язвенную болезнь желудка (в 70% случаев) и двенадцатиперстной кишки (в 90% случаев)
хеликобактериоз
pак желудка
лимфому желудка
Заражены 70% населения, каждый третий!
Постоянное присутствие бактерии в желудке сопровождается следующими симптомами:
боль в области желудка после еды или перед приемом пищи
периодическая тошнота и даже рвота
чувство тяжести в желудке
изжога и привкус кислого во рту
неприятный запах изо рта
вздутие кишечника
Данные симптомы не просто снижают качество жизни, заставляют принимать длительное время медикаменты, но и могут привести к раку желудка!
Хеликобактер пилори способна «запускать» и другие заболевания, которые на первый взгляд не связаны с желудком — местом постоянного обитания бактерии. Например, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура — тяжелое заболевание со снижением числа тромбоцитов в крови и высокой вероятностью кровотечения.
Поэтому правильная диагностика текущей инфекции H.pylori крайне важна!
Преимущества
высокая специфичность и чувствительность (до 100%)
подтверждает наличие текущей инфекции
Недостатки
процедура эндоскопии дискомфортна для пациента
высокая стоимость и малодоступность
качество и количество полученного материала зависят от навыков гастроэнтеролога, мест взятия ткани
время и условия транспортировки материала в лабораторию влияют на результат
длительное время получения результата (несколько дней)
возможны осложнения — кровотечения из мест биопсии, особенно при лечении препаратами ацетилсалициловой кислоты, варфарина
противопоказан при циррозе печени, хронической почечной недостаточности, сахарном диабете, сердечной недостаточности, заболеваниях системы крови
Показания
диагностика острой хеликобактерной инфекции
определить чувствительность возбудителя к антибактериальным препаратам при безуспешности проведенного ранее лечения и подбора наиболее эффективного лечения хеликобактерной инфекции
Подготовка
за 2 недели до не принимать препараты висмута (Де-Нол, Улькавис), ингибиторы протоновой помпы (омепразол, пантопразол, лансопразол), антибиотики (любые)
за 48 часов не принимать блокаторы h3-гистаминовых рецепторов (фамотидин, ранитидин), за 12 часов — антациды
не пить алкоголь за 3 дня и не курить за 8 часов до исследования
в клинику необходимо прийти в утренние часы, натщесерце — после 8 часов без пищи, разрешено пить воду не позднее 1 часа до эндоскопии
Выполнение
Для получения материала проводят фиброгастроскопию — пациент глотает зонд. Во время осмотра слизистой оболочки желудка и 12-ти перстной кишки врач специальными щипцами берет несколько (не менее 5-ти) образцов ткани, каждый из которых помещают в стерильную пробирку с транспортной средой и отправляют в лабораторию. Дальнейшие исследования проводятся в микробиологической лаборатории.
селективные и неселективные питательные среды содержащие кровь (7-10%), циклодекстрин B или яичный желток
Хеликобактер пилори растет на питательных средах медленно — 3-6 дней (до 12-ти). На 7% лизированном кровяном агаре колонии мелкие — 0,5-2 мм, круглые, без гемолиза, полупрозрачные с легким желтоватым оттенком. На кровяном агаре полупрозрачные с бледно-серым оттенком от 0,5 до 1 мм.
Микроскопия колоний H.pylori:
в очень молодых культурах H. pylori выглядят как практически прямые палочки
спустя 3-5 дней инкубации бактерии становятся плеоморфными, неправильной изогнутой формы, некоторые U-образны
в старых культурах приобретает дегенеративную коккоидную форму, плохо окрашивается по Грамму
Подтверждает принадлежность к виду хеликобактер пилори резко положительная реакция на уреазу (++++) и положительная на каталазу и оксидазы.
При необходимости исследуют чувствительность к антибиотикам.
Норма
в норме результат на бак посев на хеликобактер пилори отрицателен — рост H.pylori на питательных средах не выявлен
Дополнительные исследования
Бактериологическое исследование наличия хеликобактер пилори в желудке НЕ рекомендовано для первичной диагностики инфицированности H.pylori и для контроля успешности лечения!
P.S. Статья написана согласно рекомендациям по диагностике хеликобактерной инфекции — American Gastroenterology Association (AGA), the American College of Gastroenterologists (ACG), Infectious Diseases Society of America (IDSA)/the American Society for Microbiology (ASM).
Бактериологический посев на хеликобактер пилори was last modified: Ноябрь 24th, 2017 by Мария Бодян
gradusnik.net
Способ определения чувствительности helicobacter pylori к антибиотикам
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в гастроэнтерологии. Предложен способ определения чувствительности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. Проводят серию двукратных разведений антибактериальных препаратов в бульоне Шедлера с рН 7,6±0,2 в горизонтальных лунках 96-луночного планшета. Приготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, культуру инкубируют в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С. Добавляют реагент, используемый при постановке уреазного теста идентификации Helicobacter pylori. Измеряют оптическую плотность содержимого лунок планшета с помощью спектрофотометра, используя длину волны 630 нм. Минимальная подавляющая концентрация антибиотика определяется при построении графика соотношения концентрации антибиотика и оптической плотности и находится в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности. Способ обеспечивает повышение точности определения чувствительности культур Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. 2 ил., 6 табл., 2 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности медицинской микробиологии, и может быть использовано для определения чувствительности Helicobacter pylori, а также других уреазопозитивных культур к антибиотикам с целью выбора препарата для включения в схему эрадикационной терапии.
Резистентность Helicobacter pylori к антибиотикам является распространенным явлением как в России, так и во всем мире. С каждым годом наблюдается рост устойчивости штаммов данного микроорганизма к антибактериальным препаратам, входящим в состав схем эрадикационной терапии, что снижает эффективность лечения и обосновывает все возрастающую актуальность проводимых в данном направлении исследований.
Одним из путей повышения эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori, является индивидуальный подбор антибактериальных препаратов по результатам определения антибиотикочувствительности возбудителя [Оптимизация лечения заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori [Текст] / Е. Ткаченко, Ю. Успенский, Н. Барышникова // Врач. - 2012. - №1. - С. 36-38].
Уровень техники
Из уровня техники известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом двукратных серийных разведений препарата в жидких питательных средах [Поздеев О.К. Медицинская микробиология: учебное пособие / под ред. В.И. Покровского. - 4-е изд. испр. [Текст]. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - С. 177, 178].
Постановку данного способа осуществляют следующим образом. Среду разливают по 2 мл в 6÷10 пробирок. В первую пробирку добавляют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации, перемешивают, после чего переносят 2 мл в следующую пробирку, продолжая разведение до предпоследней пробирки, из которой удаляют 2 мл содержимого. Последняя пробирка - контрольная.
В каждую пробирку с соответствующим разведением антибиотика, а также в контрольную пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси культуры, приготовленной в зависимости от вида микроорганизма в концентрации 0,1÷1·109 м.кл.·см-3. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика в отношении исследуемого штамма микроорганизма определяют по последней пробирке с задержкой роста (прозрачная среда). МПК соответствует степени чувствительности микроорганизма к данному антибиотику.
Недостатками данного метода являются трудоемкость, большой расход материалов, особенно при одновременном определении чувствительности нескольких штаммов микроорганизма к различным антибактериальным препаратам, длительность анализа, а также субъективность оценки результатов опыта - результат оценивают визуально.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам [Патент РФ №2013110948/10, 12.03.2013 Способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам [Текст] /С.В. Шабунин, О.А. Манжурина, А.В. Степанов // Патент России №2529711 С1, 2013]. Определение чувствительности бактерий, вызывающих кишечные инфекции, проводят путем посева в лунки планшета, содержащие разведения антибактериальных препаратов в концентрации 10 мкг·см-3 в питательной среде с pH 7,2-7,6 ЕД. Индикатором служит 0,5%-ный раствор бромкрезолового пурпурного. Вывод о чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам проводят по наличию или отсутствию роста бактерий и изменению окраски среды с красной на желтую.
Однако данный метод адаптирован только в отношении группы кишечных бактерий (Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis и др.), которые растут на специфических селективных питательных средах, непригодных для роста Helicobacter pylori. Недостатком данного метода является также визуальная оценка результатов исследования.
Задачей изобретения является уменьшение трудоемкости, сокращение расхода материала и времени анализа с 3-5 суток до 24 часов, повышение точности определения чувствительности культур Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам путем оценки результатов с помощью спектрофотометра.
Поставленная задача решена путем внесения в лунки 96-луночного планшета бульона Шедлера, добавления в лунки первого вертикального ряда планшета антибиотиков в определенной концентрации, осуществления серий двукратных последовательных разведений каждого препарата в горизонтальных рядах планшета с последующим внесением в каждую лунку одинаковой концентрации исследуемого штамма Helicobacter pylori, инкубации содержимого в течение 24 часов при 37°C в микроаэрофильных условиях, внесения по окончанию инкубации реагента, используемого для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста, учета результата оптической плотности содержимого лунок на спектрофотометре.
Определение чувствительности к антибиотикам было проведено в отношении штаммов, находящихся в музейной коллекции кафедры микробиологии Вятского Государственного университета (г. Киров).
Для исследования, на основании анализа литературных источников [Ткач С.М. Оптимизация терапевтических стратегий лечения Helicobacter pylori на современном этапе [Текст] // Крымский терапевтический журнал. - 2009. - №2. - С. 43-48; Ивашкин В.Т. Рекомендации Российской Гастроэнтерологической Ассоциации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых. - 2012. - Т.22. - №1. - С. 87-89] были выбраны антибактериальные препараты, наиболее часто используемые в схемах эрадикационной терапии хеликобактериозов: кларитромицин, амоксициллин, доксициклин, метронидазол, ципрофлоксацин, фуразолидон.
Осуществление изобретения
Культуру Helicobacter pylori выращивают из биологического материала (биопсия слизистой желудка, биологический материал из зубодесневых карманов, кал) на селективной питательной среде - колумбийский кровяной агар с антибиотиками амфотерицином (300 мкг·л-1) и ванкомицином (300 мкг·л-1) в эксикаторе при температуре 37°С в течение 3-5 суток. После микробиологической и биохимической идентификации Helicobacter pylori [Кудрявцева Л.В. Биологические свойства Helicobacter pylori [Текст] / Альманах клинической медицины. - 2006. - Т. XIV. - С. 39-46] из выращенной культуры по стандартному образцу мутности ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ (ОСО 42-28-85П) готовят микробную взвесь с концентрацией, соответствующей 10 единицам ОСО 42-28-85П, эквивалентную 1·109 м.к.·см-3. Для разведения культуры используют 0,9% раствор натрия хлорида с pH 7,0±0,2 ЕД.
Из культуры Helicobacter pylori с концентрацией 1·109 м.к.·см-3, используя бульон Шедлера [Патент РФ №2012125394/10, 20.06.2012 Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori и способ его осуществления [Текст] / В.А. Алешкин, Г.Ш. Исаева, Е.П. Селькова, С.С. Афанасьева // Патент России №2012125394 С1, 2013 г.], готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса по 0,10 см3 суспензии клеток в 0,9·см3 бульона, получая концентрации 1·108, 1·107 м.к.·см-3. Для проверки чувствительности к антибиотикам используют суспензию клеток с концентрацией 1·107 м.к.·см-3.
В качестве питательной среды для определения чувствительности Helicobacter pylori к антибиотикам используют бульон Шелдера с pH 7,6±0,2 ЕД.
В качестве индикатора применяют реактив для постановки уреазного теста [Конорев М.Р. Методы диагностики Helicobacter pylori [Текст]/ Методические рекомендации. - Витебск, 2000. - С. 25], который готовят следующим образом:
- приготовить на дистиллированной воде 0,4 М фосфатно-солевой буфер с pH 6,7-6,8 ЕД путем смешивания заранее приготовленных солей: 0,4 М Кh3PO4 и 0,4 М К2HPO4;
- растворить 5 г мочевины и 0,02 г азида натрия в 90 см3 приготовленного по п. 1 0,4 М фосфатно-солевого буфера, получив реагент №1;
- 0,02 г фенолового красного развести в 10 см3 бидистиллированной h3O, получив 0,2% феноловый красный - реагент №2;
- 903 см реагента №1 смешать с 10 см реагента №2. Готовый раствор хранить при температуре 4°C.
Постановку способа проводят следующим образом. Один планшет рассчитан на исследование чувствительности семи культур с одним антибиотиком. В лунки стерильного 96-луночного планшета вносят по 100 мкл бульона Шедлера. Концентрацию антибиотика для внесения в первую лунку каждого горизонтального ряда определяли по результатам предварительных опытов с более широким диапазоном значений. Исходя из этого, антибиотик добавляют в первую лунку каждого горизонтального ряда планшета в концентрации 256 мг·л-1 (128 мг·л-1 или 64 мг·л-1) и титруют слева направо, перенося 100 мкл из каждой предыдущей лунки в последующую до 12 лунки, из которой 100 мкл удаляют. В каждую лунку первого горизонтального ряда вносят по 10 мкл бульона, в лунки остальных горизонтальных рядов вносят 10 мкл готовой взвеси культуры Helicobacter pylori, выделенной из биологического материала соответствующего пациента, в концентрации 1·107 м.к.·см-1, получая конечную концентрацию культуры в каждой лунке 1·106 м.к.·см-1. Схема опыта представлена в таблице 1.
Содержимое планшета закрывают крышкой и инкубируют в микроаэрофильных условиях (5% O2, 5-10% CO2, 85-90% N2) в течение 24 ч при температуре 37°C [Патент РФ №2012125394/10, 20.06.2012 Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori и способ его осуществления [Текст] / В.А. Алешкин, Г.Ш. Исаева, Е.П. Селькова, С.С. Афанасьева // Патент России №2012125394 С1, 2013 г.]. Для создания микроаэрофильных условий используют эксикатор со свечой или анаэростат с газогенераторными пакетами «GAS РАК 150» («Becton Dickinson», США). По окончании времени инкубации в каждую лунку вносят 50 мкл индикатора, используемого для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста.
Выбор времени инкубации был определен экспериментальным путем. При инкубации содержимого планшета более 24 ч (в течение 48 ч) после добавления индикатора значение оптической плотности, определяемое на спектрофотометре, превышало 1,0, что затрудняло интерпретацию результатов.
Результаты оценивают на планшетном спектрофотометре типа Multiscan ascent (Финляндия), измеряя оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 630 нм.
Принцип оценки чувствительности Helicobacter pylori к антибиотикам, входящим в схемы эрадикационной терапии с использованием мочевины и фенолового красного, заключается в следующем. Если соответствующая концентрация антибиотика не подавляет рост Helicobacter pylori, микроорганизм размножается и продуцирует уреазу. При добавлении реагента, содержащего мочевину, уреаза взаимодействует с мочевиной, при этом мочевина разлагается на углекислый газ и аммиак. Аммиак сдвигает pH среды в щелочную сторону, что сопровождается изменением цвета индикатора на розово-красный. Таким образом, чем более выражена уреазная активность микроорганизма, тем интенсивней цвет окраски содержимого лунки, что определяется по значению оптической плотности.
За минимальную подавляющую концентрацию принимают ту концентрацию антибиотика, которой соответствует первое минимальное значение оптической плотности в лунке, отличающееся от предыдущего не менее чем в 2 раза.
Микроскопия мазков, сделанных из соответствующих лунок при отработке способа, показала отсутствие в мазках микробных клеток. При высеве содержимого из таких лунок на колумбийский агар рост микроорганизма отсутствовал.
Для подтверждения правильности полученных результатов параллельно проводили определение МПК антибиотиков в отношении Helicobacter pylori с применением метода двукратных серийных разведений в пробирках. Учет результатов проводили на 3-5 сутки инкубации культур при 37°C в микроаэрофильных условиях в течение 3-5 дней. МПК в отношении исследуемого штамма определяли по концентрации антибиотика, содержащейся в последней пробирке с задержкой роста микроорганизма (прозрачный бульон). Помимо визуальной оценки проводили постановку уреазного теста с содержимым пробирок в планшетах. Для этого после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок, последовательно по мере убывания концентрации содержащегося в них антибиотика, переносили в лунки планшета, добавляли 50 мкл реагента и проводили измерение на спектрофотометре.
Результаты определения МПК исследуемых антибиотиков в отношении Helicobacter pylori при постановке метода в планшетах с использованием уреазного теста были сопоставимы с результатами, полученными при определении МПК в пробирках.
Для отрицательного контроля была использована уреазонегативная культура Escherichia coli. Определение чувствительности Escherichia coli к антибиотикам с помощью уреазного теста в планшетах не выявило закономерностей, определяемых при постановке данного теста с уреазепозитивной Helicobacter pylori.
Изобретение поясняется следующими примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Определение чувствительности штаммов Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с помощью уреазного теста
Результаты оценки чувствительности штаммов Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с помощью уреазного теста в планшетах представлены в таблице 2.
На примере оценки МПК ципрофлоксацина в отношении культуры №2 Helicobacter pylori построен график зависимости оптической плотности содержимого лунок планшета от концентрации антибиотика в лунках (рисунок 1). Значение МПК находится в точке выхода графика на «плато» - в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности.
Из данных, представленных на рисунке 1, видно, что МПК ципрофлоксацина в отношении тестируемой культуры Helicobacter pylori составляет 1 мг·л-1.
Результаты определения МПК ципрофлоксацина в отношении культур Helicobacter pylori при постановке уреазного теста в планшетах были сопоставимы с таковыми при определении МПК методом двукратных разведений ципрофлоксацина в пробирках. Учет результатов при этом проводили визуально и на планшетном спектрофотометре после инкубации содержимого пробирок в течение 5-ти суток в микроаэрофильных условиях при температуре 37°C. Для объективной оценки результата после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок переносили в лунки планшета с последующей постановкой уреазного теста и учетом данных на спектрофотометре, используя длину волны 630 нм.
В таблице 3 представлены результаты определения чувствительности культур Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с использованием различных условий постановки уреазного теста (непосредственно в планшетах через 24 ч и в планшетах при использовании содержимого пробирок после 5-ти суток инкубации).
Пример 2 - Определение чувствительности штаммов Helicobacter pylori к кларитромицину с помощью уреазного теста.
Результаты оценки чувствительности штаммов Helicobacter pylori к кларитромицину с помощью уреазного теста в планшетах представлены в таблице 5.
На примере оценки МПК кларитромицина в отношении культуры №2 Helicobacter pylori построен график зависимости оптической плотности содержимого лунок планшета от концентрации антибиотика в лунках (рисунок 2). Значение МПК находится в точке выхода графика на нулевое значение оптической плотности.
Из данных, представленных на рисунке 2, видно, что МПК кларитромицина в отношении тестируемой культуры Helicobacter pylori составляет 8 мг·л-1.
Результаты определения МПК в отношении культур Helicobacter pylori при постановке уреазного теста в планшетах были сопоставимы с таковыми при определении МПК методом двукратных разведений кларитромицина в пробирках. Учет результатов при этом проводили визуально и на планшетном спектрофотометре после инкубации содержимого пробирок в течение 5-ти суток в микроаэрофильных условиях при температуре 37°C. Для объективной оценки результата после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок переносили в лунки планшета с последующей постановкой уреазного теста и учетом данных на спектрофотометре, используя длину волны 630 нм.
В таблице 6 представлены результаты определения чувствительности культур Helicobacter pylori к кларитромицину с использованием различных условий постановки уреазного теста (непосредственно в планшетах через 24 ч и в планшетах при использовании содержимого пробирок после 5-ти суток инкубации).
Способ определения чувствительности Helicobacter pylori, заключающийся во внесении антибактериальных препаратов в лунки планшета, отличающийся тем, что в горизонтальных лунках 96-луночного планшета проводят серию двукратных разведений антибактериальных препаратов в бульоне Шедлера рН 7,6±0,2, при этом приготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, культуру инкубируют в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С, затем добавляют реагент, используемый для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста, после чего результат учитывают с помощью спектрофотометра, измеряют оптическую плотность содержимого лунок планшета, используя длину волны 630 нм, причем за минимальную подавляющую концентрацию принимают минимальное значение концентрации антибиотика в ряду его разведений, при котором наблюдается снижение оптической плотности до фонового уровня, и при построении графика соотношения концентрации антибиотика и оптической плотности данное значение минимальной подавляющей концентрации находится в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности.
www.findpatent.ru
Хеликобактер пилори: лечение, симптомы
HP — медленно растущая аэробная грамотрицательная бактерия.
.
Клетки имеют форму спирально изогнутой палочки. Инфицирование HP сопряжено с развитием гастрита, язв или рака желудка (аденокарцином) и лимфомы желудка.
Обычно инфицирование происходит в детстве. Количество инфицированных HP взрослых сильно варьирует в зависимости от возраста, района проживания и социальной группы. Передается HP только от человека к человеку.
Иногда инфицирование приводит к развитию клинической картины острого инфекционного поражения ЖКТ с инфильтрацией слизистой желудка нейтрофилами (нейтрофильным гастритом), чувством дискомфорта в эпигастральной области, тошнотой и рвотой.
У взрослых инфекционное поражение HP чаще всего носит хронический характер и сопровождается развитием поверхностного гастрита без признаков атрофии слизистой оболочки. Влияние этой патологии на секрецию кислоты и гастрина в желудке зависит от того, какой отдел этого органа поранен. Гастрит тела желудка обычно сопровождается ослаблением секреции кислоты (на фоне гипергастринемии), тогда как гастрит антрального отдела чаще всего связан с чрезмерным образованием кислоты и развитием язв в двенадцатиперстной кишке.
Со временем может развиться атрофический гастрит, что объясняет некоторую взаимосвязь между инфицированием HP и заболеванием раком желудка.
Диагностика Хеликобактер пилори
Исследования, не требующие биопсии слизистой желудка
Эти исследования включают серологическое тестирование крови, определение количества газообразных продуктов метаболизма мочевины в выдыхаемом воздухе и выявление специфических антигенов в фекальных массах. Результаты исследования слюны, соскобов со слизистой оболочки щек и мочи, как показано, надежной диагностики осуществлять не позволяют. Анализ титров антител против HP в сыворотке крови больного эффективен как диагностический прием, но не позволяет выявить факт устранения патогена, поскольку титры антител против него часто длительное время остаются на высоком уровне даже на фоне полного отсутствия ИР в организме.
Для оценки количества продуктов распада мочевины в выдыхаемом воздухе применяют С- или 3С-мочевину. Наиболее часто применяемая метка (13С) для определения кинетики выведения (длящегося несколько дней) требует масс-спектрометра. Не менее чем за 14 дней до начала исследования больному отменяют прием ингибиторов протонной помпы, за 3 дня — прием Н2-антагонистов. При правильном проведении это исследование позволяет достоверно обнаружить HP в организме больного.
Определение присутствия антигенов HP в фекальных массах характеризуется приблизительно такой же чувствительностью и специфичностью, как и оценка количества продуктов распада мочевины в выдыхаемом воздухе. Недостатком этого метода считают тот факт, что между его проведением и окончанием курса противомикробной терапии должно пройти не менее 3 мес.
Исследования, требующие получения биоптатов слизистой желудка
Для рутинной диагностики факта инфицирования HP биоптаты слизистой оболочки желудка не нужны. Однако для бактериологического исследования и оценки чувствительности к антибиотикам биопсия необходима. Выявление присутствия HP возможно и при обычном гистологическом исследовании биоптатов слизистой оболочки, но только если бактерии присутствуют там в большом количестве. Более эффективна диагностика с применением специальных методов окрашивания образцов (например, солями серебра). Если сольному в любом случае запланировано эндоскопическое обследование верхних отделов ЖКТ, в попутно полученных биоптатах слизистых оболочек можно определить удобным способом (например, с помощью быстрого уреазного теста CLO-test) активность уреазы.
Лечение Хеликобактер пилори
Лечение основано на комбинированном применении не менее двух антибиотиков и ингибиторов Н+,К+-АТФазы. Чувствительность патогена к антибиотикам предварительно обычно не оценивают, так что количество случаев неэффективной терапии вследствие резистентности микроорганизма неизвестно.
На начальном этапе терапии больной в течение 7 дней получает два различных антибиотика и один из ингибиторов Н+,К+-АТФазы. Если воздействие оказывается неэффективным, антибиотики заменяют на другие, а продолжительность курса увеличивают до 10-14 дней. Иногда комплексную терапию дополняют солями висмута (либо в форме субцитрата, либо в форме субсалицилата).
Выбор антибиотиков
Большинство штаммов HP чувствительно к амоксициллину. Устойчивость к этому антибиотику встречают редко, но для проявления активности следует применять амоксициллин на фоне подавления желудочной секреции. Обычно эффективен также и тетрациклин. В западных странах устойчивость к нему у HP встречают очень редко. Но этот препарат противопоказан детям.
Использование при терапии инфицирования HF метронидазола чаще всего успешно, но в урбанизированных регионах регистрируют случаи устойчивости.
Устойчивость к кларитромицину отмечают в 15% случаев инфицирования HP. Применение других препаратов. Показано, что HP восприимчив к действию фура-золидона. Но этот препарат не применяют в качестве первоочередного средства при устранении инфицирования данным патогеном.
Обследование после эрадикации Helicobacter pylori
Хотя обычно дополнительного обследования больному не проводят, рецидив инфекции у больных с язвами желудка или двенадцатиперстной кишки может привести к рецидиву язвы. Поэтому у больных с осложнившейся (кровотечением или перфорацией) язвенной болезнью после эрадикации перед отменой подавляющих секрецию препаратов обязательна верификация факта полного отсутствия HP в организме.
Самым надежным методом верификации отсутствия HP в организме служит определение продуктов метаболизма мочевины в выдыхаемом воздухе.
www.sweli.ru
Хеликобактер - лечение
Лечение от бактерий хеликобактер включает все схемы лечения пептических язв и гастрита. Основная цель – это не только временное облегчение симптомов, но и полное уничтожение очагов инфекции H. pylori. Пациенты с активной язвой двенадцатиперстной кишки или желудка и с язвенной астмой должны быть обследованы на H. pylori. Соответствующую терапию следует назначать для ликвидации очагов инфекции.
Продолжение ниже ⇓
Пациентам с лимфомой MALT также должны сдавать анализы и проходить лечение от хеликобактер, так как ликвидация очагов инфекции вызывает ремиссию у многих пациентов, если опухоль ограничена желудком. Несколько консенсусных конференций, включая Маастрихтский консенсус-отчет, рекомендуют тестировать и лечить другие группы пациентов, но доказательства пользы пока ограничены.
Это относится к пациентам с аденокарциномой желудка (особенно на ранней стадии заболевания), с кишечной метаплазией или атрофическим гастритом, а также к родственникам первой степени пациентов с аденокарциномой желудка, поскольку у родственников повышен риск развития онкозаболевания желудка частично из-за внутрисемейной передачи H. pylori. На сегодняшний день остается спорным вопрос, следует ли сдавать анализы и лечиться всем пациентам с функциональной диспепсией, гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью или другими расстройствами, не связанными с ЖКТ, а также бессимптомным лицам.
Содержание
Устойчивость к антибиотикам
Видео о лечении от хеликобактер
Схемы лечения от хеликобактер
Адъювантная терапия
История
Исследования
Устойчивость к антибиотикам
Успех лечения зависит от типа и продолжительности курса, соблюдения режима пациентом и бактериальных факторов, таких как устойчивость к антибиотикам. Пациенты чаще всего не реагируют на начальный курс лечения от хеликобактер из-за нарушения режима или устойчивости к антибиотикам. Они должны сообщать врачу о любых побочных эффектах, пропущенных дозах и завершении терапии. Так как анализ культуры с чувствительностью к антибиотикам не проводится регулярно при выявлении инфекции H. pylori, обычно рекомендуется назначать разные антибиотики в более высоких дозах на протяжении 14 дней.
Видео о лечении от хеликобактер
Схемы лечения от хеликобактер
Достижение оптимальной ликвидации H. pyloriоказалось трудным делом. Для достижения адекватных показателей и уменьшения процента неудачных исходов из-за устойчивости к антибиотикам необходимы комбинированные схемы, в которых используются 2 или 3 антибиотика с ингибитором протонного насоса или висмутом. Например, в США до 50% штаммов устойчивы к метронидазолу и 13% устойчивы к кларитромицину. В настоящее время эксперты расходятся во мнениях относительно оптимальной схемы лечения.
Трехкомпонентная терапия (первой линии)
В регионах с низкой устойчивостью к кларитромицину в качестве терапии первой линии рекомендован 14-дневный курс. Он включает пероральный прием ингибитора протонного насоса, кларитромицина 500 мг и амоксициллина 1 г (или, если аллергия на пенициллин, метронидазола 500 мг) 2 р. в день. Этот режим позволяет достичь нужных показателей только в 70% случаев.
Четырехкомпонентная терапия (второй линии)
14-дневный курс четырехкомпонентной терапии с включанием ингибитора протонного насоса, висмута, тетрациклина и метронидазола или тинидазола представляет собой более сложный, но более эффективный режим. В рандомизированном контролируемом исследовании 2011 г. показатели ликвидации очагов инфекции составили 93% при четырехкомпонентной и 70% при трехкомпонентной схеме лечения.
Четырехкомпонентная терапия с использованием висмута рекомендована в следующих случаях:
Как терапия первой линии для пациентов в регионах с повышенной устойчивостью к кларитромицину (>20%) или тех, которые ранее прошли лечение макролидными антибиотиками.
Как терапия второй линии у пациентов, у которых инфекция сохраняется после начального курса трехкомпонентной терапии.
В нескольких исследованиях сообщалось об уровне ликвидации >90% при использовании 10-дневного последовательного режима, состоящего из 4 препаратов: ингибитор протонного насоса, амоксициллин (5 дней) затем ингибитор протонного насоса, кларитромицин и тинидазол (5 дней). Тем не менее, последующие исследования подтвердили эквивалентную или высокую эффективность, когда все 4 препарата вводились одновременно на протяжении 10 дней (четырехкомпонентный курс без использования висмута).
Последовательная терапия
Эта схема представляет собой новый подход, который сочетает 5-дневный двухкомпонентный курс с использованием ИПП в сочетании с амоксициллином с последовательным вторым 5-дневным стандартным трехкомпонентным курсом.
Первоначальные исследования были многообещающими, но недавно исследователи выявили более низкие показатели ликвидации при последовательном лечении. Метаанализ 2013 г. также не показал превосходства по сравнению с 14-дневной трехкомпонентной схемой или курсом на основе висмута, за исключением пациентов с микроорганизмами, проявляющими устойчивость к кларитромицину.
Совсем недавно в крупном многоцентровом европейском контролируемом исследовании, проведенном в регионах с повышенной устойчивостью к кларитромицину, сообщалось о 92% ликвидации при 14-дневном курсе, состоящем из ИПП, амоксициллина, кларитромицина и нитроимидазола.
Другие предлагаемые схемы
Было предложено несколько других схем лечения от хеликобактер. В приведенной ниже таблице они сравниваются со стандартными вариантами лечения.
Сравнение схем лечения от хеликобактер
Режим
Длительность курса, дни
Используемые препараты
Примечания
Трёхкомпонентная терапия
7-14
ИПП (в стандартной дозировке) 2 р./д.,
амоксициллин 1000 мг 2 р./д.,
кларитромицин 500 мг 2 р./д.
Первоочередное лечение в регионах с низкой устойчивостью к кларитромицину
Последовательная терапия
10
Дни 1-5: ИПП (с в стандартной дозировке) 2 р./д., амоксициллин 1000 мг 2 р./д.
Дни 2-5: кларитромицин 500 мг 2 р./д., метронидазол 500 мг 2 р./д.
В последних метаанализах были предложены два варианта адъювантного режима, которые могут помочь в лечении хеликобактер. Перидонтальная терапия или то, что известно как удаление зубного камня и выравнивание поверхности корней зуба, и пробиотики, должны быть исследованы дополнительно для подтверждения их адъювантной роли.
Роль перидонтальной терапии
Систематический обзор 2016 г. показал, что перидонтальная терапия может играть роль дополнительного лечения для краткосрочного и долгосрочного наблюдения. Чтобы эти результаты были подтверждены в отношении искоренения и предупреждения рецидивов, необходимы более масштабные исследования.
Роль пробиотиков
В некоторых исследованиях оценивалась роль Saccharomyces boulardii в качестве коадъютанта при уничтожении H. pylori и в профилактике вторичных эффектов лечения антибиотиками. Мета-анализ показал, что добавление S. boulardii значительно увеличивало скорость ликвидации H.pylori и уменьшало риск общих связанных побочных эффектов.
В когорте пациентов в Корее, получавших S. boulardii в течение 4 недель во время и после 1-недельного курса стандартной трехкомпонентной терапии, уровень ликвидации был на 10% выше, чем у тех, кто не получал добавку. Другие исследования, в которых вводились Bifidobacterium spp. и Lactobacillus acidophilus, не выявили значимой разницы в показателях ликвидации у пациентов, инфицированных штаммами, восприимчивыми к обоим антибиотикам и получавших стандартную трехкомпонентную терапию. Для выяснения конкретной роли пробиотиков в лечении необходимы дальнейшие исследования.
История
Один из первых «протоколов ликвидации», если не первый, использовали Дж. Робин Уоррен и Б. Маршалл. Маршалл лечил свой гастрит, который развился после преднамеренного поглощения культуры H.pylori. Он использовал соль висмута и метронидазол. Это лечение оказалось эффективным в борьбе с гастритом и устранило инфекцию H.pylori. Сейчас этот протокол не используется.
Одним из первых «современных» протоколов ликвидации была недельная трехкомпонентная терапия, которую в 1987 г. разработал гастроэнтеролог из Сиднея Томас Бороди. С 2006 г. стандартный вариант включает амоксициллин, кларитромицин и ИПП, например, эзомепразол, омепразол, лансопразол или пантопразол. Также использовались протоколы с метронидазолом.
Пример комбинации с фиксированными дозами – это PantoPac, содержащий пантопразол, кларитромицин и амоксициллин.
Исследования
Введение ацетилцистеина перед лечением антибиотиками было эффективным в преодолении устойчивости к антибиотикам H. pylori в исследовании с участием 40 пациентов, которые до этого подверглись неудачному лечению, как минимум, 4 раза.
способ определения чувствительности helicobacter pylori к антибиотикам - патент РФ 2588469
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в гастроэнтерологии. Предложен способ определения чувствительности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. Проводят серию двукратных разведений антибактериальных препаратов в бульоне Шедлера с рН 7,6±0,2 в горизонтальных лунках 96-луночного планшета. Приготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, культуру инкубируют в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С. Добавляют реагент, используемый при постановке уреазного теста идентификации Helicobacter pylori. Измеряют оптическую плотность содержимого лунок планшета с помощью спектрофотометра, используя длину волны 630 нм. Минимальная подавляющая концентрация антибиотика определяется при построении графика соотношения концентрации антибиотика и оптической плотности и находится в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности. Способ обеспечивает повышение точности определения чувствительности культур Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. 2 ил., 6 табл., 2 пр.
Рисунки к патенту РФ 2588469
Изобретение относится к медицине, в частности медицинской микробиологии, и может быть использовано для определения чувствительности Helicobacter pylori, а также других уреазопозитивных культур к антибиотикам с целью выбора препарата для включения в схему эрадикационной терапии.
Резистентность Helicobacter pylori к антибиотикам является распространенным явлением как в России, так и во всем мире. С каждым годом наблюдается рост устойчивости штаммов данного микроорганизма к антибактериальным препаратам, входящим в состав схем эрадикационной терапии, что снижает эффективность лечения и обосновывает все возрастающую актуальность проводимых в данном направлении исследований.
Одним из путей повышения эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori, является индивидуальный подбор антибактериальных препаратов по результатам определения антибиотикочувствительности возбудителя [Оптимизация лечения заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori [Текст] / Е. Ткаченко, Ю. Успенский, Н. Барышникова // Врач. - 2012. - № 1. - С. 36-38].
Уровень техники
Из уровня техники известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом двукратных серийных разведений препарата в жидких питательных средах [Поздеев О.К. Медицинская микробиология: учебное пособие / под ред. В.И. Покровского. - 4-е изд. испр. [Текст]. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - С. 177, 178].
Постановку данного способа осуществляют следующим образом. Среду разливают по 2 мл в 6÷10 пробирок. В первую пробирку добавляют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации, перемешивают, после чего переносят 2 мл в следующую пробирку, продолжая разведение до предпоследней пробирки, из которой удаляют 2 мл содержимого. Последняя пробирка - контрольная.
В каждую пробирку с соответствующим разведением антибиотика, а также в контрольную пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси культуры, приготовленной в зависимости от вида микроорганизма в концентрации 0,1÷1·109 м.кл.·см-3. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика в отношении исследуемого штамма микроорганизма определяют по последней пробирке с задержкой роста (прозрачная среда). МПК соответствует степени чувствительности микроорганизма к данному антибиотику.
Недостатками данного метода являются трудоемкость, большой расход материалов, особенно при одновременном определении чувствительности нескольких штаммов микроорганизма к различным антибактериальным препаратам, длительность анализа, а также субъективность оценки результатов опыта - результат оценивают визуально.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам [Патент РФ № 2013110948/10, 12.03.2013 Способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам [Текст] /С.В. Шабунин, О.А. Манжурина, А.В. Степанов // Патент России № 2529711 С1, 2013]. Определение чувствительности бактерий, вызывающих кишечные инфекции, проводят путем посева в лунки планшета, содержащие разведения антибактериальных препаратов в концентрации 10 мкг·см-3 в питательной среде с pH 7,2-7,6 ЕД. Индикатором служит 0,5%-ный раствор бромкрезолового пурпурного. Вывод о чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам проводят по наличию или отсутствию роста бактерий и изменению окраски среды с красной на желтую.
Однако данный метод адаптирован только в отношении группы кишечных бактерий (Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis и др.), которые растут на специфических селективных питательных средах, непригодных для роста Helicobacter pylori. Недостатком данного метода является также визуальная оценка результатов исследования.
Задачей изобретения является уменьшение трудоемкости, сокращение расхода материала и времени анализа с 3-5 суток до 24 часов, повышение точности определения чувствительности культур Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам путем оценки результатов с помощью спектрофотометра.
Поставленная задача решена путем внесения в лунки 96-луночного планшета бульона Шедлера, добавления в лунки первого вертикального ряда планшета антибиотиков в определенной концентрации, осуществления серий двукратных последовательных разведений каждого препарата в горизонтальных рядах планшета с последующим внесением в каждую лунку одинаковой концентрации исследуемого штамма Helicobacter pylori, инкубации содержимого в течение 24 часов при 37°C в микроаэрофильных условиях, внесения по окончанию инкубации реагента, используемого для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста, учета результата оптической плотности содержимого лунок на спектрофотометре.
Определение чувствительности к антибиотикам было проведено в отношении штаммов, находящихся в музейной коллекции кафедры микробиологии Вятского Государственного университета (г. Киров).
Для исследования, на основании анализа литературных источников [Ткач С.М. Оптимизация терапевтических стратегий лечения Helicobacter pylori на современном этапе [Текст] // Крымский терапевтический журнал. - 2009. - № 2. - С. 43-48; Ивашкин В.Т. Рекомендации Российской Гастроэнтерологической Ассоциации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых. - 2012. - Т.22. - № 1. - С. 87-89] были выбраны антибактериальные препараты, наиболее часто используемые в схемах эрадикационной терапии хеликобактериозов: кларитромицин, амоксициллин, доксициклин, метронидазол, ципрофлоксацин, фуразолидон.
Осуществление изобретения
Культуру Helicobacter pylori выращивают из биологического материала (биопсия слизистой желудка, биологический материал из зубодесневых карманов, кал) на селективной питательной среде - колумбийский кровяной агар с антибиотиками амфотерицином (300 мкг·л -1) и ванкомицином (300 мкг·л-1) в эксикаторе при температуре 37°С в течение 3-5 суток. После микробиологической и биохимической идентификации Helicobacter pylori [Кудрявцева Л.В. Биологические свойства Helicobacter pylori [Текст] / Альманах клинической медицины. - 2006. - Т. XIV. - С. 39-46] из выращенной культуры по стандартному образцу мутности ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ (ОСО 42-28-85П) готовят микробную взвесь с концентрацией, соответствующей 10 единицам ОСО 42-28-85П, эквивалентную 1·10 9 м.к.·см-3. Для разведения культуры используют 0,9% раствор натрия хлорида с pH 7,0±0,2 ЕД.
Из культуры Helicobacter pylori с концентрацией 1·10 9 м.к.·см-3, используя бульон Шедлера [Патент РФ № 2012125394/10, 20.06.2012 Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori и способ его осуществления [Текст] / В.А. Алешкин, Г.Ш. Исаева, Е.П. Селькова, С.С. Афанасьева // Патент России № 2012125394 С1, 2013 г.], готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса по 0,10 см3 суспензии клеток в 0,9·см3 бульона, получая концентрации 1·108, 1·107 м.к.·см -3. Для проверки чувствительности к антибиотикам используют суспензию клеток с концентрацией 1·107 м.к.·см -3.
В качестве питательной среды для определения чувствительности Helicobacter pylori к антибиотикам используют бульон Шелдера с pH 7,6±0,2 ЕД.
В качестве индикатора применяют реактив для постановки уреазного теста [Конорев М.Р. Методы диагностики Helicobacter pylori [Текст]/ Методические рекомендации. - Витебск, 2000. - С. 25], который готовят следующим образом:
- приготовить на дистиллированной воде 0,4 М фосфатно-солевой буфер с pH 6,7-6,8 ЕД путем смешивания заранее приготовленных солей: 0,4 М Кh3PO4 и 0,4 М К2HPO4;
- растворить 5 г мочевины и 0,02 г азида натрия в 90 см3 приготовленного по п. 1 0,4 М фосфатно-солевого буфера, получив реагент № 1;
- 0,02 г фенолового красного развести в 10 см3 бидистиллированной h3O, получив 0,2% феноловый красный - реагент № 2;
- 903 см реагента № 1 смешать с 10 см реагента № 2. Готовый раствор хранить при температуре 4°C.
Постановку способа проводят следующим образом. Один планшет рассчитан на исследование чувствительности семи культур с одним антибиотиком. В лунки стерильного 96-луночного планшета вносят по 100 мкл бульона Шедлера. Концентрацию антибиотика для внесения в первую лунку каждого горизонтального ряда определяли по результатам предварительных опытов с более широким диапазоном значений. Исходя из этого, антибиотик добавляют в первую лунку каждого горизонтального ряда планшета в концентрации 256 мг·л -1 (128 мг·л-1 или 64 мг·л-1 ) и титруют слева направо, перенося 100 мкл из каждой предыдущей лунки в последующую до 12 лунки, из которой 100 мкл удаляют. В каждую лунку первого горизонтального ряда вносят по 10 мкл бульона, в лунки остальных горизонтальных рядов вносят 10 мкл готовой взвеси культуры Helicobacter pylori, выделенной из биологического материала соответствующего пациента, в концентрации 1·10 7 м.к.·см-1, получая конечную концентрацию культуры в каждой лунке 1·106 м.к.·см -1. Схема опыта представлена в таблице 1.
Содержимое планшета закрывают крышкой и инкубируют в микроаэрофильных условиях (5% O2, 5-10% CO2, 85-90% N 2) в течение 24 ч при температуре 37°C [Патент РФ № 2012125394/10, 20.06.2012 Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori и способ его осуществления [Текст] / В.А. Алешкин, Г.Ш. Исаева, Е.П. Селькова, С.С. Афанасьева // Патент России № 2012125394 С1, 2013 г.]. Для создания микроаэрофильных условий используют эксикатор со свечой или анаэростат с газогенераторными пакетами «GAS РАК 150» («Becton Dickinson», США). По окончании времени инкубации в каждую лунку вносят 50 мкл индикатора, используемого для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста.
Выбор времени инкубации был определен экспериментальным путем. При инкубации содержимого планшета более 24 ч (в течение 48 ч) после добавления индикатора значение оптической плотности, определяемое на спектрофотометре, превышало 1,0, что затрудняло интерпретацию результатов.
Результаты оценивают на планшетном спектрофотометре типа Multiscan ascent (Финляндия), измеряя оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 630 нм.
Принцип оценки чувствительности Helicobacter pylori к антибиотикам, входящим в схемы эрадикационной терапии с использованием мочевины и фенолового красного, заключается в следующем. Если соответствующая концентрация антибиотика не подавляет рост Helicobacter pylori, микроорганизм размножается и продуцирует уреазу. При добавлении реагента, содержащего мочевину, уреаза взаимодействует с мочевиной, при этом мочевина разлагается на углекислый газ и аммиак. Аммиак сдвигает pH среды в щелочную сторону, что сопровождается изменением цвета индикатора на розово-красный. Таким образом, чем более выражена уреазная активность микроорганизма, тем интенсивней цвет окраски содержимого лунки, что определяется по значению оптической плотности.
За минимальную подавляющую концентрацию принимают ту концентрацию антибиотика, которой соответствует первое минимальное значение оптической плотности в лунке, отличающееся от предыдущего не менее чем в 2 раза.
Микроскопия мазков, сделанных из соответствующих лунок при отработке способа, показала отсутствие в мазках микробных клеток. При высеве содержимого из таких лунок на колумбийский агар рост микроорганизма отсутствовал.
Для подтверждения правильности полученных результатов параллельно проводили определение МПК антибиотиков в отношении Helicobacter pylori с применением метода двукратных серийных разведений в пробирках. Учет результатов проводили на 3-5 сутки инкубации культур при 37°C в микроаэрофильных условиях в течение 3-5 дней. МПК в отношении исследуемого штамма определяли по концентрации антибиотика, содержащейся в последней пробирке с задержкой роста микроорганизма (прозрачный бульон). Помимо визуальной оценки проводили постановку уреазного теста с содержимым пробирок в планшетах. Для этого после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок, последовательно по мере убывания концентрации содержащегося в них антибиотика, переносили в лунки планшета, добавляли 50 мкл реагента и проводили измерение на спектрофотометре.
Результаты определения МПК исследуемых антибиотиков в отношении Helicobacter pylori при постановке метода в планшетах с использованием уреазного теста были сопоставимы с результатами, полученными при определении МПК в пробирках.
Для отрицательного контроля была использована уреазонегативная культура Escherichia coli. Определение чувствительности Escherichia coli к антибиотикам с помощью уреазного теста в планшетах не выявило закономерностей, определяемых при постановке данного теста с уреазепозитивной Helicobacter pylori.
Изобретение поясняется следующими примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Определение чувствительности штаммов Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с помощью уреазного теста
Результаты оценки чувствительности штаммов Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с помощью уреазного теста в планшетах представлены в таблице 2.
На примере оценки МПК ципрофлоксацина в отношении культуры № 2 Helicobacter pylori построен график зависимости оптической плотности содержимого лунок планшета от концентрации антибиотика в лунках (рисунок 1). Значение МПК находится в точке выхода графика на «плато» - в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности.
Из данных, представленных на рисунке 1, видно, что МПК ципрофлоксацина в отношении тестируемой культуры Helicobacter pylori составляет 1 мг·л-1 .
Результаты определения МПК ципрофлоксацина в отношении культур Helicobacter pylori при постановке уреазного теста в планшетах были сопоставимы с таковыми при определении МПК методом двукратных разведений ципрофлоксацина в пробирках. Учет результатов при этом проводили визуально и на планшетном спектрофотометре после инкубации содержимого пробирок в течение 5-ти суток в микроаэрофильных условиях при температуре 37°C. Для объективной оценки результата после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок переносили в лунки планшета с последующей постановкой уреазного теста и учетом данных на спектрофотометре, используя длину волны 630 нм.
В таблице 3 представлены результаты определения чувствительности культур Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с использованием различных условий постановки уреазного теста (непосредственно в планшетах через 24 ч и в планшетах при использовании содержимого пробирок после 5-ти суток инкубации).
Пример 2 - Определение чувствительности штаммов Helicobacter pylori к кларитромицину с помощью уреазного теста.
Результаты оценки чувствительности штаммов Helicobacter pylori к кларитромицину с помощью уреазного теста в планшетах представлены в таблице 5.
На примере оценки МПК кларитромицина в отношении культуры № 2 Helicobacter pylori построен график зависимости оптической плотности содержимого лунок планшета от концентрации антибиотика в лунках (рисунок 2). Значение МПК находится в точке выхода графика на нулевое значение оптической плотности.
Из данных, представленных на рисунке 2, видно, что МПК кларитромицина в отношении тестируемой культуры Helicobacter pylori составляет 8 мг·л-1.
Результаты определения МПК в отношении культур Helicobacter pylori при постановке уреазного теста в планшетах были сопоставимы с таковыми при определении МПК методом двукратных разведений кларитромицина в пробирках. Учет результатов при этом проводили визуально и на планшетном спектрофотометре после инкубации содержимого пробирок в течение 5-ти суток в микроаэрофильных условиях при температуре 37°C. Для объективной оценки результата после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок переносили в лунки планшета с последующей постановкой уреазного теста и учетом данных на спектрофотометре, используя длину волны 630 нм.
В таблице 6 представлены результаты определения чувствительности культур Helicobacter pylori к кларитромицину с использованием различных условий постановки уреазного теста (непосредственно в планшетах через 24 ч и в планшетах при использовании содержимого пробирок после 5-ти суток инкубации).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ определения чувствительности Helicobacter pylori, заключающийся во внесении антибактериальных препаратов в лунки планшета, отличающийся тем, что в горизонтальных лунках 96-луночного планшета проводят серию двукратных разведений антибактериальных препаратов в бульоне Шедлера рН 7,6±0,2, при этом приготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, культуру инкубируют в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С, затем добавляют реагент, используемый для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста, после чего результат учитывают с помощью спектрофотометра, измеряют оптическую плотность содержимого лунок планшета, используя длину волны 630 нм, причем за минимальную подавляющую концентрацию принимают минимальное значение концентрации антибиотика в ряду его разведений, при котором наблюдается снижение оптической плотности до фонового уровня, и при построении графика соотношения концентрации антибиотика и оптической плотности данное значение минимальной подавляющей концентрации находится в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности.
Лечение от бактерий хеликобактер включает все схемы лечения пептических язв и гастрита. Основная цель – это не только временное облегчение симптомов, но и полное уничтожение очагов инфекции H. pylori. Пациенты с активной язвой двенадцатиперстной кишки или желудка и с язвенной астмой должны быть обследованы на H. pylori. Соответствующую терапию следует назначать для ликвидации очагов инфекции.
