Прививка в 1: Национальный календарь профилактических прививок

Addgene: Protocol – Как инокулировать бактериальную культуру


Справочная информация

Плазмиды могут нести один или несколько генов устойчивости к антибиотикам, которые придают бактериям, несущим их, устойчивость к определенному антибиотику. Наличие гена устойчивости к антибиотикам на плазмиде позволяет исследователям легко изолировать бактерии, содержащие эту плазмиду, от бактерий, которые ее не содержат, путем искусственного отбора (т.е. выращивания бактерий в присутствии антибиотика).

Бульон Луриа (LB) — это богатая питательными веществами среда, обычно используемая для культивирования бактерий в лаборатории. Чашки с агаром LB часто используются для выделения отдельных (клональных) колоний бактерий, несущих определенную плазмиду. Однако жидкая культура способна поддерживать более высокую плотность бактерий и используется для выращивания достаточного количества бактерий, необходимого для выделения достаточного количества плазмидной ДНК для экспериментального использования. Следующий протокол предназначен для инокуляции ночной культуры жидкого LB бактериями.

Видео

Посмотрите видео с протоколом ниже, чтобы узнать, как инокулировать бактерии в жидкую культуру.

Протокол

  1. Приготовьте жидкий LB. Например, чтобы приготовить 400 мл LB, взвесьте следующее в стеклянной бутылке объемом 500 мл:

    • 4 г NaCl
    • 4 г триптона
    • 2 г дрожжевого экстракта
    • и dH 2 О до 400 мл

    Примечание: Если в вашей лаборатории есть предварительно смешанный порошок агара LB, используйте рекомендуемое количество вместо других сухих ингредиентов, указанных выше.

    Среда без роста (вверху) и с ростом (внизу)

    Неплотно закройте крышку флакона (НЕ закрывайте полностью, иначе флакон может взорваться!), а затем неплотно накройте всю верхнюю часть флакона алюминиевой фольгой. Автоклавируйте и дайте остыть до комнатной температуры. Теперь завинтите верхнюю часть бутылки и храните LB при комнатной температуре.

  2. Когда вы будете готовы выращивать свою культуру, добавьте жидкий LB в пробирку или колбу и добавьте соответствующий антибиотик до нужной концентрации (см. таблицу ниже).

    Примечание: Если вы собираетесь провести мини-препарат, вам обычно нужно начать с 2 мл в пробирке Falcon, но для более крупных препаратов вы можете использовать до литра LB в 2-литровой пробирке Эрленмейера. колба.

  3. С помощью стерильного наконечника пипетки или зубочистки выберите одну колонию из чашки с агаром LB.

  4. Опустите кончик или зубочистку в жидкость LB + антибиотик и взболтайте.

  5. Неплотно накройте культуру стерильной алюминиевой фольгой или негерметичным колпачком.

  6. Бактериальная культура инкубируется при 37°C в течение 12-18 часов в инкубаторе с встряхиванием.

    Примечание: Некоторые плазмиды или штаммы требуют выращивания при 30°C. Если это так, вам, вероятно, придется выращивать в течение более длительного времени, чтобы получить правильную плотность бактерий, поскольку они будут расти медленнее при более низких температурах.

  7. После инкубации проверьте рост, который характеризуется мутным помутнением в среде (см. справа).

    Примечание: Некоторые протоколы требуют, чтобы бактерии находились в логарифмической фазе роста. Ознакомьтесь с инструкциями для вашего конкретного протокола и проведите OD600, чтобы измерить плотность вашей культуры, если это необходимо.

    Примечание: Хорошим отрицательным контролем является среда LB + антибиотик без инокулированных бактерий. Вы не должны увидеть рост в этой культуре после инкубации в течение ночи.

  8. (дополнительно) Для длительного хранения бактерий вы можете приступить к созданию запаса глицерина.

  9. Теперь вы можете выделить свою плазмидную ДНК из бактериальной культуры, выполнив раздел «Выделение вашей плазмидной ДНК».

Концентрации антибиотиков

Обычно используемые антибиотики Рекомендуемая концентрация
Ампициллин 100 мкг/мл
Блеоцин 5 мкг/мл
Карбенициллин 100 мкг/мл
Хлорамфеникол 25 мкг/мл
Кумермицин 25 мкг/мл
Гентамицин 10 мкг/мл
Канамицин 50 мкг/мл
Спектиномицин 50 мкг/мл
Тетрациклин 10 мкг/мл

Советы и часто задаваемые вопросы

  • В чем разница между высококопийными и низкокопийными плазмидами?

    Число копий относится к числу копий отдельной плазмиды в одной бактериальной клетке. Большие плазмиды обычно имеют небольшое количество копий (примерно одна или две копии на клетку), и их необходимо выращивать в течение более длительного периода времени (примерно 18-30 часов). С другой стороны, более мелкие плазмиды могут присутствовать в большом количестве, 50 или более на клетку, и иметь большое число копий. Плазмиды с высоким числом копий необходимо выращивать в среднем только в течение 12-16 часов. Определенные особенности плазмиды могут сделать ее низкокопийной независимо от размера плазмиды. См. информационную страницу плазмиды, чтобы определить, является ли ваша плазмида высокой или низкой копией.

  • У меня не было роста после ночной инкубации. Что пошло не так?

    Попробуйте выращивать культуру дольше. Некоторые бактериальные культуры растут медленнее. Кроме того, бактерии, инкубированные при температуре 30°C, а не 37°C, часто требуют более длительного времени инкубации.

    Дважды проверьте, соответствует ли антибиотик в вашей среде LB устойчивости к антибиотику на вашей плазмиде.

    Если бактерии на ваших чашках с агаром LB несвежие, перед выращиванием в жидкой культуре вам следует нанести их штрихами на новую чашку с агаром LB.

    Больше аэрации может помочь увеличить плотность культуры. Обычно культуры встряхивают со скоростью 150–250 об/мин, увеличьте скорость до 350–400 об/мин, чтобы получить более высокую плотность клеток.

Справочная страница   | Топ   | Индекс

Петля для посева стерильная, 1 мкл, 0,9 мм, 100 x 10 | Аппликаторы и прививочные петли | Аксессуары для культур тканей | Микробиология, клеточная культура, стерилизация | Лабораторное оборудование | Carl Roth

От ROTH SELECTION

Стерильные продукты

Материал: полистирол. Стерильный

Версия

10 мкл
Иголка
1 мкл

Ø Внутренний

0,9 мм

Длина

227 мм

Упак.

индивидуальный
100 х 10
40 х 25

Петли прививки гладкие и гибкие, что позволяет проводить прививку четкими полосами. Иглы позволяют собирать колонии и засевать их во все типы питательных сред.

Информация о продукте

€102,15/Кол-во в упаковке

искл. НДС. | 1000 единиц в упаковке.

Арт. №
EA88.1

В наличии

Доставка быстрая, простая и надежная!

от 6 шт. в упаковке
97,04 €/Кол-во в упаковке.

от 24 шт. в упаковке.
€91,94/Кол-во в упаковке.

Добавить в корзину

Показать список сравнения

Материал: полистирол. Стерильный

Петли для посева гладкие и гибкие, что позволяет проводить посев четкими штрихами. Иглы позволяют собирать колонии и засевать их во все типы питательных сред.

Петля для прививки стерильная

Не является медицинским изделием/не продуктом для диагностики in vitro

Техническая информация

Версия

1 мкл
Цвет синий
Ø Внутренний 0,9 мм
Длина 227 мм
Упак. 100 х 10

Бланк заказа

Добавить в корзину

Петля для посева стерильная

Выбранное количество:

0

    Добавить в корзину

  1. Итого:
    0,00
Арт. № Версия Ø Внутренний Длина Пакет. Кол-во в упаковке. Цена Количество
АЕЛ0.1 1 мкл 0,9 мм 227 мм индивидуальный 250 шт.

€121,50

€121,50

AEL1.1 10 мкл 3,9 мм 227 мм индивидуальный 250 шт.

€121,50

€121,50

AEL2.1 Игла 227 мм индивидуальный 250 шт.

€123,65

€123,65

EA88.1 1 мкл 0,9 мм 227 мм 100 х 10 1000 шт.

€102,15

€102,15

EA89.1 1 мкл 0,9 мм 227 мм 40 х 25 1000 шт.

€87,00

€87,00

EA90. 1 10 мкл 3,9 мм 227 мм 100 х 10 1000 шт.

€102,15

€102,15

EA91.1 10 мкл 3,9 мм 227 мм 40 х 25 1000 шт.

€87,00

€87,00

EA92.1 Игла 227 мм 100 х 10 1000 шт.

€107,00

€107,00

EA93.

About admin