Содержание
Addgene: Protocol – Как инокулировать бактериальную культуру
Справочная информация
Плазмиды могут нести один или несколько генов устойчивости к антибиотикам, которые придают бактериям, несущим их, устойчивость к определенному антибиотику. Наличие гена устойчивости к антибиотикам на плазмиде позволяет исследователям легко изолировать бактерии, содержащие эту плазмиду, от бактерий, которые ее не содержат, путем искусственного отбора (т.е. выращивания бактерий в присутствии антибиотика).
Бульон Луриа (LB) — это богатая питательными веществами среда, обычно используемая для культивирования бактерий в лаборатории. Чашки с агаром LB часто используются для выделения отдельных (клональных) колоний бактерий, несущих определенную плазмиду. Однако жидкая культура способна поддерживать более высокую плотность бактерий и используется для выращивания достаточного количества бактерий, необходимого для выделения достаточного количества плазмидной ДНК для экспериментального использования. Следующий протокол предназначен для инокуляции ночной культуры жидкого LB бактериями.
Видео
Посмотрите видео с протоколом ниже, чтобы узнать, как инокулировать бактерии в жидкую культуру.
Протокол
Приготовьте жидкий LB. Например, чтобы приготовить 400 мл LB, взвесьте следующее в стеклянной бутылке объемом 500 мл:
- 4 г NaCl
- 4 г триптона
- 2 г дрожжевого экстракта
и dH 2 О до 400 мл
Примечание: Если в вашей лаборатории есть предварительно смешанный порошок агара LB, используйте рекомендуемое количество вместо других сухих ингредиентов, указанных выше.
Среда без роста (вверху) и с ростом (внизу)
Неплотно закройте крышку флакона (НЕ закрывайте полностью, иначе флакон может взорваться!), а затем неплотно накройте всю верхнюю часть флакона алюминиевой фольгой.
Автоклавируйте и дайте остыть до комнатной температуры. Теперь завинтите верхнюю часть бутылки и храните LB при комнатной температуре.
Когда вы будете готовы выращивать свою культуру, добавьте жидкий LB в пробирку или колбу и добавьте соответствующий антибиотик до нужной концентрации (см. таблицу ниже).
Примечание: Если вы собираетесь провести мини-препарат, вам обычно нужно начать с 2 мл в пробирке Falcon, но для более крупных препаратов вы можете использовать до литра LB в 2-литровой пробирке Эрленмейера. колба.
С помощью стерильного наконечника пипетки или зубочистки выберите одну колонию из чашки с агаром LB.
Опустите кончик или зубочистку в жидкость LB + антибиотик и взболтайте.
Неплотно накройте культуру стерильной алюминиевой фольгой или негерметичным колпачком.
Бактериальная культура инкубируется при 37°C в течение 12-18 часов в инкубаторе с встряхиванием.
Примечание: Некоторые плазмиды или штаммы требуют выращивания при 30°C. Если это так, вам, вероятно, придется выращивать в течение более длительного времени, чтобы получить правильную плотность бактерий, поскольку они будут расти медленнее при более низких температурах.
После инкубации проверьте рост, который характеризуется мутным помутнением в среде (см. справа).
Примечание: Некоторые протоколы требуют, чтобы бактерии находились в логарифмической фазе роста. Ознакомьтесь с инструкциями для вашего конкретного протокола и проведите OD600, чтобы измерить плотность вашей культуры, если это необходимо.
Примечание: Хорошим отрицательным контролем является среда LB + антибиотик без инокулированных бактерий. Вы не должны увидеть рост в этой культуре после инкубации в течение ночи.
(дополнительно) Для длительного хранения бактерий вы можете приступить к созданию запаса глицерина.
Теперь вы можете выделить свою плазмидную ДНК из бактериальной культуры, выполнив раздел «Выделение вашей плазмидной ДНК».
Концентрации антибиотиков
Обычно используемые антибиотики | Рекомендуемая концентрация |
---|---|
Ампициллин | 100 мкг/мл |
Блеоцин | 5 мкг/мл |
Карбенициллин | 100 мкг/мл |
Хлорамфеникол | 25 мкг/мл |
Кумермицин | 25 мкг/мл |
Гентамицин | 10 мкг/мл |
Канамицин | 50 мкг/мл |
Спектиномицин | 50 мкг/мл |
Тетрациклин | 10 мкг/мл |
Советы и часто задаваемые вопросы
В чем разница между высококопийными и низкокопийными плазмидами?
Число копий относится к числу копий отдельной плазмиды в одной бактериальной клетке.
Большие плазмиды обычно имеют небольшое количество копий (примерно одна или две копии на клетку), и их необходимо выращивать в течение более длительного периода времени (примерно 18-30 часов). С другой стороны, более мелкие плазмиды могут присутствовать в большом количестве, 50 или более на клетку, и иметь большое число копий. Плазмиды с высоким числом копий необходимо выращивать в среднем только в течение 12-16 часов. Определенные особенности плазмиды могут сделать ее низкокопийной независимо от размера плазмиды. См. информационную страницу плазмиды, чтобы определить, является ли ваша плазмида высокой или низкой копией.
У меня не было роста после ночной инкубации. Что пошло не так?
Попробуйте выращивать культуру дольше. Некоторые бактериальные культуры растут медленнее. Кроме того, бактерии, инкубированные при температуре 30°C, а не 37°C, часто требуют более длительного времени инкубации.
Дважды проверьте, соответствует ли антибиотик в вашей среде LB устойчивости к антибиотику на вашей плазмиде.
Если бактерии на ваших чашках с агаром LB несвежие, перед выращиванием в жидкой культуре вам следует нанести их штрихами на новую чашку с агаром LB.
Больше аэрации может помочь увеличить плотность культуры. Обычно культуры встряхивают со скоростью 150–250 об/мин, увеличьте скорость до 350–400 об/мин, чтобы получить более высокую плотность клеток.
Справочная страница | Топ | Индекс
Петля для посева стерильная, 1 мкл, 0,9 мм, 100 x 10 | Аппликаторы и прививочные петли | Аксессуары для культур тканей | Микробиология, клеточная культура, стерилизация | Лабораторное оборудование | Carl Roth
От ROTH SELECTION
Стерильные продукты
Материал: полистирол. Стерильный
Версия
10 мкл
Иголка
1 мкл
Ø Внутренний
0,9 мм
Длина
227 мм
Упак.
индивидуальный
100 х 10
40 х 25
Петли прививки гладкие и гибкие, что позволяет проводить прививку четкими полосами. Иглы позволяют собирать колонии и засевать их во все типы питательных сред.
Информация о продукте
€102,15/Кол-во в упаковке
искл. НДС. | 1000 единиц в упаковке.
Арт. №
EA88.1
В наличии
Доставка быстрая, простая и надежная!
от 6 шт. в упаковке
97,04 €/Кол-во в упаковке.
от 24 шт. в упаковке.
€91,94/Кол-во в упаковке.
Добавить в корзину
Показать список сравнения
Материал: полистирол. Стерильный
Петли для посева гладкие и гибкие, что позволяет проводить посев четкими штрихами. Иглы позволяют собирать колонии и засевать их во все типы питательных сред.
Петля для прививки стерильная
Не является медицинским изделием/не продуктом для диагностики in vitro
Техническая информация
1 мкл | |
Цвет | синий |
Ø Внутренний | 0,9 мм |
Длина | 227 мм |
Упак. | 100 х 10 |
Бланк заказа
Добавить в корзину
Петля для посева стерильная
Выбранное количество:
0
- Итого:
0,00
Добавить в корзину
Арт. № | Версия | Ø Внутренний | Длина | Пакет.![]() | Кол-во в упаковке. | Цена | Количество | ||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
АЕЛ0.1 | 1 мкл | 0,9 мм | 227 мм | индивидуальный | 250 шт. | €121,50 €121,50 | |||
AEL1.1 | 10 мкл | 3,9 мм | 227 мм | индивидуальный | 250 шт. | €121,50 €121,50 | |||
AEL2.1 | Игла | 227 мм | индивидуальный | 250 шт.![]() | €123,65 €123,65 | ||||
EA88.1 | 1 мкл | 0,9 мм | 227 мм | 100 х 10 | 1000 шт. | €102,15 €102,15 | |||
EA89.1 | 1 мкл | 0,9 мм | 227 мм | 40 х 25 | 1000 шт. | €87,00 €87,00 | |||
EA90.![]() | 10 мкл | 3,9 мм | 227 мм | 100 х 10 | 1000 шт. | €102,15 €102,15 | |||
EA91.1 | 10 мкл | 3,9 мм | 227 мм | 40 х 25 | 1000 шт. | €87,00 €87,00 | |||
EA92.1 | Игла | 227 мм | 100 х 10 | 1000 шт. | €107,00 €107,00 | ||||
EA93.![]() |