 70-85%.Пассивный иммунитет у цыплят имеет прямое отношение к вирусоносительству и вирусовыделению. Так, при заражении пассивно иммунных цыплят патогенным вирусом 68% из них не проявляли признаков болезни в течение 80 дн. наблюдения, но выделяли вирус в те­чение 45дн., а вирусоносительство наблюдалось 54 дня. Этот факт имеет большое эпизоотологическое значение при проведении мероприятий по санации хозяйств от НБ.Во ВНИИВВиМ разработана новая технология ассоциированной вирус-вакцины против ИЛТ и НБ. Она позволяет получать вакцины для аэрогенного применения с активностью 7 lg ЭИД50 /см3 по вирусу ИЛТ и 7,2-7,7 lg ЭИД50 /см3по НБ; для интраназального и орально­го применения - по ИЛТ не ниже 7,0 lgЭИД50 /см3, по НБ не ниже 9,0 lg ЭИД50 /см3. После двукратной вакцинации в оптимальных дозах иммунитет формируется у 85-100% птиц и со­храняется около 6мес.На основе мезогенного шт. ГАМ-61[А(в)ВН], выделенного из эпизоотического и затем аттенуированного в культуре клеток почек теленка и КЭ, разработана новая вакцина. После испытания в лабораторных и камеральных условиях установлено, что штамм обладает вы­сокой иммуногенностью: обеспечивает защиту 97-100% птицы, привитой различными спо­собами; безвреден в 10-и 100-кратной дозе для цыплят моложе 60-дн возраста, кроме того, его можно использовать в хозяйствах с острой эпизоотической ситуацией Иммунитет на­ступает через 72-96ч. Высокая эффективность вакцины подтверждена на 8-миллионном по­головье птиц в стационарно неблагополучных хозяйствах Ставропольского и Краснодарско­го краев. Авто­рами изучен механизм формирования ранней невосприимчивости экспериментально инфи­цированных цыплят, привитых вакциной из шт. ГАМ-61. Результаты опытов показали, что в механизме формирования ранней невосприимчиво­сти к вирусу НБ ведущая роль принадлежит факторам клеточного иммунитета. Защитное влияние гуморальных AT проявляется значительно позже, и в течение первых 3-5сут. не в полной мере отражает истинный иммунологический статус организма.Аэрозольная вакцинация эффективна и безопасна только в стадах, благополучных по респираторным заболеваниям вирусной или бактериальной природы. В противном случае она провоцирует проявление ИЛТ, микоплазмоза и других болезнейПрименение инактивированных вакцин. Инактивированные вакцины обычно при­меняют в сочетании с живыми. Хороший защитный эффект получали, если однодневных цыплят прививали живой вакциной, а через 3 и 8 нед. -инактивированной.Предложено одновременное применение живых и убитых вирусов НБ для вакцинации суточных цыплят с низким уровнем материнских AT. В качестве живой вакцины использо­вали лентогенный шт. La Sota, а в качестве инактивированной - формолвакцину, содержа­щую неионизированный детергент твин-80 в виде водно-масляной эмульсии с низким со­держанием минерального масла. Живую вакцину вводили в глазнично-носовую область, а инактивированную –подкожно. Титры специфических AT у цыплят, привитых живой вакци­ной медленно возрастали в период с 28-го по 73-й день, в то время как уровень AT у цыплят второй группы, привитых одновременно живой и инактивированной вакцинами, был по­стоянен. Разовая одновременная вакцинация в инкубационном зале обеспечивает стойкий иммунитет на весь период откорма бройлеров и позволяет исключить ревакцинацию. Инактивированные вакцины готовят из вируса, размноженного в КЭ. Активность одной дозы вакцины обычно не менее 8 lg ЭИД50/см3 инактивированного вируса. Концентрация его оказывает существенное влияние на титр сывороточных AT. В качестве инактивантов вируса НБ используют формальдегид, р-пропиолактон, этиленимин. Хорошими адъювантными свойствами обладал авридин. Вакцина с авридином не вызывала реакций на месте введения. Помимо того, инактивированную эмульгированную вакцину типа "вода в масле" готовили с помощью р-пропиолактона и в качестве эмульгатора использовали арлацел и твин-80. Кур прививали в возрасте 8 нед., когда полностью исчезали материнские AT. Вакцину вводят 2-3 раза с 4-нед. интервалом. Подкожное введение оказалось более эффек­тивным, чем внутримышечное. Максимальные титры сывороточных анти-ГА составляли 1:1280-1:2560. AT сохранялись в течение 30 или 35 нед. соответственно после 2- и 3-кратной вакцинации. Напряженный иммунитет сохранялся свыше года. При хранении вакцины с адъювантом при 4°С более 18 мес. ее эффективность не снижалась. При однократной вакци­нации кур в возрасте 16 нед. титр AT начинал снижаться через 12 нед.Вакцина против НБ оказалась эффективной против парамиксовируса птиц типа 3, вызы­вающего снижение продуктивности у индеек. Хороший иммунитет создавала вакцина из го­мологичного вируса, вводимая двукратно. Вакцина из парамиксовируса-3 защищала птицу от вируса НБ, но не наоборот, т.е. имеет место одностороннее АГ родство.Оценка поствакцинального иммунитета. Эффективность вакцинации зависит от им-муногенности вакцинного штамма, наличия пассивного иммунитета, возраста цыплят, дозы и метода введения вакцины, соблюдения сроков между прививками, техники вакцинации, очередности применения более или менее аттенуированных штаммов, физиологического со­стояния организма птицы и пр. Поэтому схемы и методы вакцинации должны разрабаты­ваться для конкретных хозяйств исходя из эпизоотической ситуации. При проведении профилактической вакцинации необходимо добиваться создания 100%-ного напряженного им­мунитета у птицы всех возрастных групп. Этого можно достигнуть в том случае, если в хо­зяйстве хорошо организована система контроля поствакцинального иммунитета. Эффективность вакцинации против НБ можно оценивать двумя способами: биопробой и определением титра анти-ГА. Во втором способе исследуют сыворотки в РГГА. Для этого через 12-15 дн. после вакцинации берут кровь от 25 цыплят из 5-6 точек каждого птичника. Напряженность иммунитета проверяют также за несколько дней перед следующей вакцина­цией. В угрожаемых и бывших неблагополучных хозяйствах напряженность иммунитета у взрослой птицы проверяют через каждые 60 дн. Вакцинацию считают эффективной, если в более 80% проб исследуемой сыворотки крови цыплят в возрасте до 30 дн. AT выявляли в разведениях 1:8 и выше, у молодняка до 20дн. - 1:16и выше, у взрослых кур - 1:64 и выше, меньшие титры AT служат показателем необходимости ревакцинации птицы. Анти-ГА появляются на7-10-й день после вакцинации; титр их достигает максимально­го уровня 1:256-1:2048 к 25-30-му дню. Через 60 дн. после вакцинации титры AT снижаются (1:8-1:256), а через 5-6 мес. остаются только их следы. Через 2 мес. После вакцинации у 99,5-100% исследованных желтков яиц титры AT выше 1:8. Выявлена четкая корреляция титров в сыворотке крови и пульпе пера в отношении материнских AT, так и в отношении активно выработанных AT на 60-96-й дн. После вакцинации. Если после ревакцинации уровень сероконверсии равен 1,2 и более, то иммунизация проведена качественно и своевременно, если он ниже 1,2 или отрицательный, то прививка птицы была сделана без учета титра пассивных или высокого титра активных AT. Случаи низкой сероконверсии или слабой напряженности иммунитета после первичной вакцинации отмечают при недостаточном АГ-раздражении (заниженной прививной дозе), иммунизации птицы с высоким титромAT, сближении срока ревакцинации и частых АГ раздражении (многократные вакцинации за короткий промежуток времени), нарушении гигиены кормле­ния и содержания, острых инфекционных болезнях или влиянии других иммунодепрессивных факторов. Высокий уровень AT и сохранение его в течение года и более после однократной имму­низации вирусвакцинами из штаммов Bl, La Sota, F, Br или инактивированной ГОА-вакциной свидетельствует о циркуляции среди птиц полевоговируса НБ.Необходимо обратить внимание на недостаточное АГ раздражение при оральном при­менении вакцины. Однократное выпаивание препарата в рекомендуемых дозах индуцирует выработку специфических AT только у 20-70% птиц, а применение его 2 дня подряд, как правило, обеспечивает устойчивость к вирулентному вирусу у 80-100%.Генно-инженерные вакцины. Сконструирован рекомбинант вируса оспы птиц, экспрессирующий ГА-нейраминидазный протеин вируса НБ. Рекомбинант обладал выражен­ными защитными свойствами - птица, иммунизированная внутримышечно, после одной прививки через 28 сут выдерживала заражение вирулентным вирусом. Для получения рекомбинантной живой вакцины ген слияния Авируса НБ клонировали под контролем про­мотора Р75 в вакцинный штамм ВЧП по CoitySpel. Был отобран один рекомбинант fp EFF2, у которого ген F был выявлен в концевых повторах геномной ДНК. Считается что данная векторная система может быть использована для получения генно-инженерной мультивалентной вакцины, экспрессирующей гены таких патогенных для птиц вирусов как ИБ, БМ, ИЛТ, ИББ.  

www.webvet.ru

Смотрите также

• 
  Индекс эпидемиологической эффективности вакцины
• Нии вакцин и прививок
• 
  Вакцина чумная живая ev
• 
  Рецепт на вакцину образец
• 
  Вакцина против хламидиоза крс
• 
  Введение вакцин по безредко
• 
  Вакцина от кокцидиоза кроликов
• 
  Акдс вакцина побочные эффекты
• 
  Бивалентная вакцина против полиомиелита
• 
  Вакцина от рака куба
• 
  Вакцина от опоясывающего лишая