Addgene: Protocol – Как инокулировать бактериальную культуру

Справочная информация

Плазмиды могут нести один или несколько генов устойчивости к антибиотикам, которые придают бактериям, несущим их, устойчивость к определенному антибиотику. Наличие гена устойчивости к антибиотикам на плазмиде позволяет исследователям легко изолировать бактерии, содержащие эту плазмиду, от бактерий, которые ее не содержат, путем искусственного отбора (т.е. выращивания бактерий в присутствии антибиотика).

Бульон Луриа (LB) — это богатая питательными веществами среда, обычно используемая для культивирования бактерий в лаборатории. Чашки с агаром LB часто используются для выделения отдельных (клональных) колоний бактерий, несущих определенную плазмиду. Однако жидкая культура способна поддерживать более высокую плотность бактерий и используется для выращивания достаточного количества бактерий, необходимого для выделения достаточного количества плазмидной ДНК для экспериментального использования. Следующий протокол предназначен для инокуляции ночной культуры жидкого LB бактериями.

Видео

Посмотрите видео с протоколом ниже, чтобы узнать, как инокулировать бактерии в жидкую культуру.

Протокол

1. Приготовьте жидкий LB. Например, чтобы приготовить 400 мл LB, взвесьте следующее в стеклянной бутылке объемом 500 мл:

   • 4 г NaCl
   • 4 г триптона
   • 2 г дрожжевого экстракта

   • и dH ₂ О до 400 мл

   Примечание: Если в вашей лаборатории есть предварительно смешанный порошок агара LB, используйте рекомендуемое количество вместо других сухих ингредиентов, указанных выше.

   Среда без роста (вверху) и с ростом (внизу)

   Неплотно закройте крышку флакона (НЕ закрывайте полностью, иначе флакон может взорваться!), а затем неплотно накройте всю верхнюю часть флакона алюминиевой фольгой. Автоклавируйте и дайте остыть до комнатной температуры. Теперь завинтите верхнюю часть бутылки и храните LB при комнатной температуре.

2. Когда вы будете готовы выращивать свою культуру, добавьте жидкий LB в пробирку или колбу и добавьте соответствующий антибиотик до нужной концентрации (см. таблицу ниже).

   Примечание: Если вы собираетесь провести мини-препарат, вам обычно нужно начать с 2 мл в пробирке Falcon, но для более крупных препаратов вы можете использовать до литра LB в 2-литровой пробирке Эрленмейера. колба.

3. С помощью стерильного наконечника пипетки или зубочистки выберите одну колонию из чашки с агаром LB.

4. Опустите кончик или зубочистку в жидкость LB + антибиотик и взболтайте.

5. Неплотно накройте культуру стерильной алюминиевой фольгой или негерметичным колпачком.

6. Бактериальная культура инкубируется при 37°C в течение 12-18 часов в инкубаторе с встряхиванием.

   Примечание: Некоторые плазмиды или штаммы требуют выращивания при 30°C. Если это так, вам, вероятно, придется выращивать в течение более длительного времени, чтобы получить правильную плотность бактерий, поскольку они будут расти медленнее при более низких температурах.

7. После инкубации проверьте рост, который характеризуется мутным помутнением в среде (см. справа).

   Примечание: Некоторые протоколы требуют, чтобы бактерии находились в логарифмической фазе роста. Ознакомьтесь с инструкциями для вашего конкретного протокола и проведите OD600, чтобы измерить плотность вашей культуры, если это необходимо.

   Примечание: Хорошим отрицательным контролем является среда LB + антибиотик без инокулированных бактерий. Вы не должны увидеть рост в этой культуре после инкубации в течение ночи.

8. (дополнительно) Для длительного хранения бактерий вы можете приступить к созданию запаса глицерина.

9. Теперь вы можете выделить свою плазмидную ДНК из бактериальной культуры, выполнив раздел «Выделение вашей плазмидной ДНК».

Концентрации антибиотиков

Советы и часто задаваемые вопросы

• В чем разница между высококопийными и низкокопийными плазмидами?

  Число копий относится к числу копий отдельной плазмиды в одной бактериальной клетке. Большие плазмиды обычно имеют небольшое количество копий (примерно одна или две копии на клетку), и их необходимо выращивать в течение более длительного периода времени (примерно 18-30 часов). С другой стороны, более мелкие плазмиды могут присутствовать в большом количестве, 50 или более на клетку, и иметь большое число копий. Плазмиды с высоким числом копий необходимо выращивать в среднем только в течение 12-16 часов. Определенные особенности плазмиды могут сделать ее низкокопийной независимо от размера плазмиды. См. информационную страницу плазмиды, чтобы определить, является ли ваша плазмида высокой или низкой копией.

• У меня не было роста после ночной инкубации. Что пошло не так?

  Попробуйте выращивать культуру дольше. Некоторые бактериальные культуры растут медленнее. Кроме того, бактерии, инкубированные при температуре 30°C, а не 37°C, часто требуют более длительного времени инкубации.

  Дважды проверьте, соответствует ли антибиотик в вашей среде LB устойчивости к антибиотику на вашей плазмиде.

  Если бактерии на ваших чашках с агаром LB несвежие, перед выращиванием в жидкой культуре вам следует нанести их штрихами на новую чашку с агаром LB.

  Больше аэрации может помочь увеличить плотность культуры. Обычно культуры встряхивают со скоростью 150–250 об/мин, увеличьте скорость до 350–400 об/мин, чтобы получить более высокую плотность клеток.

Справочная страница   | Топ   | Индекс

Петля для посева стерильная, 1 мкл, 0,9 мм, 100 x 10 | Аппликаторы и прививочные петли | Аксессуары для культур тканей | Микробиология, клеточная культура, стерилизация | Лабораторное оборудование | Carl Roth

От ROTH SELECTION

Стерильные продукты

Материал: полистирол. Стерильный

Версия

10 мкл
Иголка
1 мкл

Ø Внутренний

0,9 мм

Длина

227 мм

Упак.

индивидуальный
100 х 10
40 х 25

Петли прививки гладкие и гибкие, что позволяет проводить прививку четкими полосами. Иглы позволяют собирать колонии и засевать их во все типы питательных сред.

Информация о продукте

€102,15/Кол-во в упаковке

искл. НДС. | 1000 единиц в упаковке.

Арт. №
EA88.1

В наличии

Доставка быстрая, простая и надежная!

от 6 шт. в упаковке
97,04 €/Кол-во в упаковке.

от 24 шт. в упаковке.
€91,94/Кол-во в упаковке.

Добавить в корзину

Показать список сравнения

Материал: полистирол. Стерильный

Петли для посева гладкие и гибкие, что позволяет проводить посев четкими штрихами. Иглы позволяют собирать колонии и засевать их во все типы питательных сред.

Петля для прививки стерильная

Не является медицинским изделием/не продуктом для диагностики in vitro

Техническая информация

Версия

Бланк заказа

Добавить в корзину

Петля для посева стерильная

Выбранное количество:

0

Добавить в корзину

1. Итого:
   0,00

		Арт. №	Версия	Ø Внутренний	Длина	Пакет.	Кол-во в упаковке.	Цена	Количество
		АЕЛ0.1	1 мкл	0,9 мм	227 мм	индивидуальный	250 шт.	€121,50 €121,50
		AEL1.1	10 мкл	3,9 мм	227 мм	индивидуальный	250 шт.	€121,50 €121,50
		AEL2.1	Игла		227 мм	индивидуальный	250 шт.	€123,65 €123,65
		EA88.1	1 мкл	0,9 мм	227 мм	100 х 10	1000 шт.	€102,15 €102,15
		EA89.1	1 мкл	0,9 мм	227 мм	40 х 25	1000 шт.	€87,00 €87,00
		EA90. 1	10 мкл	3,9 мм	227 мм	100 х 10	1000 шт.	€102,15 €102,15
		EA91.1	10 мкл	3,9 мм	227 мм	40 х 25	1000 шт.	€87,00 €87,00
		EA92.1	Игла		227 мм	100 х 10	1000 шт.	€107,00 €107,00
		EA93. About admin